馬 萌,高 蓓,劉 瑤,方波歡,江 敏,朱 通,張?jiān)鲚x,張魯嘉

(1. 華東師范大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院 上海分子治療與新藥創(chuàng)制工程技術(shù)研究中心，上海 200241; 2. 華東師范大學(xué) 物理與材料科學(xué)學(xué)院，上海 200241; 3.紐約大學(xué)(上海)計(jì)算化學(xué)中心，上海 200122; 4. 華東理工大學(xué) 生物工程學(xué)院 生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237)

家鴿、候鳥,蝙蝠、鼴鼠,龍蝦,蝴蝶和果蠅等能探測(cè)到地球的磁場(chǎng)，通過這種能力，它們可以進(jìn)行遷徙與定位[1-3]。近年來，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)生物的遷徙、導(dǎo)航、定位行為與生物體內(nèi)的磁蛋白有關(guān)，并提出了以磁蛋白為基礎(chǔ)的生物羅盤模型[4]。Qin等[4]認(rèn)為在具有導(dǎo)航能力的動(dòng)物體內(nèi)，磁感應(yīng)能力的基礎(chǔ)并不是人們一直以來認(rèn)為的感藍(lán)光蛋白隱花色素(CRY)[5]，而是另外一種具有磁感應(yīng)性的蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)與CRY形成蛋白復(fù)合物，共同決定著動(dòng)物的歸巢與遷徙，所以他們將這類同動(dòng)物磁感應(yīng)機(jī)制相關(guān)的蛋白命名為磁受體蛋白(MagR)，該課題組從果蠅CG8198基因組中篩選出了這種磁感應(yīng)受體蛋白(dMagR)，并采用一系列的細(xì)胞、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)和生物物理學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行了表征，證實(shí)了MagR不僅可與CRY組成復(fù)合物，其單體也可組聚形成棒狀結(jié)構(gòu)，對(duì)地磁等外界磁場(chǎng)有不同程度的響應(yīng)，且MagR/CRY復(fù)合體的形成在果蠅、帝王蝶，家鴿，鼴鼠、小須鯨和人等物種中是保守的[4]。

蛋白的分離純化是其結(jié)構(gòu)解析、性質(zhì)測(cè)定及工業(yè)應(yīng)用等研究的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分離標(biāo)簽，如6×His-tag[6]、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)[7]及麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)[8]等，其分離過程依賴于較昂貴的分離純化柱，且進(jìn)行蛋白質(zhì)分離時(shí)步驟繁瑣、需配制多種溶劑以適應(yīng)蛋白分離所需的環(huán)境、分離后需再置換溶液以適應(yīng)后期的蛋白表征，給蛋白純化工作帶來諸多不便。

家鴿磁蛋白(clMagR)，其全長(zhǎng)基因序列為396 bp，編碼132個(gè)氨基酸，分子量約為1.4×104[4]?；赾lMagR具有超順磁性的性質(zhì)，Jiang等[9]將clMagR作為蛋白融合標(biāo)簽，與3種小分子量蛋白(～2.5×104)共表達(dá)，通過clMagR與Fe3O4的物理吸附，成功實(shí)現(xiàn)了目的蛋白的分離。該方法簡(jiǎn)單有效，可一步獲得純度較高、酶活性良好、且具有較好耐受性的蛋白質(zhì)。由此可見，與傳統(tǒng)方法相比，基于磁蛋白分離標(biāo)簽的蛋白分離純化策略具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

雖然Jiang等[9]利用clMagR融合標(biāo)簽對(duì)較小分子量的蛋白進(jìn)行了分離純化及性質(zhì)表征，目前，clMagR能否牽動(dòng)分子量較大的蛋白，達(dá)到高效分離的效果還未驗(yàn)證。黃曲霉毒素氧化酶(aflatoxin-oxidase,AFO)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種由假蜜環(huán)菌(Armillariellatabescens,E-20)分泌的蛋白[10]，分子量約7.5×104[11]，可以將黃曲霉毒素的主要毒性結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)——雙呋喃環(huán)的雙鍵打開，成為無毒性的物質(zhì)[12]，因而具有顯著的去毒化作用。

本文中，筆者將黃曲霉毒素蛋白與磁蛋白共表達(dá)于大腸桿菌，并通過clMagR與Fe3O4的物理吸附，探索基于磁蛋白標(biāo)簽的純化策略對(duì)于黃曲霉毒素蛋白的分離純化效果，進(jìn)而研究其去毒化作用，同時(shí)也進(jìn)一步開發(fā)磁蛋白標(biāo)簽對(duì)于大分子量蛋白的純化能力。

