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        LC-MS測(cè)定不同品種小麥中氨基酸含量及PCA分析

        2021-02-27 08:25:24吳琴燕朱建飛陳宏州楊紅福楊敬輝莊義慶
        生物加工過(guò)程 2021年1期

        吳琴燕,朱建飛,陳宏州,楊紅福,楊敬輝,莊義慶,2

        (1.江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所中心實(shí)驗(yàn)室,江蘇 句容 212400;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,江蘇 南京 210049)

        小麥屬于禾本科植物,是世界第二大糧食作物,為人體主要蛋白的來(lái)源之一[1]。我國(guó)小麥籽粒平均蛋白含量約為15.10%,變異系數(shù)在7.50%~28.90%,不同品種間相差較大[2],蛋白質(zhì)的差異直接影響到小麥的氨基酸含量,而氨基酸組分及其含量的高低對(duì)機(jī)體生長(zhǎng)和組織更新有重要的作用[3],高蛋白含量的小麥育種,同時(shí)改善其必需氨基酸的比例是目前研究的熱點(diǎn)[2]。對(duì)小麥氨基酸的研究多集中于水解氨基酸組分及其含量分析,研究者普遍認(rèn)為水解氨基酸中谷氨酸、脯氨酸和天冬氨酸含量較高,而組氨酸、胱氨酸和蛋氨酸含量較低[4-5],不同研究得到的特定氨基酸含量差異較大。目前用于測(cè)定氨基酸含量的常見(jiàn)方法有氨基酸自動(dòng)分析儀分析法和液相色譜法[6-8],這兩種方法檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、需要衍生,存在一定的局限性。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS)檢測(cè)氨基酸含量無(wú)需衍生,可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)多種氨基酸的檢測(cè),是目前發(fā)展極為快速的方法[9-10]。

        主成分分析(PCA)通過(guò)降維處理,可揭示組分和品種之間的復(fù)雜關(guān)系[11],并可通過(guò)各主成分得分對(duì)樣品進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[12-13]。利用PCA對(duì)食品品質(zhì)的研究已經(jīng)展開(kāi),李俊芳等[14]利用PCA對(duì)10個(gè)果桑品種游離氨基酸質(zhì)量進(jìn)行分析和評(píng)價(jià),將復(fù)雜事務(wù)簡(jiǎn)單化。本研究中,筆者收集了淮南地區(qū)37個(gè)小麥品種,采用LC-MS技術(shù)測(cè)定其游離和水解氨基酸種類和含量,并通過(guò)PCA分析不同品種游離和水解氨基酸組成差異,以期為小麥的深加工利用提供科學(xué)依據(jù)。

        1 材料和方法

        1.1 材料與儀器

        供試37個(gè)小麥品種于2018年收獲于鎮(zhèn)江農(nóng)科院行香科研基地,分別為寧麥22、蘇科麥1號(hào)、樂(lè)麥608、寧麥14、寧麥23、蘇麥11號(hào)、揚(yáng)麥16、鎮(zhèn)麥12、龍麥169、望水白、蘇麥188、華麥8號(hào)、揚(yáng)麥23、寧麥0569、華麥5號(hào)、揚(yáng)麥21、蘇麥8號(hào)、農(nóng)豐88、揚(yáng)麥22、蘇麥3號(hào)、鎮(zhèn)麥168、揚(yáng)麥13、揚(yáng)輻麥5號(hào)、揚(yáng)輻麥4號(hào)、淮麥30、揚(yáng)麥15、寧麥26、華麥6號(hào)、寧資126、揚(yáng)大180、華麥1028、揚(yáng)麥27、揚(yáng)輻麥1025、隆麥28、明麥133、揚(yáng)麥158和揚(yáng)麥28。小麥樣品烘干粉碎后過(guò)250 μm篩網(wǎng)備用。

        甲醇和乙腈(色譜純),美國(guó)默克公司;甲酸(≥98%),德國(guó)CNW公司;鹽酸(分析純),天津科密歐有限公司;L-谷氨酰胺(Gln)、L-賴氨酸(Lys)、γ-氨基丁酸(GABA)、L-精氨酸(Arg)、L-瓜氨酸(Cit)、L-谷氨酸(Glu)、L-鳥(niǎo)氨酸(Orn)、L-脯氨酸(Pro)、L-酪氨酸(Tyr)、L-丙氨酸(Ala)、L-天冬氨酸(Asp)、L-組氨酸(His)、L-蛋氨酸(Met)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-絲氨酸(Ser)、L-蘇氨酸(Thr)、L-纈氨酸(Val)、L- 纈氨酸(Val)、L-色氨酸(Trp)、L-甘氨酸(Gly)(≥98%),上海麥克林生化科技有限公司。

