張孝利（綜述） 余優(yōu)成（審校） 吳興文 孫 健

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院口腔科 上海 200032）

自19 世紀(jì)60年代起，瑞典的Branemark 在實(shí)驗(yàn)中偶然發(fā)現(xiàn)純鈦可以和骨組織發(fā)生緊密結(jié)合，之后他提出“骨結(jié)合”理論，為當(dāng)代口腔種植學(xué)的發(fā)展奠定基礎(chǔ)[1］。種植修復(fù)目前是牙列缺損、牙列缺失首選的修復(fù)方法?；颊咭蜓乐苎住㈤L(zhǎng)期牙缺失、全身疾病、外傷及腫瘤術(shù)后的牙槽骨缺損是種植修復(fù)的一項(xiàng)難題。充足的骨量是種植體完成骨結(jié)合并維持其長(zhǎng)期穩(wěn)定的必要條件，種植位點(diǎn)骨量嚴(yán)重不足須進(jìn)行骨增量手術(shù)[2］，因此在臨床上需要有效填補(bǔ)骨缺損的材料。目前骨移植方法有：自體骨移植、同種異體骨異種骨和人工骨移植。盡管自體骨移植是目前骨移植材料的“金標(biāo)準(zhǔn)”[3］，但它可能導(dǎo)致的并發(fā)癥（如供區(qū)發(fā)病和移植失敗等）是對(duì)大多數(shù)醫(yī)師的挑戰(zhàn)。同種異體骨移植經(jīng)過(guò)輻照或冷凍干燥處理而失活，降低了骨誘導(dǎo)性，最終可能導(dǎo)致移植失敗[3］。同時(shí)，同種異體骨的取材問(wèn)題也無(wú)法滿(mǎn)足臨床需求。

在臨床迫切需求的驅(qū)動(dòng)下，骨組織工程應(yīng)運(yùn)而生。 最近的研究表明，明膠甲基丙烯酰基（gelatin methylacryloyl，GelMA）水凝膠因其獨(dú)特的光交聯(lián)特性，可以加工成不同形貌的水凝膠支架材料。同時(shí)，因其降解性能可控，力學(xué)性能可控，生物相容性好，在骨缺損修復(fù)材料領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景，所以基于GelMA 的水凝膠在骨組織工程的應(yīng)用引起了廣泛研究。

GelMA 特點(diǎn)GelMA 是一種明膠衍生物，由Van Den Bulcke 等[4］于2000年首次合成。明膠是膠原蛋白的水解產(chǎn)物，具有溶解性好、抗原性低等優(yōu)點(diǎn)[5］。 另外明膠保持了精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）氨基酸序列，這有利于細(xì)胞黏附、增殖和分化[4］。 明 膠 含 有 基 質(zhì) 金 屬 蛋 白 酶（matrix metalloproteinase，MMP），有利于細(xì)胞重塑和進(jìn)一步提高明膠理化性質(zhì)[6］。GelMA 水凝膠通常是由甲基丙烯酸酐與明膠反應(yīng)得到，并且在光引發(fā)劑下進(jìn)行光交聯(lián)產(chǎn)生的。光交聯(lián)可在溫和的條件（室溫、中性pH 值等）進(jìn)行。GelMA 水凝膠因含有少于5% 的甲基丙烯酸酐，使明膠的大多數(shù)功能性氨基酸基序，包括RGD 和MMP 不受顯著影響，從而保留明膠的大部分性能[7］。

與其他現(xiàn)有的水凝膠形成生物材料相比，GelMA 水凝膠可通過(guò)添加各種生物材料或者不同的合成工藝來(lái)滿(mǎn)足骨組織工程應(yīng)用材料的要求。

GelMA 與成骨生成相關(guān)研究

工藝因素對(duì)骨再生性能及機(jī)械力學(xué)性能的影響 不同研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)改變聚合物濃度、甲基化程度和紫外光強(qiáng)度等，可對(duì)骨再生性能或力學(xué)性能產(chǎn)生影響。Celikkin 等[8］通過(guò)研究凝膠濃度對(duì)水凝膠支架骨再生性能的影響，發(fā)現(xiàn)5%（w/v）GelMA 水凝膠和10%（w/v）GelMA 水凝膠在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化培養(yǎng)基中，均表現(xiàn)出良好的成骨分化。研究發(fā)現(xiàn)GelMA 水凝膠的孔徑與合成過(guò)程中使用的GelMA 濃度成反比。5%（w/v%）GelMA 水凝膠具有明顯較大的孔徑，使同源鈣離子通過(guò)率和擴(kuò)散率增加。結(jié)果表明，5%GelMA 濃度的水凝膠體外骨再生性能優(yōu)于10%GelMA 濃度的水凝膠。

