時玉昌，沈 申，陳亞運，劉圣金，朱星宇,富瑩雪

(1.江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院 藥學(xué)院，江蘇 南京 211800；2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；3.江蘇省中醫(yī)院 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 制劑部，江蘇 南京 210029)

中藥金銀花為忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾或帶初開的花。金銀花藥用始載于《救荒本草》[1]，性味甘寒，歸肺、心、胃經(jīng)，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效，可用于治療癰腫疔瘡、外感風(fēng)熱及熱毒血痢等[2]。我國的金銀花資源豐富，除新疆維吾爾自治區(qū)東部、青海省和西藏自治區(qū)大部分地區(qū)、內(nèi)蒙古自治區(qū)西部和黑龍江省西南部外，廣布于全國其余各省區(qū)[3]。研究表明：金銀花中富含揮發(fā)油類、有機酸類、黃酮類等，這些成分與其中醫(yī)傳統(tǒng)功效密切相關(guān)[3-4]。金銀花還具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、降血脂和降血糖等現(xiàn)代藥理作用[3-7]。

金銀花于每年的夏初花開前采收，干燥，以表面黃白色或綠白色者為佳。采收后采用的傳統(tǒng)干燥方法主要是自然晾曬、烘干等產(chǎn)地加工方法。傳統(tǒng)干燥方法操作簡單、對設(shè)備要求低，但晾曬干燥受天氣影響大、耗時較長、程度不均一；烘干易造成金銀花顏色發(fā)生改變，有效成分(綠原酸、木犀草苷)含量降低，還會影響金銀花的藥性形成[8-9]。中藥材干燥加工是中藥材藥性與品質(zhì)形成不可缺少的環(huán)節(jié)，其科學(xué)合理性已被我國人民數(shù)百年的臨床實踐以及大量的現(xiàn)代科學(xué)研究所證明[10]。隨著中藥材臨床需求量的持續(xù)增加，中藥材正逐漸向工業(yè)化發(fā)展，現(xiàn)代干燥技術(shù)(如熱風(fēng)干燥、紅外干燥、微波干燥和冷凍干燥等)不斷被應(yīng)用于中藥材產(chǎn)地加工中[11]，如黨參可采用紅外干燥法[12]，枸杞可采用微波干燥等[13]。

本文在前期的研究基礎(chǔ)上，對金銀花主產(chǎn)地進行調(diào)研，選取適宜采收期采收的金銀花為實驗材料，結(jié)合金銀花藥材和現(xiàn)代干燥設(shè)備的特點，對金銀花藥材的不同干燥方法及條件進行研究。在此基礎(chǔ)上以與金銀花中醫(yī)功效密切相關(guān)的有機酸類化合物綠原酸、異綠原酸C，黃酮類化合物蘆丁、木犀草苷[3-4]共4種化合物為指標(biāo)性化學(xué)成分，綜合性狀外觀，得出金銀花藥材最優(yōu)干燥加工方法，以期為金銀花現(xiàn)代干燥加工方法的建立與推廣提供技術(shù)支撐，促進金銀花產(chǎn)地加工的規(guī)范化與規(guī)模化發(fā)展，并為金銀花資源的循環(huán)利用提供理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

DHG-9240A型電熱鼓風(fēng)干燥機，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SAK-W04805型中短波紅外干燥機，泰州圣泰科紅外科技有限公司；YZWS-12型隧道式微波干燥機、YZWS-CT-12型微波真空干燥機，南京研正微波設(shè)備廠；TRC2020P50-600型高壓電場干燥機，大連泰思曼科技有限公司；800Y型高速中藥材粉碎機，永康市鉑歐儀器有限公司；Waters 2695型高效液相色譜系統(tǒng)、Waters 2998型PDA檢測器、Empower數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，美國沃特世公司；ML204/02、MS205型電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；PMB53型艾德姆水分測定儀，南京溫諾儀器設(shè)備有限公司；EPED超純水系統(tǒng)，南京易普達易科技發(fā)展有限公司；KQ-250E型超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；Anke GL-16GII型離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實驗材料

