楊海超 黃煒 韓曉東

唐山市工人醫(yī)院，河北 唐山 063000

老年骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率隨著世界人口的老齡化而逐漸增加。由于高昂的醫(yī)療費用、高風(fēng)險殘疾率、與死亡風(fēng)險增加密切相關(guān)[1]，老年骨質(zhì)疏松性骨折已成為一個重要的公共衛(wèi)生問題。然而，有關(guān)老年性骨量流失的病理生理分子機制尚不完全清楚。隨著年齡的增長，骨細胞數(shù)量明顯減少，骨細胞自噬和凋亡增加[2]。自噬是一種進化保守的生理過程，是生存、分化、發(fā)育和細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)所必需的[3]。自噬的基礎(chǔ)水平作為一種重要的細胞垃圾處理機制，通過去除功能異常的細胞器和錯誤折疊的蛋白質(zhì)來維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[4]。此外，隨著年齡的增長，骨細胞的自噬功能減弱可能與老年骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[4]。最近有研究[5]表明，自噬是骨細胞抵抗糖皮質(zhì)激素有害影響的主要保護機制。近年來的研究[6]表明抗氧化劑可以通過改變體內(nèi)的自噬水平減少骨質(zhì)疏松大鼠骨量的流失。隨著年齡的增長，骨細胞自噬的失敗可能是老年性骨質(zhì)疏松發(fā)生的原因之一，因此改變自噬水平可能成為治療老年性骨質(zhì)疏松的治療靶點。本研究的目的是探討抗氧化劑維生素E對老年雌性大鼠骨密度、骨代謝和自噬水平影響。

1 材料和方法

1.1 材料

選取3月齡雌性Sprague-Dawley大鼠10只、體重230～250 g作為對照組；另選取24月齡雌性Sprague-Dawley大鼠20只，體重487～532 g，均購于上海實驗動物中心。大鼠飼養(yǎng)在室溫(23±2)℃環(huán)境下，12/12 h光暗循環(huán)，喂食標準大鼠飼料和水。將老年大鼠隨機分為模型組(n=10)和治療組(n=10)。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 方法

1.2.1維生素E治療：將3 g維生素E (Sigma，USA) 溶解在50 mL橄欖油(Bertolli，Lucca，意大利)中，以獲得60 mg/kg劑量的溶液[7]，治療組給予大鼠每天60 mg/kg維生素E灌胃治療。本研究中使用的維生素E含有162.2 mg/g α-生育酚，167.1 mg/g α-生育三烯醇，35.4 mg/g β-生育三烯醇，266.2 mg/g γ-生育三烯醇和90.7 mg/g δ-生育三烯醇，劑量表現(xiàn)出對骨量保護作用[7]；大鼠每天60 mg/kg的劑量相當于體重60 kg的人每天攝入583 mg維生素E。其它組的大鼠給予同樣劑量的橄欖油治療。治療12周后，在禁食12 h后對大鼠實施安樂死，獲取血液和雙側(cè)股骨標本。本研究得到醫(yī)院倫理委員會批準(201922344)。

1.2.2Micro-CT和HE染色評估:通過Micro-CT(SkyScan 1176，Bruker-microCT，Kontich，Belgium)檢測大鼠股骨的骨小梁微觀結(jié)構(gòu)。對于所有測試，掃描條件保持相同(分辨率：18 mm;源電壓:65 kV;源電流:385 μA;旋轉(zhuǎn)步驟:0.7)。每組選取8只大鼠用于Micro-CT測量。在這些區(qū)域中，骨小梁由股骨干骺端內(nèi)側(cè)的皮質(zhì)骨內(nèi)部限定，且骨小梁區(qū)域定義為距離股骨干骺端的生長板約(0.5±2.0)mm。Micro-CT系統(tǒng)中的軟件用于分析骨小梁微觀結(jié)構(gòu)的參數(shù)，如骨密度(BMD)、骨體積/總體積(BV / TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)(Tb.N)和骨小梁分離度(Tb.Sp)。隨后對股骨進行組織學(xué)檢測，骨組織在10 % EDTA溶液中脫鈣4～6周，此溶液每周更換一次。待脫鈣滿意后將骨組織浸入乙醇中脫水(70 %過夜，然后濃度分別為80 %、85 %、90 %和95 %，持續(xù)2 h，終濃度為100 %)。然后將樣品用二甲苯酚處理并包埋于石蠟中。用蘇木精和伊紅對4 μm厚股骨干骺端切片進行染色。使用配備有Leica DFC310FX數(shù)碼相機的Leica DM4000B光學(xué)顯微鏡進行觀察和分析。

