徐 行，劉 珍，李 會(huì)，張曉梅，史勁松，陳杰鵬，段麗麗，許正宏

(1. 江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2. 廣東雙駿生物科技有限公司，廣東 汕頭 515071；3. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；4. 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122)

維生素K2(menaquinone，MK)是一系列具有葉綠醌活性的脂溶性維生素，為甲萘醌系列化合物，具有4～13個(gè)重復(fù)的異戊二烯單元，分別由MK-4至MK-13表示， MK-7為天然維生素K2，其生物活性最為顯著[1]。MK-7可以有效降低骨折以及一些心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[2]。此外，MK-7在臨床上還被廣泛應(yīng)用于抗凝血、抗肝癌、利尿及強(qiáng)化肝臟解毒等[3]，是人體中無法缺少的維生素之一。目前，合成維生素K2(MK-7)的方法包括化學(xué)法和生物法。其中，化學(xué)合成維生素K2(MK-7)類化合物的工藝較多，但存在多種限制因素：如缺乏前體物質(zhì)；反應(yīng)過程會(huì)產(chǎn)生較多副產(chǎn)物同時(shí)產(chǎn)生異構(gòu)體，從而導(dǎo)致產(chǎn)率低，并伴隨環(huán)境污染的問題；另外，化學(xué)法反應(yīng)生成的維生素K2(MK-7)活性都較低，因其側(cè)鏈的異戊二烯結(jié)構(gòu)多為順式結(jié)構(gòu)。而獲取活性較高的維生素K2(MK-7)主要由生物發(fā)酵法制得，且為全反式天然維生素K2。因此，能夠獲得活性較高的維生素K2的微生物發(fā)酵法日益受到重視。

近年來，已報(bào)道的生物法生產(chǎn)維生素K2(MK-7)的微生物有枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢菌(B.amyloliquefaciens)[4]和乳酸菌[5]等，而目前工業(yè)化理想的 MK-7 生產(chǎn)菌株是納豆芽孢桿菌(B.subtilisnatto)[6]。但利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)維生素K2(MK-7)的研究仍存在發(fā)酵濃度低、發(fā)酵周期較長(zhǎng)等問題。因此，要切實(shí)提高M(jìn)K-7的生物合成濃度，獲得性能優(yōu)越的菌株極為重要。常壓室溫等離子體(ARTP)誘變技術(shù)能夠產(chǎn)生具有高活性離子濃度的等離子體射流，并作用于微生物體誘發(fā)突變。ARTP具有安全無污染、活性離子濃度高、快速方便且操作可控性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[7]，如:王詩卉等[8]利用ARTP技術(shù)對(duì)解淀粉芽孢桿菌進(jìn)行ARTP誘變，獲得高效生產(chǎn)3-羥基丁酮的菌株；李光等[9]也通過ARTP對(duì)枯草芽孢桿菌的誘變獲得表面活性素(surfactin)高產(chǎn)菌株。而目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道利用ARTP技術(shù)對(duì)納豆芽孢桿菌進(jìn)行誘變選育從而獲得高產(chǎn)維生素K2(MK-7)的菌株。

筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期篩選獲得了一株產(chǎn)MK-7的納豆芽孢桿菌ND-1，但其產(chǎn)量較低，僅為20.76 mg/L。因此，本文中，筆者為了獲得高產(chǎn)維生素K2(MK-7)且傳代穩(wěn)定的生產(chǎn)菌株，以納豆芽孢桿菌ND-1為出發(fā)菌株，采用ARTP誘變技術(shù)進(jìn)行菌株誘變，并對(duì)培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為后續(xù)菌株的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

納豆芽孢桿菌BacillusnattoND-1，由本實(shí)驗(yàn)室篩選保藏。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30、蛋白胨40、NaCl 5、牛肉膏5、酵母膏5。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：甘油50、大豆蛋白胨189、酵母粉50、K2HPO40.06。

以上培養(yǎng)基都調(diào)pH至7.0～7.2[10]后滅菌備用。

1.2 方法

1.2.1 菌株的ARTP誘變及誘變時(shí)間選擇

挑取B.nattoND-1單菌落接種至種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取0.01 mL 菌液均勻地涂在金屬載片上，放入ARTP誘變系統(tǒng)操作室里，在功率100 W、通氣量為10 L/min條件下[11]分別誘變10、20、30、40和50 s。誘變結(jié)束后，用鑷子把金屬載片移至裝有1 mL培養(yǎng)基的EP管里培養(yǎng)3～4 h，培養(yǎng)結(jié)束后分別稀釋涂布并計(jì)數(shù)，計(jì)算誘變致死率，確定最佳誘變時(shí)間。在最佳誘變處理時(shí)間下，對(duì)納豆芽孢桿菌進(jìn)行ARTP誘變操作。