盡管GelMA 水凝膠具有細(xì)胞黏附、增殖、分化等利于成骨的性質(zhì)，但力學(xué)性能不足限制了其作為承載材料的應(yīng)用。Wang 等[9］采用光交聯(lián)聚合的方法，利用GelMA 和葡聚糖甲基丙烯酸縮水甘油酯（dextran glycidyl methacrylate，DexMA）制備了新型雙組分聚合物水凝膠GelMA-DexMA。 通過(guò)控制甲基丙烯酸縮水甘油酯在DexMA 中的取代度（degree of substitution，DS），可以獲得較好的機(jī)械性能。結(jié)果表明，GelMA-DexMA 呈蜂窩狀結(jié)構(gòu)，孔徑隨DS 增加而減小，表現(xiàn)出較低的溶脹比和較高的壓縮模量。

聚合過(guò)程中的紫外線(xiàn)UV 劑量也在GelMA 的機(jī)械性能中起關(guān)鍵作用。例如，增加紫外線(xiàn)劑量會(huì)降低細(xì)胞的整體存活率，而優(yōu)化紫外線(xiàn)照射時(shí)間可以在保持細(xì)胞存活率和促進(jìn)細(xì)胞分化水平的同時(shí)改善機(jī)械特性[10］。Wang 等[11］采用紫外光交聯(lián)法合成了GelMA/聚乙二醇二丙烯酸酯（poly ethylene glycol diacrylate，PEGDA）水凝膠，通過(guò)改變光引發(fā)劑I2959 和PEGDA 的用量，可以很容易地控制膠凝時(shí)間。另外研究發(fā)現(xiàn)此型凝膠的機(jī)械強(qiáng)度、擴(kuò)散速率和溶脹速率均有所提高，力學(xué)性能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)GelMA。

加入不同材料對(duì)骨再生性能及機(jī)械力學(xué)性能的影響 骨移植材料都應(yīng)至少具備以下一種生物特性：（1）骨傳導(dǎo)性，提供支架幫助組織長(zhǎng)入和新骨沉積；（2）骨誘導(dǎo)性，分泌因子誘導(dǎo)骨前體細(xì)胞分化成骨；（3）成骨作用，提供具有成骨潛能的骨祖細(xì)胞。

骨缺損修復(fù)材料還需要有較好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。由于GelMA 的柔韌性不理想，成膜結(jié)構(gòu)脆弱以及操作困難等，所以不利于作為人工骨材料應(yīng)用。 因此，Wang 等在GelMA/PEGDA 的基礎(chǔ)上加入納米羥 基磷灰 石（nano-hydroxyapatite，nHA），制備了GelMA-PEGDA-nHA 復(fù)合水凝膠涂料。與GelMAPEGDA 水凝膠相比，nHA 的加入可以控制復(fù)合水凝膠的力學(xué)性能并降低降解速率。

各種磷酸鈣已被用作骨替代材料，而不是自體移植物。其中，羥基磷灰石（hydroxyapatite，HAP）和可生物降解的磷酸鈣在臨床上應(yīng)用最為廣泛。磷酸八鈣（octacalcium phosphate，OCP）是一種可生物降解的材料，有人認(rèn)為OCP 是骨骼和牙齒磷灰石晶體的前身[12］。Anada 等[13］采用兩步數(shù)字光處理技術(shù)，用含有OCP 的GelMA 環(huán)來(lái)模擬骨皮質(zhì)，進(jìn)一步證明在凝膠中均勻嵌入的OCP 能促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。Qiao 等[14］合成了一種光交聯(lián)的成骨增強(qiáng)肽（osteogenic growth peptide，OGP），然后通過(guò)GelMA 共交聯(lián)OGP 生成了GelMA-c-OGP。GelMA-c-OGP 的機(jī)械壓縮性能達(dá)到90 kPa，優(yōu)于GelMA。而且Gelma-c-OGP 具有降解作用，有利于OGP 的釋放。此外，GelMA-c-OGP 水凝膠支架在體外可促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，增加新骨的形成。

脫鈣骨基質(zhì)（demineralized bone matrix，DBM）已經(jīng)成為骨再生領(lǐng)域研究最多的材料之一，并被定位為有吸引力的替代物。因此Ramis 等[15］研究采用C2C12 細(xì)胞和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)成骨，體內(nèi)異位成骨模型通過(guò)配制甘油（Gly）、透明質(zhì)酸（HA）和GelMA 分別作為DBM 載體，比較其物理化學(xué)性能，如微觀結(jié)構(gòu)、抗壓強(qiáng)度和血清黏附性以及細(xì)胞毒性試驗(yàn)和堿性磷酸酶的活性，以此評(píng)估DBM 在體外誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的效果。研究結(jié)果表明，在物理化學(xué)性能測(cè)定方面，GelMA 制劑作為載體優(yōu)于其他制劑。另外，GelMA 具有更加致密的結(jié)構(gòu)、低細(xì)胞毒性和高堿性磷酸酶活性，相比而言具有最大的骨誘導(dǎo)潛力，而且新骨和骨髓形成的比例更高。