1 材料與方法

1.1 主要菌株、質(zhì)粒和材料

pET-28a(+)、表達(dá)clMagR的E.coliDH5α菌株，華東理工大學(xué)江敏提供；pET-28a(+)-AFO質(zhì)粒，上海睿勉生物工程公司商業(yè)合成；感受態(tài)宿主E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)、TAE緩沖液，上海捷瑞生物工程公司；磁珠回收裝置，上海睿迪生物工程有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒與瓊脂糖凝膠回收試劑盒，慧晶生物科技股份有限公司；Taq酶、Prime STAR?Max DNA聚合酶，寶生物工程(大連)有限公司。磁珠(Beaver BeadsTMMagOH,10 mg/mL)，蘇州海貍生物醫(yī)學(xué)工程有限公司；黃曲霉毒素B1(AFB1)標(biāo)準(zhǔn)品、乙腈和甲醇皆為色譜純，Sigma公司。

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨1 g、酵母提取物0.5 g、NaCl 1 g，加超純水至總體積為100 mL;121 ℃滅菌20 min，室溫放置待用。

LB固體培養(yǎng)基即在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入使終質(zhì)量濃度為15 g/L的瓊脂粉，121 ℃、20 min滅菌，常溫保存。

PBS緩沖液：0.2 mol/L Na2HPO412.3 mL與0.2 mol/L NaH2PO487.7 mL混合至總體積100 mL；pH 6.0。

EGTA-PBS緩沖液：在前述pH為6.0的PBS緩沖液中加入終濃度為5 mmol/L的EGTA。

1 000×MgSO4緩沖液：在pH 6.0的PBS緩沖液中加入MgSO4，使其終濃度為30 mmol/L。

1.2 重組質(zhì)粒pET28a(+)-AFO-clMagR的構(gòu)建

根據(jù)GenBank中發(fā)布的clMagR與AFO基因序列，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物。AFO特異性擴(kuò)增上游引物AFO-F:5′-TGTGAATTCATGGCCACCACAACTGTCCACCGG-3′，AFO下游引物ANCR:5′-TGCGCTAGATGCCATGTGGCTGCCGCGCGGCACCAGGCCCAATCGTCTCTCAAT-3′。

磁蛋白特異性擴(kuò)增上游引物ANCF:5′-CACATGGCATCTAGCGCATCATCT-3′，磁蛋白下游引物ACR:5-′CCGCTCGAGGATGTTAAAGCTTTCTCC-3′。下劃線所標(biāo)堿基為限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)，其中AFO特異性引物上游酶切位點(diǎn)為EcoRⅠ,clMagR下游反向引物酶切位點(diǎn)為XhoⅠ。

以AFO基因?yàn)槟０?，以AFO-F和ANCR為引物，PCR擴(kuò)增AFO片段；以clMagR基因?yàn)槟０?，以ANCF和ACR為引物，PCR擴(kuò)增clMagR基因片段。將AFO和clMagR片段回收后，通過融合PCR將兩片段融合和擴(kuò)增。

使用EcoRⅠ和XhoⅠ將clMagR-AFO基因與pET28a(+)載體分別雙酶切，回收酶切產(chǎn)物后進(jìn)行連接反應(yīng)，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒命名為clMagR-AFO-pET28a(+)。隨后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，以挑取的單菌落為模板，使用T7通用引物，進(jìn)行PCR驗(yàn)證和測(cè)序，提取測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosseta(DE3)中，得到clMagR-AFO重組工程菌。質(zhì)粒提取、膠回收步驟參考試劑盒說明書，酶切、連接、轉(zhuǎn)化等具體步驟參照文獻(xiàn)[13-14]進(jìn)行操作。

1.3 重組蛋白的表達(dá)與優(yōu)化

挑取重組轉(zhuǎn)化子，接入含卡那霉素抗性(50 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜；以2%接種量將種子培養(yǎng)液在LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，加入IPTG使其終濃度為0.1 mmol/L,16 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)，自第8小時(shí)開始，每小時(shí)取樣10 mL，直至第19小時(shí)誘導(dǎo)結(jié)束。參照文獻(xiàn)[13]的步驟，離心、破碎、取上清液，同時(shí)將沉淀以一定體積PBS緩沖液溶解，采用SDS-PAGE電泳驗(yàn)證蛋白表達(dá)水平。

