陳嘉慧，錢 葉，侯怡鈴，張 萌，丁 祥

(1. 西華師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充 637009；2. 西華師范大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，四川 南充 637009)

銀杏(GinkgobilobaL.)屬于世界上最為古老珍貴的孑遺植物，因此它享有植物界“活化石”的美稱。作為世界四大園林植物之一的銀杏是集觀賞、生態(tài)、營養(yǎng)和醫(yī)藥等功能于一體的天然綠色資源，因此極具研究和保護(hù)價(jià)值[1-2]。

種類數(shù)量繁多的土壤微生物在維持其生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性、促進(jìn)土壤生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)等方面均發(fā)揮著極其重要的作用[3]。大量研究分析發(fā)現(xiàn)，土壤微生物活性和群落結(jié)構(gòu)功能多樣性會(huì)受到多因素作用，如，植物根系分泌物等能推動(dòng)其根系土壤微生物的生長發(fā)展[4]。劉子雄等[5]研究發(fā)現(xiàn)，植物對(duì)其根系土壤微生物的種類數(shù)量和生態(tài)分布等方面極為重要，為土壤提供營養(yǎng)成分和有機(jī)物質(zhì)等[6]。Waid等[7]研究發(fā)現(xiàn)，植物能促進(jìn)根系土壤微生物多樣性發(fā)展，使其協(xié)同進(jìn)化。張安才等[8]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏樹表現(xiàn)出明顯的根際效應(yīng)，銀杏樹通過為根系土壤微生物提供營養(yǎng)物質(zhì)來影響其數(shù)量、種類和活性等；同時(shí)，根系土壤微生物的代謝也會(huì)影響根營養(yǎng)的吸收和銀杏樹的生長。

近十多年來，土壤微生物群落功能多樣性研究發(fā)展迅速，趨于成熟，多種研究方法技術(shù)被廣泛應(yīng)用，如：高通量測(cè)序技術(shù)、Biolog微平板技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 變性梯度凝膠電泳技術(shù)(PCR-DGGE)、磷脂脂肪酸技術(shù)(PLFA)，特別是Biolog-生態(tài)板(ECO)技術(shù)操作簡(jiǎn)單快速、數(shù)據(jù)量豐富，具有直觀迅速展現(xiàn)微生物代謝功能多樣性特征[9]等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用。

運(yùn)用Biolog-ECO技術(shù)深入分析幼年期、掛果期和盛果期3個(gè)年齡段銀杏樹根系土壤微生物代謝功能多樣性，旨在揭示不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物群落功能多樣性特征，為進(jìn)一步研究銀杏樹與根系土壤微生物的相互作用機(jī)制和土壤微生物群落多樣性提供一定的科學(xué)依據(jù)，為進(jìn)一步保護(hù)利用銀杏資源和土壤微生物資源提供一定的思路。

1 材料與方法

1.1 研究地區(qū)概況

本研究實(shí)驗(yàn)地位于四川省南充市高坪區(qū)東觀鎮(zhèn)(N30°46.733′，E106°16.451′)，亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，處于四川盆地中部、嘉陵江中游東岸，屬于低山丘陵。年均降水量1 007 mm，年均氣溫17.6 ℃，日照率為27%～35%，年平均日照時(shí)數(shù)為1 200～1 500 h 。

1.2 樣地設(shè)計(jì)及樣品采集

實(shí)驗(yàn)樣品采集于2017年4月，通過等距取樣法選取同一銀杏林的10年以下(幼年期)、20年(掛果期)和40年以上(盛果期)這3個(gè)年齡段的銀杏樹各3棵，在距樹干底部20 cm處采集表層土壤，去除土樣里的植物根系和礫石等雜質(zhì)后均勻混合。根據(jù)銀杏樹年齡階段的不同，分別將銀杏樹幼年期、掛果期、盛果期的土壤樣品標(biāo)記為A11、B11、C11，無菌封裝后低溫保存，便于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。

1.3 儀器與設(shè)備

1510-04570型酶標(biāo)儀、MAXQ4000型恒溫?fù)u床，賽默飛世爾科技有限公司；DPX-9272B-1型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.4 方法

通過采用Biolog-ECO技術(shù)，研究分析幼年期、掛果期、盛果期3個(gè)年齡段的銀杏樹根系土壤微生物多樣性。首先取99 mL滅菌蒸餾水和1 g樣品到250 mL錐形瓶中，25 ℃、250 r/min恒溫振蕩20 min后，4 ℃靜置30 min，再取上清液150 μL接種到ECO板中25 ℃恒溫培養(yǎng)10 d，每隔24 h檢測(cè)其在590和750 nm波長下的OD590和OD750。

1.5 數(shù)據(jù)處理

將測(cè)定的OD590減去OD750，所得數(shù)據(jù)以用于后續(xù)的計(jì)算分析[9]。通過Origin 2017對(duì)各項(xiàng)數(shù)據(jù)作柱狀圖；通過SPSS 22.0對(duì)測(cè)定的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行相應(yīng)的方差分析(ANOVA)和主成分分析(PCA)。