1.2.3血清學(xué)檢測：在處死大鼠前通過心臟穿刺采集血樣。血樣在3 000 r/min，4 ℃下離心15 min，獲得血清標本。血清骨鈣素(OC)水平使用市售的ELISA試劑盒(Takara，Co，Ltd.)檢測。采用TRAPTM酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(ELISA,IDS，Tyne&Ware，UK)檢測骨吸收標志物抗酒石酸酸性磷酸酶5b (TRACP-5b)的水平。所有檢測程序均按照檢測試劑盒的制造商協(xié)議執(zhí)行。

1.2.4蛋白質(zhì)印跡分析：將新鮮股骨在液氮中冷凍并在RIPA緩沖液[10 mmol/L Tris(pH 7.4)，150 mmol/L NaCl，0.5%NP-40,0.1%SDS，0.1%脫氧膽酸鹽，1 mmol/L PMSF和2 mmol/L氟化鈉]中均質(zhì)化，原料琥珀酸鈉，補充有蛋白酶抑制劑混合物(Sigma，St.Louis，MO，USA)和PhosSTOP磷酸酶抑制劑混合物(Roche Applied Science，Mannheim，Germany)。將含有等量蛋白質(zhì)的組織裂解物在10 %SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，將其在PBST中和一抗在4 ℃下封閉孵育過夜。在PBST中洗滌，將膜與二抗一起孵育，最后用增強的化學(xué)發(fā)光(ECL)系統(tǒng)顯現(xiàn)信號。GAPDH用作內(nèi)部對照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)果以均數(shù)±標準差表示，使用Windows版本 SPSS 22.0對進行分析。采用student’t檢驗分析兩組之間的差異。P值<0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 維生素E對大鼠骨量的影響

和對照組比較，模型組骨小梁明顯減少，骨密度明顯降低，表明老年大鼠骨流失嚴重；維生素E治療組大鼠BMD明顯高于模型組(P<0.05)。在股骨干骺端中，Micro-CT評估顯示與模型組BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp對比，治療組大鼠具有更高的BV/TV、Tb.Th、Tb.N和更低的Tb.Sp (P<0.05)。見圖1。

圖1 骨小梁Micro-CT掃描結(jié)果與定量分析結(jié)果注：A:骨小梁三維重建結(jié)果；B：BMD；C：Tb.Sp；D：Tb.Th；E：Tb.N；F：BV/TV；a：對照組；b：模型組；c：治療組；Con:對照組；Mod:模型組；Tre:治療組。與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。Fig.1 Micro CT scanning and quantitative analysis of trabecular bone

2.2 HE染色結(jié)果分析

對照組大鼠股骨干骺端可見大量骨小梁，骨小梁連接緊密且排列整齊；模型組干骺端只能見到很少量的骨小梁，骨小梁單獨存在，之間幾乎看不到連接，空白地方被大量脂肪空泡所替代；治療組骨小梁組織較對照組明顯增加，骨小梁之間連接疏松，但是較對照組明顯改善。見圖2。

圖2 各組大鼠股骨干骺端HE染色觀察結(jié)果注：A：對照組；B：模型組；C：治療組；× 10。Fig.2 HE observation results of femoral metaphysis of rats in each group

2.3 維生素E對大鼠骨代謝的影響

與對照組相比，治療組大鼠血清OC水平顯著升高(P<0.05)，TRACP-5b水平降低(P<0.05)，見圖3。

圖3 兩組大鼠血清OC和TRACP-5b水平比較注：A:OC;B:TRACP-5b；Con:對照組；Mod:模型組；Tre:治療組。與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。Fig.3 Comparison of serum OC and TRACP-5b levels in two groups of rats

2.4 維生素E對SD大鼠自噬水平的影響

Western印跡分析顯示維生素E治療組大鼠Beclin-1和Atg 5的蛋白質(zhì)表達更高。此外，維生素E還刺激LC3-II/LC3-I水平的改變(P<0.05)。同時，通過Western印跡證實維生素E處理降低了p62的表達(P<0.05)。所有結(jié)果均顯示維生素E對年齡相關(guān)自噬水平的下降有保護作用。見圖4。

圖4 WB檢測結(jié)果注：A：蛋白質(zhì)印跡定量檢測結(jié)果；B：LC3-II/LC3-I；C：Atg5；D：Beclin-1；E：p62蛋白的表達；Con:對照組；Mod:模型組；Tre:治療組。與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。Fig.4 WB test results

