王偉穎，葛 佳，蘇志國，馬光輝，鄭永祥，郝冬霞，余 蓉

(1. 四川大學(xué) 華西藥學(xué)院 靶向藥物及釋藥系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實驗室，四川 成都 610041; 2. 中國科學(xué)院 過程工程研究所 生化工程國家重點(diǎn)實驗室，北京 100190; 3. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

工業(yè)上，常常使用Protein A親和層析技術(shù)純化抗體，但Protein A親和介質(zhì)具有價格昂貴、易從基質(zhì)上脫落及使用壽命短等缺陷[1-2]，而抗體多肽親和配基具有價格低廉、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的優(yōu)勢[3]，因此開發(fā)抗體親和性多肽以取代Protein A親和介質(zhì)是非常熱門的研究課題。目前對于抗體親和性多肽的開發(fā)和篩選多采用噬菌體展示[4-5]、組合化學(xué)庫[6]和分子模擬等技術(shù)手段[7]，這些方法具有篩選周期長、篩選范圍大、無法真實反映溶液中配基與蛋白相互作用的缺陷。

核磁共振飽和轉(zhuǎn)移差異差譜(STD-NMR)技術(shù)可以用于在溶液狀態(tài)下篩選能與大分子蛋白結(jié)合的小分子配基，并且可以通過表位分析確定小分子配基上與蛋白結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)信息[8-11]。因此，本文中，筆者以Protein A為目標(biāo)，通過定向設(shè)計Protein A仿生多肽片段，利用STD-NMR技術(shù)在真實色譜環(huán)境下篩選能與抗體結(jié)合的多肽配基，在原子水平上評價多肽與抗體的結(jié)合機(jī)制，并將篩選到的多肽配基固定在瓊脂糖基質(zhì)上制備出多肽介質(zhì)，通過靜態(tài)吸附試驗評價篩選出的多肽配基結(jié)合抗體的能力。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

600 MHz液體核磁共振光譜儀(低溫探頭)，布魯克公司；752型紫外分光光度計，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；ZKSY型恒溫水浴鍋，鞏義市英峪儀器廠；XSE104型電子分析天平，Mettler Toledo公司；PHS-220B型pH計，上海三信儀器有限公司。

多肽配基(95%純度)，吉爾生化(上海)有限公司；人抗體 (hIgG，95%純度)，Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA,98%純度)，北京欣經(jīng)科生物制品有限公司；重水(D2O)，Cambridge Isotope Laboratories Inc.；瓊脂糖微球Sepharose 4FF，美國GE Healthcare公司；其他化學(xué)試劑均為市售分析純。

1.2 STD-NMR實驗

所有的STD-NMR實驗均在25 ℃、脈沖序列為“STDDIFFGP19.3”的條件下進(jìn)行，并且使用WATERSUP進(jìn)行水峰的壓制。本實驗用的緩沖液為20 mmol/L磷酸緩沖液，溶劑是重水(D2O)，不同多肽配基溶解在上述的磷酸緩沖液中，配基的終濃度為1.25 mmol/L，終體積為500 μL，在離心管中充分溶解后，轉(zhuǎn)移到直徑5 mm的核磁管中備用。

1.3 吸附等溫線的測定

采用環(huán)氧活化的方式將六肽FYEILH固定在瓊脂糖4FF微球上制備出六肽FYEILH親和介質(zhì)[12]，將此親和介質(zhì)依次用去離子水和結(jié)合緩沖液充分洗滌，抽干，然后稱取 20 mg抽干介質(zhì)與 2.0 mL蛋白溶液(0.2～4.0 mg/mL，結(jié)合緩沖液溶解)混合，在25 ℃、140 r/min條件下吸附4 h后，將吸附體系在4 000 r/min條件下離心5 min 后收集上清液，在280 nm處用紫外分光光度計測上清液的吸光值以確定上清液中蛋白質(zhì)量濃度(ρ)，進(jìn)而根據(jù)物料守恒原則即可確定配基的吸附容量(式(1))，然后應(yīng)用 Langmuir 模型(式(2))描述吸附等溫線，確定配基的飽和吸附載量qs和解離常數(shù)。

(1)

式中：q為吸附容量，mg/mL；ρ0為初始蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL；ρ為吸附平衡時上清液中蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL；Vl為吸附前加入蛋白的體積，mL；Vs為介質(zhì)體積，mL。

(2)