2 結(jié)果與討論

2.1 銀杏樹根系土壤微生物群落碳源代謝能力分析

在Biolog-ECO板中，31種碳源是土壤微生物的唯一能量來源，平均顏色變化率(AWCD)與碳源利用能力呈正相關(guān)關(guān)系[10]。圖1為不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物群落AWCD時(shí)間變化曲線。由圖1可知：培養(yǎng)初期0～24 h時(shí)，AWCD值均較低，接近于0，說明不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物都幾乎沒有利用碳源，群落代謝能力低；在24 h后，AWCD值的增速加快，由此說明土壤微生物逐漸大量利用碳源，繁殖速率加快，群落代謝能力增加，特別是培養(yǎng)時(shí)間為24～144 h時(shí)，AWCD值增速最大；在144～240 h時(shí)，AWCD值增速逐漸放緩；在240 h 時(shí)，AWCD值達(dá)到最大，即幼年期(1.4)>盛果期(1.08)>掛果期(0.9)，說明由于競(jìng)爭(zhēng)、單一碳源限制等因素，微生物數(shù)量的增長率逐漸下降，碳源的利用率達(dá)到最大值。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物AWCD值呈現(xiàn)幼年期>盛果期>掛果期的“S”形上升變化趨勢(shì)，即不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物群落多樣性和代謝能力呈現(xiàn)幼年期>盛果期>掛果期的“S”形上升變化趨勢(shì)，說明土壤微生物在Biolog-ECO板內(nèi)適應(yīng)良好。

圖1 不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物群落AWCD時(shí)間變化曲線Fig.1 AWCD time curves of the soil microbialcommunity of ginkgo root in different ages

對(duì)不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物群落代謝能力方差分析，結(jié)果見表1。由表1可知，在48 h時(shí)，幼年期、掛果期、盛果期的銀杏樹根系土壤微生物的碳源代謝能力差異不顯著(P<0.05)；培養(yǎng)時(shí)間為0 h和72～120 h時(shí)，其碳源代謝能力差異顯著(P<0.05)，培養(yǎng)時(shí)間為24 h和144～240 h時(shí)，差異極顯著(P<0.01)。由此說明，銀杏樹根系土壤微生物群落碳源代謝能力呈現(xiàn)幼年期>盛果期>掛果期的趨勢(shì)，且差異極為顯著。

表1 不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物群落代謝能力方差分析Table 1 Variance analysis for soil microbial community of ginkgo root at different ages

2.2 銀杏樹根系土壤微生物群落對(duì)6大類碳源利用率分析

圖2為不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物對(duì)6大類碳源的利用情況。由圖2可知：隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長，Biolog-ECO板中的6大類碳源平均顏色變化率(AWCD)從較低到迅速升高，最后增速放緩趨近于0；3個(gè)年齡段銀杏樹根系土壤微生物對(duì)碳水化合物類和醇類有機(jī)碳源的利用程度較低，對(duì)氨基酸類、酯類、胺類和酸類碳源的利用程度較高，說明氨基酸類、酯類、胺類和酸類是其主要的碳源利用類型。李驍?shù)萚11]研究發(fā)現(xiàn)，在植物生長過程中，其根系會(huì)釋放大量的氨基酸等有機(jī)物，因此推測(cè)銀杏樹生長過程中，其根系分泌釋放的氨基酸類、酯類、胺類和酸類碳源較多，碳水化合物類和醇類碳源較少[12]。雖然3個(gè)年齡段銀杏樹根系土壤微生物對(duì)6大類碳源利用程度存在一定的差異，但總體來說，銀杏樹根系土壤微生物的碳源利用程度呈現(xiàn)幼年期>盛果期>掛果期的趨勢(shì)，說明由于銀杏樹年齡段的不同，其根系土壤微環(huán)境會(huì)影響微生物對(duì)碳源的利用[13-14]。

圖2 不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物對(duì)6大類碳源的利用情況Fig.2 Utilization of 6 kinds of carbon sources in the root soil microorganism of ginkgo tree at different ages

2.3 銀杏樹根系土壤微生物群落碳源代謝特征主成分分析

不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物在培養(yǎng)96 h(對(duì)數(shù)期)時(shí)，將測(cè)得的利用31種碳源的光密度值(OD值)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和主成分分析(PCA)[15-16]，如表2所示。由表2可知，特征值大于1的主成分有7個(gè)，其累計(jì)貢獻(xiàn)率分別為41.576%、15.709%、12.047%、9.789%、9.635%、5.409%和3.475%，提取貢獻(xiàn)率最高的2個(gè)主成分，其總貢獻(xiàn)率達(dá)到57.285%，其中第1主成分(PC1)、第2主成分(PC2)分別可解釋變量方差的41.576%、15.709%，其余6個(gè)主成分貢獻(xiàn)率較低，故不予考慮。因此根據(jù)變異的主要來源PC1和PC2來構(gòu)建二維坐標(biāo)，能直接體現(xiàn)微生物群落代謝特征[17]。