1.4 重組蛋白的分離純化

磁珠對(duì)蛋白的富集步驟參照文獻(xiàn)[9]的方法，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。取500 μL融合表達(dá)clMagR-AFO重組菌的破碎細(xì)胞上清液到1.5 mL小離心管中，加入100 μL磁珠同蛋白混合，4 ℃緩慢振蕩混合10 min，反應(yīng)結(jié)束后在體系外加磁鐵吸附磁珠-蛋白復(fù)合物，棄上清液后移開體系外磁鐵，以1 mL PBS溶液清洗管內(nèi)混合物，外加磁鐵后棄去未吸附蛋白及其他雜質(zhì)，重復(fù)3次，最終用50 μL EGTA-PBS緩沖液將蛋白溶解，以BCA法測(cè)蛋白濃度。采用SDS-PAGE電泳驗(yàn)證分離效果。

1.5 重組蛋白去毒率測(cè)定

實(shí)驗(yàn)組a。在1 mL反應(yīng)體系中分別加入982 μL clMagR-AFO-磁珠混合液、8 μL AFB1(50 μg/mL)和10 μL MgSO4(3 mg/mL)，置于30 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后，100 ℃水浴15 min,18 000g離心，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，即為待測(cè)樣品。

實(shí)驗(yàn)組b。將實(shí)驗(yàn)組a中clMagR-AFO-磁珠混合液替換為等量野生型AFO蛋白，其他操作同實(shí)驗(yàn)組a。

對(duì)照組a。將982 μL clMagR-AFO蛋白100 ℃、15 min水浴滅活，其他操作與實(shí)驗(yàn)組一致。

對(duì)照組b。8 μL AFB1(50 μg/mL)和10 μL MgSO4(3 mg/mL)加入982 μL PBS 緩沖液，過0.22 μm微孔濾膜。

對(duì)照組c。8 μL AFB1(50 μg/mL)和10 μL MgSO4(3 mg/mL)加入982 μL PBS緩沖液，100 ℃水浴15 min，過0.22 μm微孔濾膜。

固定化AFO利用率實(shí)驗(yàn)。在1 mL反應(yīng)體系中分別加入982 μL clMagR-AFO-磁珠混合液、8 μL AFB1(50 μg/mL)和10 μL MgSO4(3 mg/mL)，置于30 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后，通過外加磁鐵吸附體系內(nèi)磁珠-clMagR-AFO蛋白復(fù)合物，吸取全部上清液，100 ℃水浴15 min,18 000g離心，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，待HPLC檢測(cè)；繼續(xù)向體內(nèi)加入AFB1、緩沖液，移去外部磁鐵，使體系內(nèi)磁珠-clMagR-AFO蛋白復(fù)合物同新加入的AFB1進(jìn)行反應(yīng)，重復(fù)前述步驟。

黃曲霉毒素氧化酶的去毒率通過高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)[15]。色譜柱為C18柱，流動(dòng)相由兩相組成，A相為超純水、B相為等體積混合的乙腈-甲醇混合溶液。采用A相(65%)-B相(35%)的等梯度洗脫，流速為1 mL/min，上樣量10 μL，設(shè)定熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)為365 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為436 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組菌株的構(gòu)建

根據(jù)NCBI提供的序列，計(jì)算得出黃曲霉毒素氧化酶基因AFO與家鴿磁蛋白clMagR基因融合后的全長(zhǎng)為2 505 bp。將基因AFO與clMagR進(jìn)行融合PCR驗(yàn)證，結(jié)果見圖1。由圖1可知，處于2 000～3 000 bp的單一片段(條帶 1)，與clMagR-AFO融合基因理論大小一致。隨后將擴(kuò)增得到的clMagR-AFO基因片段與pET-28a(+)載體連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，使用T7通用引物進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，得到2 500 bp左右的DNA片段(條帶 2)，初步表明AFO與clMagR融合基因已成功連接至pET-28a(+)載體。進(jìn)一步測(cè)序結(jié)果表明，clMagR基因位于AFO基因的3′端，序列與預(yù)期一致。將測(cè)序正確的質(zhì)粒clMagR-AFO-pET28a(+)轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)，經(jīng)測(cè)序，clMagR-AFO重組表達(dá)菌株構(gòu)建成功。