1.2.2 1-羥基-2-萘甲酸(HNA)最適篩選濃度的確定及初篩

初篩采取平板篩選法。HNA是MK-7合成過程中萘醌骨架1，4-二羥基-2-萘甲酸(DNHA)的結(jié)構(gòu)類似物[12]，因此可以采用抗結(jié)構(gòu)類似物平板法進(jìn)行菌株篩選。將誘變后的菌液進(jìn)行稀釋涂布得到各突變菌落，選取100個(gè)突變菌株在種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)后，分別在含梯度質(zhì)量濃度(50、60、70、80和90 mg/L)HNA的平板上點(diǎn)涂，根據(jù)在各濃度HNA平板上存活的菌株數(shù)量計(jì)算其篩選效率，從而選擇最適的HNA篩選濃度。

將誘變后菌液稀釋涂布在含最適HNA濃度的平板上，培養(yǎng)得到數(shù)個(gè)單菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)并保存?zhèn)溆?，進(jìn)一步通過發(fā)酵驗(yàn)證進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.3 誘變菌株的復(fù)篩

將初步篩選后得到的菌株接至種子培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h后，按1.0%的體積比接入發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)5 d后測(cè)定MK-7濃度，每個(gè)菌株做3個(gè)重復(fù)，篩選優(yōu)勢(shì)突變株并保存菌株，進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)突變株的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.4 搖瓶發(fā)酵初始條件

將誘變選育得到的菌株接種至種子培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h后得種子液，按體積比為1.0%的接種量接入裝有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角燒瓶中，在37 ℃條件下靜置培養(yǎng)5 d后得發(fā)酵液。

1.2.5 產(chǎn)物提取

配制萃取液——異丙醇-正己烷溶液(體積比1∶ 2)[13]，準(zhǔn)確量取1 mL待測(cè)發(fā)酵液，用等體積的萃取劑萃取，劇烈振蕩2 min后8 000 r/min離心1 min，取上層有機(jī)相，重復(fù)同樣步驟萃取3次，離心取上清液。3次萃取上清液合并。得發(fā)酵液提取物數(shù)毫升置于2 mL離心管中，靜置風(fēng)干待用。

1.2.6 分析方法

采用高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)產(chǎn)物，用色譜純甲醇復(fù)溶上述產(chǎn)物后，用0.22 μm的有機(jī)膜過濾除雜。色譜柱為Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇，柱溫為40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL[14]。

1.2.7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化培養(yǎng)基組分

根據(jù)初始培養(yǎng)基設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別配制發(fā)酵培養(yǎng)基。以1.0%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)液中，37 ℃靜置培養(yǎng)5 d。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定最優(yōu)培養(yǎng)基配方。

1.2.8 發(fā)酵條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

以初始發(fā)酵條件為基礎(chǔ)，采用優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基，采用單因素優(yōu)化方法，分別測(cè)定不同接種量(1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%)、發(fā)酵溫度(32、36、40、44和48 ℃)和搖床轉(zhuǎn)速(0、20、40、60、80和100 r/min)對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)維生素K2(MK-7)的影響。優(yōu)化時(shí)，每一因素的優(yōu)化均在前一因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上進(jìn)行，且其他條件不變。

2 結(jié)果與討論

2.1 高產(chǎn)維生素K2(MK-7)的納豆芽孢桿菌的ARTP誘變

2.1.1 ARTP誘變的致死率

將納豆芽孢桿菌BacillusnattoND-1經(jīng)不同時(shí)間的ARTP誘變后進(jìn)行再培養(yǎng)并計(jì)算其致死率，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，菌體致死率隨ARTP誘變時(shí)間的增加不斷提高。當(dāng)照射時(shí)間為40 s時(shí)，菌體致死率已達(dá)到98.0%左右，但當(dāng)誘變時(shí)間為50 s時(shí)，菌體幾乎全部致死存活。參照文獻(xiàn)[15]報(bào)道等離子誘變?cè)谥滤缆矢哂?5%時(shí)易發(fā)生正向突變的結(jié)果，故選擇40 s為最佳誘變時(shí)長(zhǎng)。