金銀花新鮮藥材(批號：20170514)，采于江蘇南京浦口區(qū)江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院中草藥產(chǎn)學(xué)研基地，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)劉圣金教授鑒定為忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.) 的干燥花蕾或帶初開的花，樣品標(biāo)本保存于本實驗室。

對照品綠原酸(批號：LYS20160819)、異綠原酸C(批號：YLYS20160703)、蘆丁(批號：LD20160509)、木犀草苷(批號：MXCG20160722)，南京春秋有限公司。超純水為自制，分析純甲醇，南京南化有限公司；色譜純乙腈，美國天地公司；色譜純甲酸，德國默克公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 干燥實驗

金銀花藥材采用不同干燥方法及干燥條件(每批次取新鮮金銀花1 kg)，具體見表1，不同的加工方法以序號1～45分別標(biāo)記表示。金銀花至含水率降低到質(zhì)量分數(shù)為12%左右停止，取出后包裝，于低溫儲藏。

表1 金銀花的干燥加工方法Table 1 Information of drying methods carried out on L.japonica

1.3.2 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取45批樣品粉末1.0 g，置于100 mL具塞錐形瓶，準(zhǔn)確移取體積分數(shù)為30%的甲醇溶液50 mL，常溫下靜置30 min。100 Hz、25 ℃超聲提取45 min，干燥后稱質(zhì)量，加體積分數(shù)為30%的甲醇補足失質(zhì)量。取上清，13 000 r/min離心10 min后，通過0.22 μm濾膜，即得供試品溶液。

1.3.3 對照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱定對照品，加入體積分數(shù)為30%的甲醇，配得綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸C質(zhì)量濃度分別為0.257、0.166、0.513、0.224 mg/mL的混合對照品溶液，稀釋備用。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：BDS HYPERSIL C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：體積分數(shù)為0.3%的甲酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫為0～25 min，體積分數(shù)5%～45%(A);25～27 min，體積分數(shù)45%～90%(A);27～28 min，體積分數(shù)90%(A);30～32 min，體積分數(shù)90%～5%(A)。流速：1 mL/min，柱溫：30 ℃，進樣量：10 μL，檢測波長：254 nm。

1.3.5 線性范圍的考察

按照1.3.3項要求，準(zhǔn)確移取一系列混合對照品溶液，再按1.3.4項要求進樣，記錄4種指標(biāo)成分色譜峰峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)信噪比計算檢測限(LOD)、定量限(LOQ)。

1.3.6 精密度試驗

按照1.3.3項要求，準(zhǔn)確移取對照品溶液10 μL，再按1.3.4項的要求，于1 d內(nèi)連續(xù)進樣6次以及于連續(xù)3 d內(nèi)重復(fù)進樣6次，記錄4種指標(biāo)成分峰面積，計算4種指標(biāo)成分的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.3.7 穩(wěn)定性試驗

按1.3.2項要求，準(zhǔn)確量取樣品6份(同一批)制備供試品溶液，再按1.3.4項要求在0、3、6、9、12、24 h進樣，記錄4種指標(biāo)成分峰面積，計算4種指標(biāo)成分的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.3.8 重復(fù)性試驗

按1.3.2項要求，準(zhǔn)確量取樣品6份(同一批)制備供試品溶液，再按1.3.4項連續(xù)進樣，記錄4種指標(biāo)成分峰面積，計算4種指標(biāo)成分峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.3.9 加樣回收率試驗

按照1.3.2項要求，準(zhǔn)確量取6份已知質(zhì)量分數(shù)的樣品，制備供試品溶液，再分別加入一定量對照品，按照1.3.4項的步驟進樣，記錄4種指標(biāo)成分峰面積，計算加樣回收率。

1.3.10 樣品指標(biāo)成分含量的測定

按照1.3.2項要求，制備所有樣品供試品溶液，按照1.3.4項的步驟進樣，記錄4種指標(biāo)成分峰面積，計算樣品中4種指標(biāo)成分含量(扣除水分，按干燥品計算)。

1.3.11 逼近理想值排序法(TOPSIS分析法)