        Agilent 1290型UPLC系統(tǒng)、ABsciex 4500質(zhì)譜檢測(cè)器、XP105DR型電子天平,賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;超純水系統(tǒng),默克公司;KQ-250E 型超聲波清洗器,昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

        1.2 小麥樣品前處理

        游離氨基酸的提取[15]:準(zhǔn)確稱取小麥0.20 g,加入10 mL去離子水,沸水浴2 h后,離心取上清液,稀釋100倍后,過(guò)0.22 μm微孔濾膜供上機(jī)測(cè)定使用。

        水解氨基酸的提取[1]:準(zhǔn)確稱取小麥0.10 g,置于水解管中,加入6 mol/L的鹽酸10 mL,100 ℃條件下水解24 h,水解完全后,冷卻,混勻,離心,取上清液,稀釋1 000倍后,過(guò)0.22 μm微孔濾膜供上機(jī)測(cè)定使用。

        1.3 色譜-質(zhì)譜條件

        Phenomenex,KinetexHilic色譜柱 (100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動(dòng)相:0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B),60%A相等度洗脫4 min。流速為400 μL/min,柱溫40 ℃,進(jìn)樣量1 μL。質(zhì)譜檢測(cè)條件:離子化模式ESI+,檢測(cè)方式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM),氣簾氣35 psi,噴霧電壓5.5 kV,離子化溫度450 ℃;Gas1:40 psi,Gas2:40 psi。

        采用ESI+模式,使用注射針泵分別向質(zhì)譜中注入各個(gè)氨基酸溶液,通過(guò)一級(jí)全掃描和二級(jí)質(zhì)譜裂解分析,分別獲取各個(gè)氨基酸的母離子和子離子,并進(jìn)一步優(yōu)化去簇電壓和碰撞電壓,獲得的19種氨基酸具體質(zhì)譜檢測(cè)條件如表1所示。

        表1 19種氨基酸的多反應(yīng)檢測(cè)參數(shù)Table 1 Multiple reaction monitoringparameters of 19 amino acids

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次,結(jié)果以平均值表示,采用SPSS17.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。經(jīng)過(guò)PCA提取出主成分進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),以每個(gè)主成分因子得分值Fi(i=1,2,…)及其方差貢獻(xiàn)率βi(i=1,2,…),作為權(quán)數(shù),利用綜合評(píng)價(jià)模型F=β1F1+β2F2+…+βiFi計(jì)算各樣品綜合得分[16-17]。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 氨基酸LC-MS檢測(cè)方法的建立

        按照1.3節(jié)色譜條件測(cè)定單體標(biāo)準(zhǔn)溶液,以各待測(cè)物質(zhì)量濃度X(ng/mL)為橫坐標(biāo),峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析,得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。同時(shí)以19種氨基酸特征峰的信噪比(S/N)≥3時(shí)為該方法的檢出限,(S/N)≥10為定量限,結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn):19種氨基酸在一定濃度范圍內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.982,檢出限和定量限分別為1.29~29.45 ng/mL、4.13~165.90 ng/mL,說(shuō)明該方法確實(shí)可行,可以滿足樣品測(cè)定的要求。

        表2 19種氨基酸單體標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限Table 2 Calibration curves,LOD,and LQD of 19 amino acids

        2.2 游離氨基酸含量分析

        表3為37個(gè)小麥品種的游離氨基酸含量,其中Arg和Glu含量較高,Gly基本無(wú)檢出。對(duì)37個(gè)品種的氨基酸含量進(jìn)行主成分分析,結(jié)果見(jiàn)表4~5。由表4~5可知,前3個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到82.17%,說(shuō)明前3個(gè)成分能代表該37個(gè)小麥品種中全部游離氨基酸的信息,能夠較好地反映37個(gè)品種中游離氨基酸含量的相關(guān)關(guān)系。F1包括GABA、Arg、Gln、Lys、Glu、Pro、Tyr、Ala、Asp、His、Met、Phe、Thr和Val,其中Lys、Phe、Met、Thr和Val為必需氨基酸;F2與Orn、Ser、Gly具有較大正相關(guān)性,F(xiàn)3與Asp正相關(guān),Cit高度負(fù)相關(guān),這3個(gè)主成分能夠較全面地反映所有化合物的信息。