M—標(biāo)準(zhǔn)DNA; 1—clMagR-AFO融合PCR；2—clMagR-AFO連接pET-28a(+)載體驗(yàn)證PCR圖1 重組質(zhì)粒clMagR-AFO- pET-28a(+)的PCR驗(yàn)證Fig.1 Identification of recombinant plasmid clMagR-AFO-pET-28a(+) by PCR

2.2 融合蛋白的表達(dá)及優(yōu)化

大腸桿菌表達(dá)外源基因時(shí)，由于其pH、氧化還原電位、滲透壓、折疊機(jī)制及輔因子等細(xì)胞內(nèi)環(huán)境與基因的原始來源不同，可能會(huì)得不到理想的異源蛋白[16-17]，因此需要對(duì)蛋白表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。一方面，較高的溫度有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，但也會(huì)增加質(zhì)粒丟失的風(fēng)險(xiǎn)[18]并加劇異源蛋白包涵體的形成；適當(dāng)降低誘導(dǎo)溫度，可減慢重組蛋白的合成速率，有助于減少包涵體的形成[19]。另一方面，使用高濃度的誘導(dǎo)劑不僅會(huì)加劇誘導(dǎo)蛋白的生產(chǎn)成本，而且存在細(xì)胞毒性[20]；適當(dāng)降低誘導(dǎo)劑濃度，可以有效緩解上述問題[21]。因此，以16 ℃、0.1 mmol/L IPTG進(jìn)行野生型AFO和clMag-AFO的誘導(dǎo)表達(dá)。自誘導(dǎo)8 h起每小時(shí)取樣，收集菌體并進(jìn)行超聲破碎，離心后上清液和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳，誘導(dǎo)19 h后結(jié)束取樣并檢測(cè)蛋白表達(dá)量，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知：野生型AFO(～7.5×104)在E.coliBL21(DE3)中僅有微量表達(dá)(圖2(a)～(d)中的條帶2、6、10)；而添加clMagR蛋白標(biāo)簽后(～9.0×104)，融合蛋白的表達(dá)量有所增加(圖2(d)中的條帶4、8、12)；自誘導(dǎo)第15 小時(shí)開始，clMagR-AFO表達(dá)量呈上升趨勢(shì)(圖2(c)中的條帶4、8、12，圖2(d)中的條帶4、8、12)。綜上，在16 ℃、添加0.1 mmol/L IPTG、誘導(dǎo)19 h條件下，clMag-AFO融合蛋白可溶表達(dá)量較高，經(jīng)測(cè)定，融合蛋白表達(dá)量為0.092 mg/mL。

2.3 磁珠純化效率分析

將誘導(dǎo)表達(dá)后獲得的clMag-AFO融合蛋白進(jìn)行分離純化。基于磁蛋白具有明顯內(nèi)稟磁矩的特性，可被磁性納米顆粒物理吸附至表面從而與其他成分分離[22]，因此本研究通過clMagR與磁性納米鐵珠Fe3O4的物理吸附，將clMag-AFO融合蛋白與細(xì)胞內(nèi)其他雜質(zhì)蛋白進(jìn)行分離，分離過程如圖3所示。

M—標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。圖2(a)：1、5、9—AFO誘導(dǎo)第8、9、10小時(shí)的沉淀；2、6、10—AFO誘導(dǎo)第8、9、10小時(shí)的上清液；3、7、11—clMagR-AFO誘導(dǎo)第8、9、10小時(shí)的沉淀；4、8、12—clMagR-AFO誘導(dǎo)第8、9、10小時(shí)的上清。圖2(b)：1、5、9—AFO誘導(dǎo)第11、12、13小時(shí)的沉淀；2、6、10—AFO誘導(dǎo)第11、12、13小時(shí)的上清液；3、7、11—clMagR-AFO誘導(dǎo)第11、12、13小時(shí)的沉淀；4、8、12—clMagR-AFO誘導(dǎo)第11、12、13小時(shí)的上清液。圖2(c)：1、5、9—AFO誘導(dǎo)第14、15、16小時(shí)的沉淀；2、6、10—AFO誘導(dǎo)第14、15、16小時(shí)的上清液；3、7、11—clMagR-AFO誘導(dǎo)第14、15、16小時(shí)的沉淀；4、8、12—clMagR-AFO誘導(dǎo)第14、15、16小時(shí)上清液，圖2(d)：1、5、9—AFO誘導(dǎo)第17、18、19小時(shí)的沉淀；2、6、10:AFO誘導(dǎo)第17、18、19小時(shí)的上清液；3、7、11—clMagR-AFO誘導(dǎo)第17、18、19小時(shí)的沉淀；4、8、12—clMagR-AFO誘導(dǎo)第17、18、19小時(shí)的上清液圖2 SDS-PAGE電泳驗(yàn)證clMagR-AFO融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)優(yōu)化Fig.2 SDS-PAGE analysis of clMagR-AFO fusion protein