式中：qm為飽和吸附載量，mg/mL；Kd為解離常數(shù)，mg/mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 親和配基精準(zhǔn)篩選技術(shù)的建立——照射位點(diǎn)的選擇

進(jìn)行STD-NMR實驗時，需要選擇2個照射位點(diǎn)，其中一個為既遠(yuǎn)離大分子又遠(yuǎn)離小分子的非選擇性照射位點(diǎn)，另一個為只有大分子沒有小分子的選擇性照射位點(diǎn)，選擇性照射位點(diǎn)的最優(yōu)化選擇是在沒有抗體存在時，單獨(dú)配基溶液不會產(chǎn)生STD信號，以防產(chǎn)生假陽性的實驗結(jié)果。由于本研究中使用的多肽配基信號比較廣泛，且不同肽段的氨基酸組成不同，質(zhì)子的化學(xué)偏移也不同，因此，為了排除因照射位點(diǎn)的選擇不當(dāng)而引起的假陽性，需要對照射位點(diǎn)進(jìn)行一系列的優(yōu)化。

圖1顯示了不同長度、不同氨基酸組成的多肽在不同選擇性照射位點(diǎn)下的STD圖譜，并將這些多肽在不同選擇性照射位點(diǎn)下呈現(xiàn)的陽性和假陽性的實驗結(jié)果列于表1中。由圖1和表1可知，不同長度、不同組成的多肽有自身的適宜的選擇性照射位點(diǎn)，從照射位點(diǎn)的優(yōu)化結(jié)果可以看出，最佳選擇性照射位點(diǎn)的位置不僅與多肽配基的長短有關(guān)，也與配基質(zhì)子的化學(xué)位移δ有關(guān)。因此在選擇照射位點(diǎn)的位置時，其與配基質(zhì)子之間的距離(δ)至少為1；對于大于6個氨基酸的多肽，其選擇性照射位點(diǎn)的位置與配基質(zhì)子之間的距離δ要大于1。此外，選擇性照射位點(diǎn)的位置在滿足不會使多肽配基產(chǎn)生假陽性的基礎(chǔ)上，還應(yīng)該盡可能靠近大分子蛋白的位置，同時由于抗體在δ為1處仍然具有質(zhì)子信號，所以，在本文中選擇的選擇性照射位點(diǎn)的位置多在δ為1處。

A～E—多肽在不同選擇性照射位點(diǎn)下的STD圖譜；F—多肽的氫譜1H NMR圖1 不同多肽的核磁共振譜圖Fig.1 1H NMR spectra of the peptides of different lengths

表1 各種肽段的陽性和假陽性位點(diǎn)Table 1 Positive and false positive selective irradiation for various peptides

2.2 Protein A仿生多肽親和配基的設(shè)計和篩選

晶體衍射結(jié)果表明Protein A主要通過其前2個螺旋與抗體結(jié)合[13-14]，因此根據(jù)Protein A的 domain B前2個α螺旋上的氨基酸組成進(jìn)行定向設(shè)計，分別合成了KEQQNA、FYEILH、EEQRNG和FIQSLKD這4個肽段(圖2)。將STD-NMR技術(shù)用于檢測這些肽段與抗體的結(jié)合能力，并用STD factor來評價肽段和抗體的親和力強(qiáng)弱(STD factor=ISTD/Io×Eligand。其中，ISTD指的是STD譜上與抗體結(jié)合的配基質(zhì)子的信號強(qiáng)度，Io是off譜上對應(yīng)的配基質(zhì)子的信號強(qiáng)度，Eligand是配基與抗體的濃度比，在本實驗中使用的配基與抗體的濃度比為100)，STD factor值越大表明配基與抗體的親和性越強(qiáng)。圖3(a)顯示了合成的4個多肽配基在不同pH條件下與抗體結(jié)合的STD factor值，從實驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)六肽FYEILH在pH 6.0條件下與抗體親和性最強(qiáng)，大于其余多肽在各個pH下的結(jié)合強(qiáng)度。圖3(b)展示了六肽FYEILH與文獻(xiàn)中報道的具有最高載量多肽配基YFRH與抗體結(jié)合STD factor的值的比較，結(jié)果顯示六肽FYEILH與抗體的親和性高于目前文獻(xiàn)中報道的具有最高載量多肽配基YFRH。由此可見，多肽FYEILH具有發(fā)展成為抗體親和配基的潛力。