Zheng 等[16］制備一種由有機(jī)-無(wú)機(jī)復(fù)合生物誘導(dǎo)的水凝膠，其通過(guò)連續(xù)的物理和化學(xué)交聯(lián)方法，運(yùn)用生物活性玻璃（bioactive glass，BG）和GelMA制備復(fù)合材料水凝膠，同樣使其壓縮模量顯著提高。除此之外，在凝膠中加入BG 還可以顯著提高該復(fù)合水凝膠的穩(wěn)定性和生物活性，從而促進(jìn)細(xì)胞附著、增殖和成骨分化。除了可加入BG 以外，Xin等[17］將 生 物 活 性 玻 璃 納 米 粒 子（mesoporous bioactive glass nanoparticles，MBGNS）作為無(wú)機(jī)組分制備了一種新型增強(qiáng)型GelMA 復(fù)合交聯(lián)材料，即具有雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的GelMA-G-MBGNS 水凝膠。相比較BG/GelMA 復(fù)合水凝膠，GelMA-G-MBGNS水凝膠具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性更好，力學(xué)性能優(yōu)，降解速率可控，周?chē)h(huán)境穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定對(duì)細(xì)胞增殖和分化具有重要意義，因此，這種水凝膠膜的應(yīng)用可能為骨組織工程中治療骨缺損和其他類(lèi)型的損傷提供一個(gè)好的材料。

機(jī)械性能也是設(shè)計(jì)成功的骨缺損修復(fù)材料所必需的。添加剛性材料是改善凝膠機(jī)械強(qiáng)度的一種方法。由GelMA 和納米金剛石（nanodiamonds，Nds）組成的新型納米復(fù)合水凝膠，既控制間充質(zhì)干細(xì)胞（HASCS）的成骨作用，也增強(qiáng)了GelMA 水凝膠 的力學(xué)性能[18］。同樣 道理，將GelMA 與HAP 混合，成功地制備了GelMA-HAP 復(fù)合化水凝膠，其力學(xué)強(qiáng)度高于純GelMA 水凝膠。Levett 等[19］也通過(guò)在GelMA 凝膠中加入糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs）改善凝膠的力學(xué)性能。

不僅如此，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)水凝膠和支架之間的共價(jià)鍵結(jié)合也可以提高機(jī)械強(qiáng)度。

GelMA 與血管生成相關(guān)研究骨是一種高度血管化的組織，具有獨(dú)特而復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。骨替代材料被植入大型骨缺損時(shí)，血管化不足常常導(dǎo)致骨再生不良。在大塊骨移植中實(shí)現(xiàn)早期血管形成以提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。

血管能夠?yàn)榧?xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣[20］，避免了相關(guān)組織壞死，所以血管對(duì)于治療骨缺損尤為重要。骨由包含血管滲透網(wǎng)的外周皮質(zhì)和高度血管化的內(nèi)部骨髓間隙組成。Anada 等[13］采用兩步數(shù)字光處理技術(shù)，用含有OCP 的GelMA 環(huán)來(lái)模擬骨皮質(zhì)，用含有人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）的中心GelMA 環(huán)來(lái)模擬骨髓腔，以制備骨仿生的3D 水凝膠材料。這種具有仿生雙環(huán)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞負(fù)載型水凝膠骨構(gòu)建物有望應(yīng)用于骨組織缺損的修復(fù)中。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子被認(rèn)為能促進(jìn)血管生成。運(yùn)用含有不同濃度血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的GelMA 水凝膠可以促進(jìn)微血管形成[21］，并通過(guò)3D 打印方法確定結(jié)構(gòu)。Lai 等[22］制備了載有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的GelMA/carboxybetaine methacrylate（CBMA）水凝膠，可以在體內(nèi)控制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子釋放，從而誘導(dǎo)更大程度的血管生成。