圖3 磁珠分離裝置及磁珠分離AFO-clMagR蛋白復(fù)合體流程Fig.3 Magnetic bead separation device and flow chart of AFO-clMagR protein complex separated by magnetic beads

由圖3可知：破碎重組大腸桿菌菌體并離心后，所得蛋白溶液清澈透亮(圖3(a))；加入磁性納米顆粒后，溶液體系迅速渾濁(圖3(b))，輕搖振蕩使磁珠均勻分布(圖3(c))；外加磁場(chǎng)作用于磁珠-蛋白混合液后，磁珠被迅速吸附至一側(cè)，混合溶液恢復(fù)至澄清透明(圖3(d))。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證目的蛋白AFO是否與磁蛋白clMagR一起被納米鐵珠吸附從而與其他細(xì)胞內(nèi)雜蛋白分離，本研究將純化前后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖4所示。

M—標(biāo)準(zhǔn)蛋白;1—AFO-clMagR沉淀；2—AFO-clMagR上清液；3—未被磁珠吸附上清液；4—磁珠吸附蛋白圖4 磁珠吸附AFO-clMagR蛋白復(fù)合物的SDS-PAGE分析結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE analysis of magnetic beads adsorbing AFO-clMagR protein complex

由圖4可知，條帶4磁珠吸附蛋白泳道顯示出單一特異性目的條帶，且大小與clMagR-AFO融合蛋白一致，表明clMagR-AFO融合蛋白實(shí)現(xiàn)了分離純化。經(jīng)計(jì)算，融合表達(dá)細(xì)胞破碎液上清液中的目標(biāo)蛋白質(zhì)量濃度為0.092 mg/mL，磁珠分離出的目標(biāo)蛋白質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL。實(shí)驗(yàn)測(cè)得磁珠吸附目標(biāo)蛋白效率約為40 mg/g(以1 g磁蛋計(jì))，與Jiang等[9]測(cè)得吸附率3.26 mg/g相比，本研究的吸附效率明顯提高。產(chǎn)生該結(jié)果的原因一方面是由于本研究中AFO蛋白分子量為7.5×104，而Jiang等所用蛋白分子量為2.5×104，在吸附相同摩爾數(shù)蛋白的情況下，本研究中的吸附蛋白質(zhì)量比Jiang等實(shí)驗(yàn)中提供的數(shù)據(jù)高是正?，F(xiàn)象；另一方面，可能是由于本研究中AFO的折疊結(jié)構(gòu)使得融合蛋白之間以clMagR為中心發(fā)生聚合，不僅clMagR組裝成了較為規(guī)則的聚合體結(jié)構(gòu)，而且AFO蛋白分子之間通過氫鍵、離子鍵及范德華力等相互作用，使得組裝構(gòu)型更加穩(wěn)定，組裝后的整體分子量大大增加且具永久磁矩，在外加磁場(chǎng)的作用下有更佳的磁感應(yīng)性。由此可見，當(dāng)clMagR作為蛋白純化標(biāo)簽時(shí)，可拖動(dòng)7.5×104左右的蛋白吸附在磁珠表面，并能增加AFO蛋白的可溶表達(dá)。

2.4 融合蛋白去毒率分析

通過液相色譜測(cè)定不同濃度黃曲霉毒素AFB1的吸收峰面積，作圖獲得黃曲霉毒素AFB1的計(jì)算公式為y=11 527x-45 865,R2=0.999 9。其中，y為峰面積，x為AFB1質(zhì)量濃度(ng/mL)，R2為標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)系數(shù)。

在1 mL反應(yīng)體系中分別加入982 μL clMagR-AFO-磁珠混合液、8 μL AFB1(50 μg/mL)和10 μL MgSO4(3 mg/mL)，置于30 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后，100 ℃水浴15 min,18 000g離心，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，即為待測(cè)樣品。