圖2 Protein A的B結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列和SpA-hIgG1 復(fù)合物的初始構(gòu)象(PDB：1FC2)Fig.2 Sequence alignment of domain B of Protein A and initial conformation of the SpA-hIgG1 complex (PDB:1FC2)

圖3 Protein A上4個多肽配基在不同pH條件下STD factor及四肽YFRH和六肽FYEILH的抗體親和性Fig.3 STD factor of four peptides from Protein A at different pH,and the binding capacity between YFRH-hIgG and FYEILH-hIgG

2.3 仿生多肽親和配基與抗體結(jié)合機(jī)制的探究

STD-NMR技術(shù)中的重要參數(shù)STD effect (ISTD/I0)能夠在原子水平上考察多肽配基與抗體結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)信息。STD effect值代表了多肽上不同質(zhì)子距離抗體的遠(yuǎn)近，STD effect值越大，表明質(zhì)子與抗體距離越近，與抗體的親和力越強(qiáng)，其在多肽與抗體的結(jié)合中發(fā)揮著越重要的作用，當(dāng)某一質(zhì)子的STD effect大于10%時，則表明該質(zhì)子與抗體具有明顯的相互作用[10]。圖4為六肽KEQQNA的結(jié)構(gòu)式以及其與抗體反應(yīng)后的STD圖譜。由圖4可知：六肽KEQQNA上的賴氨酸(K)側(cè)鏈的ε質(zhì)子具有最大的STD effect值，表明賴氨酸(K)側(cè)鏈中的氨基通過靜電作用與抗體結(jié)合；除此之外，位于丙氨酸(A)側(cè)鏈的脂肪族質(zhì)子，與抗體也具有相對較近的距離(STD effect為25%)，其通過疏水作用參與與抗體的結(jié)合。由此可知，六肽KEQQNA在與抗體的相互作用中占主導(dǎo)地位的為靜電相互作用，其次為疏水相互作用。

圖4 六肽KEQQNA的結(jié)構(gòu)及其與抗體反應(yīng)的STD圖譜Fig.4 Structural formula of hexapeptide KEQQNA and 1D STD-NMR spectrum with spin-lock pulse of KEQQNA in the presence of human IgG

圖5為六肽FYEILH的結(jié)構(gòu)式以及其與抗體反應(yīng)后的STD圖譜。由圖5可知：六肽FYEILH中谷氨酸(E)側(cè)鏈羧基的質(zhì)子具有最大的STD effect值，表明谷氨酸(E)側(cè)鏈羧基通過靜電作用主導(dǎo)六肽FYEILH與抗體的結(jié)合；除此之外，亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)以及酪氨酸(Y)上的脂肪族和芳香族質(zhì)子與抗體也具有相對較近的距離，其通過疏水作用參與與抗體的結(jié)合。由此可知，六肽FYEILH在與抗體的相互作用中占主導(dǎo)地位的為靜電相互作用，其次為疏水相互作用。

圖6為六肽EEQRNG的結(jié)構(gòu)式以及其與抗體反應(yīng)后的STD圖譜。由圖6可知：六肽EEQRNG中的精氨酸(R)側(cè)鏈的δ質(zhì)子具有最大的STD effect值，表明六肽EEQRNG與抗體的結(jié)合主要是由精氨酸(R)側(cè)鏈上的氨基通過靜電相互作用和氫鍵驅(qū)動的；此外，位于甘氨酸(G)上的質(zhì)子與抗體也具有相對較近的距離(STD effect為63%)，其通過疏水作用參與與抗體的結(jié)合。由此可知，六肽EEQRNG在與抗體的相互作用中占主導(dǎo)地位的為靜電相互作用和氫鍵，其次為疏水相互作用。

圖6 六肽EEQRNG結(jié)構(gòu)及其與抗體反應(yīng)的STD圖譜Fig.6 Structural formula of hexapeptide EEQRNG and 1D STD-NMR spectrum with spin-lock pulse of EEQRNG in the presence of human IgG

圖7為七肽FIQSLKD的結(jié)構(gòu)式以及其與抗體反應(yīng)后的STD圖譜。由圖7可知： FIQSLKD中絲氨酸(S)β位上的質(zhì)子具有最大的STD effect值，表明絲氨酸(S)側(cè)鏈通過氫鍵和疏水作用與抗體結(jié)合；除此之外，位于異亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)、賴氨酸(K)和亮氨酸(L)上的脂肪族和芳香族質(zhì)子與抗體也具有相對較近的距離，其通過疏水作用參與與抗體的結(jié)合。由此可知，F(xiàn)IQSLKD與抗體結(jié)合的主要驅(qū)動力為氫鍵和疏水相互作用。