        表3 37種小麥游離氨基酸分析測(cè)試結(jié)果(n=3)Table 3 Contents of free amino acids in 37 different wheat varieties(n=3)

        表4 游離氨基酸主成分特征值和貢獻(xiàn)率Table 4 Eigenvalue of principal component and contribution rate of free amino acids

        2.3 水解氨基酸含量分析

        表6是37種小麥水解氨基酸分析測(cè)試結(jié)果。由表6可知,Gln、Trp在酸水解過(guò)程中被破壞,未檢出,GABA酸解損失較大,其含量低于游離氨基酸。水解氨基酸中主要含有Glu、Pro、Tyr 和Asp,平均含量分別為52.99、17.54、11.55、12.46 mg/g;其次為Arg、Phe、Ser和Gly,平均含量分別為8.70、8.39、7.25和6.53 mg/g,其他氨基酸含量均較低。

        表5 游離氨基酸主成分的成分矩陣Table 5 Principal component matric of free amino acids

        表6 37種小麥水解氨基酸分析測(cè)試結(jié)果(n=3)Table 6 Contents of hydrolyzed amino acids in 37 different wheat varieties(n=3)

        表7和表8為水解氨基酸主成分的特征值、百分率及成分矩陣。由表7和表8可知,F(xiàn)1與Arg、Lys、Glu、Pro、Tyr、Ala、Asp、His、Phe、Ser、Thr、Val、Gly相關(guān)性較大,F(xiàn)2中相關(guān)性最大的是Trp,其次為GABA,F(xiàn)3與Orn、Cit相關(guān)性較大,F(xiàn)4與Met相關(guān)性最大。前4個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到78.19%,代表了37個(gè)品種中水解氨基酸的大部分信息。

        表7 水解氨基酸主成分的特征值及百分率Table 7 Eigenvalue of principal component and contribution rate of hydrolyzed amino acids

        表8 水解氨基酸主成分的成分矩陣Table 8 Principal component matric of hydrolyzed amino acids

        2.4 綜合評(píng)價(jià)

        游離和水解氨基酸的綜合平均得分均為0,其綜合評(píng)分大于0的品種分別如表9~10所示。由表9~10可知,揚(yáng)輻麥5號(hào)、寧麥0569和揚(yáng)麥28的游離氨基酸綜合得分較大程度上超過(guò)其他品種,說(shuō)明此3個(gè)品種游離氨基酸綜合質(zhì)量得分較高;揚(yáng)大180的水解氨基酸綜合得分較大程度超過(guò)其他品種,說(shuō)明此品種水解氨基酸的綜合質(zhì)量較高。

        表9 不同品種小麥游離氨基酸主成分因子和綜合得分Table 9 Principal component factors and quality evaluation for wheat gains of different varieties in free amino acids

        另外, 16個(gè)品種游離氨基酸綜合質(zhì)量得分高于平均水平,14個(gè)品種水解氨基酸的綜合質(zhì)量得分高于平均水平。揚(yáng)輻麥5號(hào)、揚(yáng)大180、揚(yáng)麥13、鎮(zhèn)麥168和望水白的游離和水解氨基酸綜合得分均大于平均水平,為氨基酸品質(zhì)較優(yōu)的品種。

        表10 不同品種小麥水解氨基酸主成分因子和綜合得分Table 10 Principal component factors and quality evaluation for wheat gains of different varieties inhydrolyzed amino acids

        3 結(jié)論與展望

        建立了同時(shí)測(cè)定小麥中19種氨基酸的LC-MS方法,比較了37個(gè)小麥品種中游離和水解氨基酸含量的差異,通過(guò)PCA進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)各個(gè)氨基酸組分之間既相互獨(dú)立又密切相關(guān),游離氨基酸提取的3個(gè)主成分、水解氨基酸提取的4個(gè)主成分均反映了原變量的78.19%以上的信息,是評(píng)價(jià)小麥氨基酸的特征指標(biāo)。37個(gè)品種中有16個(gè)品種游離氨基酸綜合質(zhì)量高于平均水平,14個(gè)品種水解氨基酸的綜合質(zhì)量高于平均水平,其中揚(yáng)輻麥5號(hào)、揚(yáng)大180、揚(yáng)麥13、鎮(zhèn)麥168和望水白的游離和水解氨基酸綜合得分均大于平均水平,為氨基酸品質(zhì)較優(yōu)的品種。我國(guó)小麥品種較多,種植范圍廣泛,可以進(jìn)一步加大樣本量并結(jié)合其他營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行綜合分析,為選擇優(yōu)質(zhì)品種提供更全面的理論依據(jù)。

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