表2 方差分解主成分提取分析Table 2 Analysis of total variance explained

對(duì)3個(gè)年齡段銀杏樹根系土壤微生物群落代謝碳源特性進(jìn)行PCA分析，結(jié)果如圖 3 所示。由圖3可知：PC1能解釋41.576%變異的原因，因此其相關(guān)性關(guān)鍵體現(xiàn)于PC1軸，幼年期主要聚集在PC1正端、PC2負(fù)端；掛果期主要聚集在PC1負(fù)端、PC2正端；盛果期主要聚集在PC1負(fù)端、PC2正端。說明PC1能區(qū)分幼年期、盛果期和掛果期，并呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，因此銀杏樹根系土壤微生物群落代謝特征主要與樹齡相關(guān)[18]，且呈現(xiàn)一定的正相關(guān)；PC2主要體現(xiàn)了銀杏樹個(gè)體之間的差異。土壤微生物群落明顯分為2簇，掛果期和盛果期聚為1簇，幼年期為1簇，表明掛果期和盛果期的銀杏樹根系土壤微生物對(duì)31種碳源的利用比較相似。

圖3 不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物群落代謝主成分分析Fig.3 Principal component analysis for carbon utilization of soil microbial communitiesof ginkgo root at different ages

2.4 銀杏樹根系土壤微生物群落多樣性指數(shù)分析

不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物在培養(yǎng)時(shí)間為96 h時(shí)，測(cè)量計(jì)算分析得到的Shannon-Weaver指數(shù)(H)、豐富度指數(shù)(S)、均勻度指數(shù)(E)和McIntosh指數(shù)(U)能體現(xiàn)3個(gè)年齡段銀杏樹根系土壤微生物群落的碳源代謝種類多樣性特征[19]。表3為不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物群落多樣性指數(shù)。由表3可知：就H而言，呈現(xiàn)掛果期(3.325)>幼年期(3.320)>盛果期(3.289)，并差異極為顯著(P>0.01)，表明掛果期銀杏樹根系土壤微生物群落種類多而平均，且不同年齡段的銀杏樹根系環(huán)境微生物多樣性豐富程度差異極為顯著；就S而言，幼年期(29.667)>掛果期(28.333)>盛果期(27.333)，并且沒有顯著差異，說明微生物選擇性利用碳源種類數(shù)目并沒有顯著差異，幼年期的利用碳源數(shù)目最多；就E而言，盛果期(0.995)>掛果期(0.994)>幼年期(0.980)，并且沒有顯著差異，因此盛果期銀杏樹根系土壤微生物群落數(shù)目分配的均勻程度及碳源利用種類最高；就U而言，呈現(xiàn)幼年期(5.815)>盛果期(4.306)>掛果期(3.901)和極顯著差異(P> 0.01)，說明微生物群落均勻程度差異極為顯著，且土壤微生物種類和碳源利用程度呈現(xiàn)幼年期>盛果期>掛果期的趨勢(shì)。由此可見，銀杏根系土壤微生物群落功能多樣性、均勻程度及代謝活性等在一定程度上受銀杏樹年齡的影響，并主要體現(xiàn)在碳源的利用上[20]。

表3 不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物群落多樣性指數(shù)Table 3 The soil microbial community diversity indices of ginkgo root at different ages

不同年齡段銀杏樹根系土壤微生物群落多樣性存在顯著差異，可能的原因有：

1)銀杏樹根系土壤微生物種類數(shù)量等會(huì)受到其根系分泌物不同程度影響。隨著樹齡的增加，根系分泌速率呈現(xiàn)高—低—高的趨勢(shì)[21]，其根系土壤微環(huán)境會(huì)影響微生物的種類數(shù)目和對(duì)碳源的利用情況，調(diào)節(jié)土壤微生物的生長代謝[5]。

2) 在Biolog-ECO板的96個(gè)微孔中，31種碳源無法完全呈現(xiàn)銀杏樹根系土壤微生物的自然環(huán)境條件，無法完整反映土壤微生物群落代謝功能多樣性[22]。

3 結(jié)論

運(yùn)用Biolog-ECO技術(shù)分析3個(gè)年齡段銀杏樹根系土壤微生物群落代謝功能多樣性特征規(guī)律，得到了一些初步的結(jié)果，但是關(guān)于銀杏樹根系對(duì)土壤微生物的作用機(jī)制還有待研究。因此，今后將會(huì)進(jìn)一步利用高通量測(cè)序技術(shù)和PCR-DGGE技術(shù)，圍繞銀杏樹根系土壤微生物群落組成、結(jié)構(gòu)和功能等方面逐步展開研究，以期更為全面深入闡釋3個(gè)年齡段銀杏樹對(duì)其根系土壤微生物群落功能結(jié)構(gòu)組成的作用。