圖7 七肽FIQSLKD的結(jié)構(gòu)及其與抗體反應(yīng)的STD圖譜Fig.7 Structural formula of heptapeptide FIQSLKD 1D STD-NMR spectrum with spin-lock pulse of FIQSLKD in the presence of human IgG

表2總結(jié)了上述利用STD-NMR技術(shù)確定的Protein A上4個肽段KEQQNA、FYEILH、EEQRNG和FYEILH與抗體相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)，以及這些關(guān)鍵位點(diǎn)與文獻(xiàn)[14]中利用晶體衍射確定的Protein A上與抗體結(jié)合的熱點(diǎn)殘基。

由表2可知，利用STD-NMR技術(shù)和晶體衍射技術(shù)確定的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)大部分能吻合，但在個別位點(diǎn)上有差異。這表明晶體狀態(tài)與溶液狀態(tài)中受體和配體的相互作用存在差異，周圍氨基酸的調(diào)控作用和構(gòu)象差異能夠影響配體和受體的相互作用位點(diǎn)。

表2 仿生肽配基與抗體結(jié)合位點(diǎn)的比較Table 2 Comparison of the residues of biomimetic peptide binding to antibody

2.4 靜態(tài)吸附實驗驗證六肽FYEILH結(jié)合抗體的能力

圖8展示了利用Langmuir 模型擬合獲得的FYEILH的靜態(tài)吸附曲線。由圖8數(shù)據(jù)的擬合結(jié)果可知，此多肽介質(zhì)結(jié)合抗體的靜態(tài)吸附容量(qm)為61.22 mg/mL，與抗體的親和力為0.8×10-6mol/L。表3展示了六肽FYEILH與參考文獻(xiàn)中有代表性的抗體親和配基的靜態(tài)載量和表觀解離常數(shù)。由表3可以發(fā)現(xiàn)，文獻(xiàn)中報道的多數(shù)多肽配基與抗體的親和力即Kd為10-5～10-6mol/L，本研究中筆者篩選出的六肽FYEILH與抗體的結(jié)合的解離常數(shù)Kd為0.8×10-6mol/L，說明它與抗體的親和性強(qiáng)于文獻(xiàn)報道的許多多肽配基，雖然此親和力仍然弱于Protein A與抗體的親和力，但這種較弱的親和力反而有利于結(jié)合在配基上的抗體在更溫和的條件下被洗脫，從而有效地避免使用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿性洗脫造成的配基脫落和抗體變性聚集。此外，在未來的研究中，還可以通過提高配基密度或連接間隔臂來固定配基的方式進(jìn)一步提高多肽結(jié)合抗體的容量[12,20]。

圖8 FYEILH親和介質(zhì)和空白介質(zhì)對 hIgG 的吸附等溫線(pH 6.0)Fig.8 Adsorption isotherm of hIgG onto the FYEILH peptide resins and blank resins at pH 6.0

表3 FYEILH、HWRGWV、DWHW、FYWHCLDE、Protein A、CVFYRNGKSFQFS和PG8表觀解離常數(shù)(Kd)和靜態(tài)載量(qm)Table 3 Comparison of the capacity (qm) and apparent dissociation constant(Kd) of FYEILH,HWRGWV,DWHW,FYWHCLDE,Protein A,CVFYRNGKSFQFS and PG8

3 結(jié)論

在本研究中，定向設(shè)計了Protein A上能與抗體結(jié)合的4個仿生肽段，利用STD-NMR技術(shù)表征了這些肽段與抗體結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)，與利用X線晶體衍射確定的Protein A上與抗體結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)信息進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩者確定的關(guān)鍵位點(diǎn)信息基本吻合。

將篩選到與抗體親和性最強(qiáng)的六肽固定在固體基質(zhì)上制備出了六肽介質(zhì)，此介質(zhì)與抗體的親和性達(dá)到0.8×10-6mol/L、靜態(tài)吸附容量為61.22 mg/mL。由此可見，通過對Protein A定向設(shè)計，將其最小化獲得的六肽FYEILH與抗體具有較高的親和性。本研究為開發(fā)其他用于純化的功能性大蛋白質(zhì)的最小化多肽配基提供了思路和方法。