為全面解釋45種干燥加工方法與4種指標(biāo)成分之間的相互關(guān)系，本研究應(yīng)用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對45批不同干燥加工樣品中的4種指標(biāo)成分組成以35×11矩陣進行TOPSIS分析[14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品性狀及含水率的測定結(jié)果

45批不同加工方法金銀花樣品主要的外觀性狀特征及含水率結(jié)果見表2。由表2結(jié)果可知：陰干、紅外控溫干燥、高壓電場干燥所得金銀花樣品性狀外觀較差。熱風(fēng)控溫干燥溫度越低，所得金銀花樣品性狀外觀越好。熱風(fēng)變溫干燥第二段溫度較高時，性狀外觀較差。微波真空干燥和經(jīng)殺青的金銀花樣品性狀外觀均較好。

表2 不同加工方法的金銀花中主要的外觀性狀和含水率結(jié)果Table 2 Main appearance characters and water content results of samples after different drying methods

2.2 高效液相色譜圖結(jié)果

對照品及樣品的HPLC色譜圖見圖1，如圖1所示：1號峰為綠原酸，2號峰為蘆丁，3號峰為木犀草苷，4號峰為異綠原酸C。

圖1 金銀花對照品(a)、金銀花藥材(b)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of reference solution (a) and test solution (b)

2.3 線性關(guān)系的考察結(jié)果

綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸C 4種指標(biāo)成分線性關(guān)系考察結(jié)果見表3。由表3可知：4種指標(biāo)成分在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可用于準(zhǔn)確定量。

表3 4種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍Table 3 The linear equations of 4 kinds of references

2.4 方法學(xué)的考察結(jié)果

綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸C 4種指標(biāo)成分的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率結(jié)果見表4。由表4可知：本實驗建立的方法具有良好的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率。

表4 4種成分的HPLC分析精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及加樣回收率試驗結(jié)果Table 4 The precision,repeatability,stability and recovery of 4 kinds of references

2.5 樣品指標(biāo)成分含量的測定結(jié)果

45批不同加工方法金銀花樣品中綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸C 4種指標(biāo)成分含量結(jié)果見表5。由表5結(jié)果可知：不同加工方法對金銀花中4種指標(biāo)成分含量影響較大；蒸氣殺青120 s，熱風(fēng)控溫60 ℃所得金銀花樣品中的綠原酸含量最高；陰干所得金銀花樣品中的蘆丁含量最高；蒸氣殺青60 s，熱風(fēng)控溫60 ℃所得樣品木犀草苷含量最高；微波殺青60 s，微波干燥80 ℃所得樣品異綠原酸C含量最高。隨著熱風(fēng)控溫干燥加工的溫度降低，金銀花樣品中4種指標(biāo)成分含量增加。紅外控溫和高壓電場干燥加工金銀花樣品中的4種指標(biāo)成分最低，因此，此兩種方法不適宜直接用于金銀花干燥加工。在70 ℃下，微波真空干燥加工金銀花樣品中4種指標(biāo)成分含量最高，熱風(fēng)控溫干燥其次。在40、50 ℃下，熱風(fēng)控溫干燥加工金銀花樣品4種指標(biāo)成分含量最高。殺青后干燥所得金銀花樣品中的4種指標(biāo)成分的含量顯著高于未殺青樣品。相同蒸氣殺青條件下，熱風(fēng)控溫干燥溫度越低，指標(biāo)成分的含量越高。相同溫度及蒸氣殺青時間，熱風(fēng)控溫干燥優(yōu)于紅外控溫干燥。相同溫度及微波殺青時間，紅外控溫干燥優(yōu)于熱風(fēng)控溫干燥。相同干燥方法及殺青時間，蒸氣殺青優(yōu)于微波殺青。

表5 不同加工方法的金銀花中4種指標(biāo)成分的含量測定結(jié)果Table 5 The contents of 4 investigated compounds in samples after different drying mothods