3 討論

本研究使用24月齡雌性大鼠作為研究模型，經(jīng)過12周維生素E的干預(yù)治療，HE和Micro-CT分析結(jié)果表明治療組大鼠的骨密度及骨微觀參數(shù)顯著優(yōu)于模型組；血清學(xué)的結(jié)果表明治療組的成骨細胞活性增加，破骨細胞活性明顯受到抑制。進一步研究產(chǎn)生這種可能性的機制，WB結(jié)果表明LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1和Atg 5的蛋白質(zhì)表達更高，p62表達顯著降低。這表明骨組織中自噬水平明顯增加，說明維生素E可以通過提高自噬水平來改善骨代謝和骨量。

選取24個月大的雌性SD大鼠作為研究模型，是因為老年雌性SD大鼠經(jīng)歷著與老年人相當?shù)墓琴|(zhì)流失。一些研究[8-9]已經(jīng)證實，老年雌性SD大鼠可以作為年齡相關(guān)性骨丟失的合適動物模型。隨著年齡的增長，骨吸收和骨形成之間的平衡受到干擾，骨吸收過多導(dǎo)致骨質(zhì)流失[9]。然而，與年齡相關(guān)骨丟失的病理生理學(xué)的分子機制尚不完全清楚。據(jù)報道[10-11]，骨細胞是響應(yīng)機械和激素刺激的骨重塑過程的主導(dǎo)者。一方面，骨細胞通過下調(diào)硬化蛋白來協(xié)調(diào)成骨細胞的形成，硬化蛋白通過激活Wnt信號傳導(dǎo)是一種有效的骨形成抑制劑[12]；另一方面，在生理和病理條件下，骨細胞通過調(diào)節(jié)破骨細胞生成的促進劑RANKL的分泌來調(diào)節(jié)破骨細胞的活性[13]。凋亡的骨細胞被認為是與年齡相關(guān)的骨丟失的主要罪魁禍首。骨細胞凋亡導(dǎo)致的骨細胞死亡作為破骨細胞的歸巢信號，從而促進局部骨吸收[14]。此外，凋亡的骨細胞能夠釋放表達RANKL的凋亡小體以募集破骨細胞[15]。因此，維持骨細胞活力的分子途徑可能成為與年齡相關(guān)骨丟失的潛在治療劑。本研究使用維生素E作為維持骨細胞活力干預(yù)手段，取得較好的療效。

骨細胞可以經(jīng)歷稱為自噬的細胞穩(wěn)態(tài)機制。自噬被認為是維持細胞活力所必需的，細胞自噬的下降可能導(dǎo)致細胞死亡。以前的研究還報道自噬是一種重要的細胞凋亡保護過程。最近，已經(jīng)證明自噬是骨細胞中一種主要的保護過程，可以抵抗糖皮質(zhì)激素的有害影響[5]。此外，在嚙齒動物中也觀察到骨細胞自噬失敗，而自體受損的遺傳小鼠模型顯示骨質(zhì)減少和骨重建類似于衰老引起的[16]。上述結(jié)果表明，細胞自噬可能是保持骨細胞活力的重要機制，從而調(diào)節(jié)骨重塑。維生素E是脂溶性維生素之一，研究[17]證實其可以增加正常雄性大鼠骨量的作用。維生素E的機制之一是它具有清除自由基和防止氧化損傷的能力[18]。本研究表明在維生素E治療的大鼠中觀察到更高的自噬水平；維生素E治療12周增加了骨細胞中特異性自噬體標志物L(fēng)C3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1和Atg 5表達。此外，維生素E還刺激了骨細胞富集的皮質(zhì)骨中的LC3轉(zhuǎn)化。此外，p62在經(jīng)維生素E治療的大鼠中顯著降低，這表明治療組的自噬活性明顯增加。因此，本研究結(jié)果支持維生素E刺激骨細胞中的自噬活性的假設(shè)。以前的研究[18]表明，維生素E不僅能夠減少破骨細胞數(shù)量，還能阻止破骨細胞的形成。所有上述觀察結(jié)果表明，維生素E可以對年齡導(dǎo)致的骨量流失產(chǎn)生潛在影響。

當然，本研究也存在一定的局限性。首先，選取24月齡的雌性大鼠，由于個體的差異，可能影響研究結(jié)果；其次，沒有使用陽性對照；最后，本研究中的維生素E只使用一種劑量，這種劑量是否為最佳劑量不得而知。

總的來說，本研究結(jié)果表明維生素E治療顯著提高了老年雌性大鼠血清骨鈣素水平、降低了TRACP-5b水平，維生素E對骨重建影響的分子機制尚不清楚，但本研究證實維生素E在老年雌性大鼠中可以起到防止與年齡相關(guān)骨丟失的功效，通過增加自噬水平來保護老年雌性大鼠的骨量。