為測(cè)定clMagR磁蛋白標(biāo)簽對(duì)于AFO降解黃曲霉毒素能力的影響，分別將clMagR-AFO-磁珠混合液、等摩爾量AFO蛋白(未融合clMagR蛋白)加入50 μg/mL AFB1溶液中，反應(yīng)30 min后滅活A(yù)FO蛋白，并通過液相色譜測(cè)定剩余AFB1的量，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知：AFB1標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間約為10 min，反應(yīng)前檢測(cè)得到體系內(nèi)AFB1峰面積(色譜峰a)，換算成質(zhì)量濃度為400 ng/mL；在加入clMagR-AFO蛋白、pH 6.0、30 ℃、30 min的條件下催化反應(yīng)，體系內(nèi)的AFB1質(zhì)量濃度降至96.26 ng/mL(色譜峰b)；在加入AFO蛋白、同等條件下反應(yīng)后，AFB1質(zhì)量濃度降至80.96 ng/mL(色譜峰c)。因此，clMagR-AFO的AFB1去毒率為75.94%，未融合clMagR的AFO的AFB1去毒率為79.76%。該結(jié)果表明，磁蛋白clMagR純化標(biāo)簽對(duì)黃曲霉毒素氧化酶AFO水解AFB1的酶活無顯著影響。

a—滅活蛋白對(duì)照組；b—clMagR-AFO與AFB1反應(yīng)色譜峰；c—AFO與AFB1反應(yīng)色譜峰；d—PBS溶液圖5 HPLC檢測(cè)AFO去毒率Fig.5 Detoxification rate for AFO by HPLC

為驗(yàn)證100 ℃水浴對(duì)AFB1檢測(cè)的影響，采用液相色譜法測(cè)定沸水浴前后溶液中AFB1的變化，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，AFB1沸水浴前的樣品峰(色譜峰a)與AFB1沸水浴后的樣品峰(色譜峰b)完全重合，根據(jù)AFB1濃度計(jì)算公式，計(jì)算出兩體系中的樣品質(zhì)量濃度皆為400 ng/mL，說明15 min的沸水浴對(duì)AFB1無影響。

圖6 沸水浴15 min對(duì)AFB1檢測(cè)影響Fig.6 Effects of AFB1 on the boiling water bath after 15 min by HPLC

將吸附于納米磁珠表面的clMagR-AFO視為固定化酶，為提高酶的利用率，考察固定化酶的重復(fù)使用次數(shù)。在每一批反應(yīng)結(jié)束后，通過外加磁鐵吸附體系內(nèi)磁珠-clMagR-AFO蛋白復(fù)合物，待吸取全部上清液后，繼續(xù)向體內(nèi)加入AFB1，并移去外部磁鐵，使體系內(nèi)磁珠-clMagR-AFO蛋白復(fù)合物同新加入的AFB1進(jìn)行反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：固定化AFO重復(fù)使用至第5次時(shí)，AFO對(duì)AFB1去毒率仍保持初始去毒率的50%以上；繼續(xù)重復(fù)使用時(shí)，固定化AFO的酶活下降明顯，當(dāng)重復(fù)至第10批反應(yīng)時(shí)，其降解黃曲霉素的能力僅為初始去毒率的7.55%。綜上所述，經(jīng)磁性納米鐵珠固定化的融合蛋白clMagR-AFO可作為固定化酶進(jìn)行重復(fù)使用，且在前5批反應(yīng)中表現(xiàn)出良好的去毒率。

3 結(jié)論

將家鴿磁蛋白clMagR與7.5×104的黃曲霉毒素氧化酶AFO共表達(dá)，基于磁蛋白的外部磁場(chǎng)響應(yīng)性，使用納米磁珠實(shí)現(xiàn)了黃曲霉毒素氧化酶的分離純化，同時(shí)驗(yàn)證了磁蛋白標(biāo)簽純化大分子量蛋白的效果。進(jìn)一步的去毒率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，純化后的AFO蛋白保持了75.94%的AFB1去毒率，與野生型AFO的AFB1去毒率79.76%相比，clMagR純化標(biāo)簽對(duì)AFO的酶活無顯著影響。此外，磁珠固定化的AFO可作為固定化酶重復(fù)利用5次仍保持較好的去毒率。本研究建立了新型的基于磁蛋白標(biāo)簽的AFB1清除體系，為AFB1的去毒化研究提供了新的方向，也為蛋白純化與固定化研究提供了有益借鑒。