2.6 逼近理想值排序法(TOPSIS分析法)結(jié)果

逼近理想值排序法(TOPSIS分析法)結(jié)果見表6。由表6可知：前7位按照優(yōu)劣順序排序：蒸氣殺青60 s、熱風(fēng)控溫60 ℃，蒸氣殺青30 s、熱風(fēng)控溫60 ℃，微波殺青60 s、微波真空80 ℃，蒸氣殺青120 s、熱風(fēng)控溫60 ℃，微波殺青60 s、微波干燥80 ℃，蒸氣殺青120 s、紅外控溫60 ℃，蒸氣殺青60 s、紅外控溫60 ℃，這些方法均能較大地保留金銀花中綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸C成分；殺青(蒸氣殺青、微波殺青)后聯(lián)合其他干燥技術(shù)有利于4種指標(biāo)成分的保留；現(xiàn)代干燥方法(殺青聯(lián)合其他干燥技術(shù))排序顯著優(yōu)于傳統(tǒng)干燥方法(陰干)，且加工所得樣品的性狀外觀更好、干燥速率更快，說明現(xiàn)代干燥技術(shù)為金銀花適宜干燥方法。

由表6可以得出：經(jīng)殺青后加工所得的金銀花樣品的排序處在前列，顯著優(yōu)于沒有殺青的干燥加工方法。且結(jié)合表4中各加工樣品的性狀外觀可看出，經(jīng)殺青后的金銀花藥材更符合“表面黃白色或綠白色者為佳”的性狀外觀評價指標(biāo)。殺青過程是依靠特定條件(如蒸氣、微波)產(chǎn)生的瞬間高溫使新鮮植物、藥材中的各種類型生物酶失去活性，從而抑制發(fā)生在對應(yīng)化學(xué)成分之間的酶促氧化反應(yīng)、水解反應(yīng)等。殺青對花類藥材藥性及品質(zhì)的形成有著不可代替的作用，如防止多酚類物質(zhì)氧化、花瓣變色，保持性狀外觀特征、提高品質(zhì)和增強功效。

表6 不同干燥方法的金銀花樣本的正理想解、負理想解、歐氏貼近度與排序Table 6 The positive ideal solution,negative ideal solution,euclidean closeness and ranking of samples after different drying methods

金銀花在干燥加工處理過程中發(fā)生顏色變化(褐變)以及與金銀花中醫(yī)功效密切相關(guān)的有機酸、黃酮類化合物的損失，主要原因是由于金銀花中的多酚氧化酶氧化其多酚類物質(zhì)(酶促反應(yīng))造成的，如綠原酸為金銀花的主要功效成分，綠原酸分子中的鄰位酚羥基，在多酚氧化酶作用下氧化縮合成高分子化合物，宏觀上造成了金銀花顏色的變化。傳統(tǒng)干燥過程中，升溫緩慢，增強了多酚氧化酶活性，從而加速了綠原酸氧化縮合過程，最終造成綠原酸含量降低；而經(jīng)殺青的瞬間高溫使多酚氧化酶失活，抑制綠原酸的酶促反應(yīng)，從而保持了綠原酸含量和金銀花的性狀外觀特征。

金銀花中葉綠素的損失也可能造成其顏色的變化。干燥過程中，當(dāng)金銀花蕾在含水較高時，溫度升高時破壞細胞中的葉綠素，葉綠素含量的降低以及生成其他顏色的產(chǎn)物會直接影響金銀花的顏色。

3 結(jié)論

金銀花干燥加工是金銀花藥材的品質(zhì)及藥性形成的重要過程。本研究結(jié)果顯示：從得到樣品的性狀外觀特征來看，微波干燥、經(jīng)殺青后干燥和變溫干燥所獲得的金銀花性狀外觀符合金銀花藥材要求。從4種指標(biāo)成分含量來看，經(jīng)殺青過程后干燥效果較好，所得金銀花有效成分含量相對較高。本研究結(jié)果還表明：蒸汽殺青60 s、熱風(fēng)控溫60 ℃干燥的金銀花樣品質(zhì)量最優(yōu)。

本實驗結(jié)果可為金銀花現(xiàn)代干燥加工方法的建立與推廣提供支撐，促進金銀花產(chǎn)地干燥加工的規(guī)范化與規(guī)?；l(fā)展，為金銀花資源的循環(huán)利用提供理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)，也可為其他花類藥材的現(xiàn)代干燥加工研究提供借鑒。