Byambaa 等[21］提出了這種基于擠壓的直接生物打印方法，可用于制造具有血管功能的類(lèi)骨組織結(jié)構(gòu)。 其中含有人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human mesenchymal stem cell，HMSC）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的GelMA 水凝膠通過(guò)3D 打印使可灌注血管的形成成為可能。 另外他們?cè)O(shè)計(jì)用硅酸鹽納米片的GelMA-HMSC 水凝膠作為外層誘導(dǎo)成骨，促使微血管形成。然而，這種方法只能確保通道附近的細(xì)胞存活。使3D 打印的支架向成熟組織轉(zhuǎn)變，將血管生成方面相容性高的細(xì)胞與良好的3D 打印特性結(jié)合起來(lái)仍然是需要解決的重要問(wèn)題。Stratesteffen[23］將膠原蛋白加入水凝膠中形成水凝膠混合物（GelMA-collagen blends）增加了細(xì)胞間的聚集能力。

細(xì)胞微環(huán)境在改善組織的細(xì)胞反應(yīng)和功能方面起著至關(guān)重要的作用。 模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）并能夠釋放生長(zhǎng)因子的支架是組織工程應(yīng)用研究的重要內(nèi)容。Modaresifar等[24］通過(guò)光聚合制備水凝膠，開(kāi)發(fā)了GelMA/殼聚糖納米顆粒復(fù)合水凝膠以遞送血管生成生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）。由于其生物相容性結(jié)構(gòu)和提供bFGF 持續(xù)釋放的情況，GelMA/殼聚糖納米顆?？梢燥@著促進(jìn)細(xì)胞增殖。這種水凝膠支架可用于在各種應(yīng)用中有效遞送bFGF，特別是用于血管生成。

除了解內(nèi)源性血管因子的血管化作用，還要了解外源性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子血管化作用。研究表明，無(wú)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的Integrin a2b1 整合素特異性的多肽GFOGER 型水凝膠體內(nèi)血管化水平高于無(wú)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的Integrin avb3 整合素靶向多肽GRGDPC 型水凝膠，并與含有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子grgdpc（RGD）水凝膠體內(nèi)血管化水平相似，證實(shí)了整合素單獨(dú)指導(dǎo)和引導(dǎo)血管生成水平和調(diào)節(jié)血管生成蛋白的生物學(xué)活性的能力，所以在再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用中開(kāi)發(fā)整合素特異性十分重要。生長(zhǎng)因子蛋白質(zhì)價(jià)格的昂貴和重要的監(jiān)管問(wèn)題，通過(guò)簡(jiǎn)單的功能化技術(shù)來(lái)設(shè)計(jì)支架以減少或完全消除對(duì)生長(zhǎng)因子的需求，可以大大提高未來(lái)再生醫(yī)學(xué)構(gòu)建的臨床療效[25］。

在促進(jìn)血管生成的因素中，某些離子最近被認(rèn)為是一種有效的元素。Dashnyam 等[26］設(shè)計(jì)了一種支架，將藻酸鈉水凝膠注入纖維支架中。他們采用表面硅酸鹽涂層技術(shù)，使負(fù)載的硅酸鹽離子持續(xù)釋放在一周以上，誘導(dǎo)血管生成和促進(jìn)表面成骨活性。研究證實(shí)通過(guò)硅酸鹽離子促進(jìn)血管生成，血管加速生成刺激骨骼修復(fù)過(guò)程。此種復(fù)合型水凝膠具有可加工性、形狀可塑性等優(yōu)點(diǎn)。

Vishnu 等[27］以甲殼素和聚丁二酸丁二醇酯（polybutylene succinate，PBSu）為原料，分別以（250±20）nm 纖維蛋白納米粒（fibrin nanoparticles，F(xiàn)NPs）和摻鎂生物玻璃（magnesium-doped bioglass，MBG）為載體，制備了可注射的水凝膠體。研究證明含有2%MBG 和2%FNPs 的水凝膠體系既能促進(jìn)血管化，也能促進(jìn)成骨，而且這種凝膠有可能用于不規(guī)則骨缺損的有效再生。

結(jié)語(yǔ)GelMA 水凝膠因其獨(dú)特的特質(zhì)，所以在骨缺損修復(fù)材料領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景。隨著生物醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)知識(shí)及技術(shù)的不斷發(fā)展，基于天然水凝膠的生物材料在骨組織工程的應(yīng)用研究取得了諸多進(jìn)展，并且已經(jīng)開(kāi)始進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化。然而需要研究具有良好的成骨性能、機(jī)械性能、血管功能化凝膠支架以及精確成形支架是目前骨組織工程應(yīng)用研究的內(nèi)容以及挑戰(zhàn)。隨著組織工程學(xué)的發(fā)展以及研究的深入，有望構(gòu)建出高度仿生的骨缺損修復(fù)材料，以便更好地用于臨床。

作者貢獻(xiàn)聲明張孝利，孫健 研究構(gòu)思，文獻(xiàn)整理及論文修訂。余優(yōu)成，吳興文 文獻(xiàn)收集，論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。