圖1 不同誘變時(shí)間條件下菌體的致死率Fig.1 Lethality of the cells in different mutagenic time

2.1.2 誘變菌株的篩選

由于HNA為MK-7合成過程中萘醌骨架1，4-二羥基-2-萘甲酸(DNHA)的結(jié)構(gòu)類似物，因此可以采用抗結(jié)構(gòu)類似物平板法進(jìn)行菌株篩選。設(shè)置HNA濃度梯度進(jìn)行篩選，得不同濃度HNA條件下對(duì)菌株的篩選效率，結(jié)果見表1。由表1可知：當(dāng)HNA用量為50～80 mg/L時(shí)，篩選效率低；當(dāng)HNA用量達(dá)到90 mg/L時(shí)，對(duì)菌落的生長(zhǎng)產(chǎn)生了較高壓力，篩選效率達(dá)到95%以上。因此，選用90 mg/L為HNA篩選質(zhì)量濃度。將經(jīng)誘變后的菌液稀釋后涂布在含90 mg/L濃度的HNA平板上，最終得到32株經(jīng)過高濃度HNA抗性平板篩選的突變菌株。

表1 不同濃度HNA條件下的菌株篩選率Table 1 Screening efficiency under different HNA dosage

將經(jīng)過高濃度HNA抗性篩選后得到的32株菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并經(jīng)過搖瓶靜置發(fā)酵后檢測(cè)MK-7的產(chǎn)量，結(jié)果見圖2。由圖2可知，經(jīng)過ARTP誘變后的突變菌株ND-1-A27，該突變菌株發(fā)酵產(chǎn)MK-7可達(dá)到(48.05±3.81) mg/L，比原始菌株ND-1產(chǎn)MK-7能力提高了約60%。

注：無轉(zhuǎn)化能力的誘變菌株編號(hào)未顯示圖2 誘變菌株產(chǎn)MK-7能力Fig.2 MK-7 yield of mutagenized strain

2.1.3 突變菌株的傳代穩(wěn)定性

將突變株ND-1-A27進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以考察其遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果見圖3。由圖3可知，經(jīng)過連續(xù)5代的培養(yǎng)，MK-7的產(chǎn)量為45.16～48.95 mg/L，表明該突變株ND-1-A27的遺傳穩(wěn)定性好，可以作為優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行后續(xù)的研究。

圖3 突變菌株ND-1-A27的遺傳穩(wěn)定性Fig.3 Genetic stability of mutant strain ND-1-A27

2.2 突變菌株的發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.2.1 培養(yǎng)基組分的優(yōu)化

培養(yǎng)基的組分，尤其是碳氮源對(duì)微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)物生成具有重要的影響。本實(shí)驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上對(duì)培養(yǎng)基組分中碳氮源設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，以MK-7濃度為指標(biāo)，選用L9(33)正交表進(jìn)行培養(yǎng)基的進(jìn)一步優(yōu)化，并進(jìn)行極差分析，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，正交試驗(yàn)的極差分析結(jié)果見表3。

由表3可知，甘油濃度對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的形成影響最為顯著，然后依次是大豆蛋白胨、K2HPO4、酵母粉。正交試驗(yàn)得到的理論最適培養(yǎng)基中碳氮源組合為A3B2C1D2，即甘油70 g/L、大豆蛋白胨180 g/L、酵母粉30 g/L、K2HPO40.06 g/L，在此條件下MK-7產(chǎn)量最高。本研究對(duì)以上理論最適培養(yǎng)基組分進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表明，在該最適條件下，MK-7的平均產(chǎn)量為(52.21±1.57) mg/L,從而證明該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信。

表3 正交試驗(yàn)的極差分析Table 3 Range analysis of orthogonal experiments

2.2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

在以上最適培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，對(duì)初始培養(yǎng)條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。因?yàn)橛绊懢S生素K2(MK-7)的培養(yǎng)條件包括接種量、發(fā)酵溫度及培養(yǎng)方式等，因此在搖瓶中分別對(duì)其優(yōu)化，結(jié)果如圖4～6所示。

圖4 接種量對(duì)MK-7濃度的影響Fig.4 Effects of inoculum on MK-7 yield

由圖4可知：當(dāng)接種量小于2%時(shí)，MK-7產(chǎn)量較低；當(dāng)接種量為2%時(shí)，MK-7產(chǎn)量達(dá)到最高；當(dāng)接種量高于2%時(shí)，MK-7產(chǎn)量隨接種量的增加而逐漸下降。這表明突變菌株ND-1-A27的最適接種量為2%。

在最適接種量為2%的基礎(chǔ)上對(duì)發(fā)酵溫度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知：當(dāng)發(fā)酵溫度低于40 ℃時(shí)，MK-7產(chǎn)量隨著溫度的升高而增加；當(dāng)發(fā)酵溫度為40 ℃時(shí)，突變菌株MK-7產(chǎn)量最高；發(fā)酵溫度高于40 ℃后，MK-7產(chǎn)量隨溫度的增加而逐漸下降，表明突變菌株ND-1-A27最適發(fā)酵培養(yǎng)溫度為40 ℃。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)MK-7濃度的影響Fig.5 Effects of temperature on MK-7 yield

在上述接種量及溫度優(yōu)化的基礎(chǔ)上考察搖床轉(zhuǎn)速對(duì)MK-7產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖6。由圖6可知，當(dāng)靜置發(fā)酵時(shí)，MK-7產(chǎn)量最高，達(dá)到(53.31±3.17)mg/L。而隨著轉(zhuǎn)速的增加，MK-7的產(chǎn)量下降。而且發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵結(jié)束時(shí)靜置培養(yǎng)中芽孢形成率高達(dá)93.4%，而轉(zhuǎn)速提高到100 r/min時(shí)芽孢形成率僅為75.7%，由此可見靜態(tài)培養(yǎng)更有利于芽孢的形成。而Farrand等[16]研究發(fā)現(xiàn)，維生素K2(MK-7)的生產(chǎn)與菌體內(nèi)芽孢的形成呈正相關(guān)，因此，MK-7的生產(chǎn)的最適培養(yǎng)方式為靜置培養(yǎng)。

圖6 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)MK-7濃度的影響Fig.6 Effects of shaker speed on MK-7 yield

2.2.3 突變菌株的發(fā)酵過程曲線

經(jīng)過對(duì)高產(chǎn)突變菌株的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化后，確定了突變株ND-1-A27的最適發(fā)酵工藝，即甘油70 g/L、大豆蛋白胨180 g/L、酵母粉30 g/L、K2HPO40.06 g/L，種子液接種量2%，發(fā)酵溫度40 ℃，靜置發(fā)酵。將突變株ND-1-A27在上述優(yōu)化后培養(yǎng)工藝下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)6 d，連續(xù)取樣，測(cè)定菌體干質(zhì)量以及MK-7的產(chǎn)量變化，得到圖7發(fā)酵過程曲線。由圖7可知：在0～3 d時(shí)，菌體快速生長(zhǎng)，培養(yǎng)基中的碳源甘油被快速利用，且MK-7隨著菌體的生長(zhǎng)快速積累；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，到第4～5天時(shí)菌體生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定，幾乎不再繼續(xù)增長(zhǎng)，甘油消耗較慢直至消耗完全，但MK-7仍繼續(xù)積累至第5天達(dá)到最高值(53.88±2.03)mg/L并保持穩(wěn)定。

圖7 ND-1-A27發(fā)酵過程中MK-7濃度及生物量變化情況Fig.7 MK-7 yield and biomass changes of ND-1-A27 during the fermentation process

3 結(jié)論

以實(shí)驗(yàn)室篩選保存的納豆芽孢桿菌BacillusnattoND-1為出發(fā)菌株，采用等離子誘變技術(shù)(ARTP)對(duì)菌株進(jìn)行誘變選育及發(fā)酵工藝優(yōu)化?？疾炝瞬煌瑵舛菻NA對(duì)突變菌株的篩選效率，確定了含90 mg/L HNA的平板具有較好的篩選效率，達(dá)到95%以上。通過含90 mg/L HNA平板對(duì)誘變菌株的初步篩選，成功獲得了1株遺傳穩(wěn)定性良好，且能高效發(fā)酵生產(chǎn)MK-7的突變菌株ND-1-A27，其生產(chǎn)MK-7的產(chǎn)量為48.05 mg/L，比原始菌株提高了約60%。接著對(duì)突變菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了正交試驗(yàn)優(yōu)化，確定了最優(yōu)培養(yǎng)基為甘油70 g/L、大豆蛋白胨180 g/L、酵母粉30 g/L、K2HPO40.06 g/L。此外確定了最佳的接種量為2%，最佳發(fā)酵溫度為40 ℃，最適發(fā)酵條件為靜置發(fā)酵。優(yōu)化后發(fā)酵生產(chǎn)MK-7的產(chǎn)量達(dá)到(53.88±2.03) mg/L。

本研究對(duì)維生素K2(MK-7)高產(chǎn)菌株的誘變選育具有一定的參考意義，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。當(dāng)前對(duì)該菌株產(chǎn)維生素K2(MK-7)的機(jī)制研究在進(jìn)行之中，通過采用代謝工程手段進(jìn)一步提高菌株ND-1-A27生產(chǎn)維生素K2(MK-7)能力的研究是我們今后工作的方向。后續(xù)研究希望通過進(jìn)一步的菌株改造及放大培養(yǎng)，為MK-7工業(yè)化生產(chǎn)，創(chuàng)造更大的價(jià)值。