李文菠，孫成杰，周國俊，應(yīng)偉，馮彥超，黃婷，侍琳，黃理政，李健水，冷政偉

（川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1.肝膽外科二 2.腫瘤干細(xì)胞研究中心，四川 南充 637000）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)美國癌癥協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，HCC在男性癌癥中的發(fā)病率排第六位，但在女性中仍以每年超過2%的速度增長，其病死率在男性排第五位，在女性中排第六位[1-2]，與其他癌癥相似，HCC與潛在的危險(xiǎn)因素相關(guān)，如超重、吸煙、酗酒、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、非酒精性脂肪性肝病和某些基因突變等[3-4]。目前HCC的常用治療方法包括手術(shù)切除、射頻消融、肝臟移植、放射栓塞、免疫治療等[5-7]，不同分期的腫瘤患者選擇不同的治療方法，但5年復(fù)發(fā)率仍然很高[8-9]。近年來越來越多的研究表明，基因失活和基因突變是導(dǎo)致HCC發(fā)生發(fā)展的重要因素，故準(zhǔn)確找到導(dǎo)致HCC的相關(guān)基因，從基因水平上研究HCC已成為研究熱點(diǎn)之一。

近年來利用生物信息學(xué)和基因芯片技術(shù)研究因基因失活或基因突變所致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展已成為發(fā)展趨勢(shì)[10]?；蛐酒哂袛?shù)據(jù)全面，樣本量大等優(yōu)點(diǎn)，在生物學(xué)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域占據(jù)重要位置。但這些數(shù)據(jù)信息混雜、缺乏足夠?qū)嶒?yàn)基礎(chǔ)，其準(zhǔn)確性需要進(jìn)一步驗(yàn)證。因此如何挖掘出準(zhǔn)確可靠的基因信息逐漸成為生物信息學(xué)研究熱點(diǎn)。本研究通過生物信息學(xué)的方法對(duì)HCC和癌旁組織的基因芯片中的差異基因進(jìn)行分析并進(jìn)行臨床樣本表達(dá)驗(yàn)證，篩選出與HCC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因并進(jìn)行臨床樣本驗(yàn)證，以期為其早期診斷、靶向治療等提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)信息

HCC芯片從NCBI-GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）數(shù)據(jù)庫下載，GSE14520，GSE41804，GSE45267分別包含HCC組織225、20、48例，癌旁組織220、20、39例。

1.2 差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）篩選

通過GEO2R在線工具，定義HCC和癌旁組織，比較出DEGs，再篩選出滿足絕對(duì)值LogFC＞2且校正P＜0.05的DEGs，將篩選出LogFC＞2的基因，定義為上調(diào)DEGs，LogFC＜-2的基因，定義為下調(diào)DEGs，通過Venn（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn）在線制圖工具篩取出3個(gè)芯片的上調(diào)基因的交集與下調(diào)調(diào)基因的交集。

1.3 GO 功能分析和KEGG 通路富集分析

利用生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫（Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID）為DEGs進(jìn)行系統(tǒng)綜合的生物學(xué)功能注釋分析。通過上傳DEGs到DAVID網(wǎng)站（https://david.ncifcrf.gov），進(jìn)行GO（gene ontology，GO）功能分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析，以P＜0.05且FDR＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，選擇分析項(xiàng)目為生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞成分（cellular component，CC）和信號(hào)通路。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)PPI 分析和核心DEGs 篩選

將所獲得的共同表達(dá)DEGs用STRING網(wǎng)站（https://string-db.org）進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建，構(gòu)建后的網(wǎng)絡(luò)圖利用Cytoscape3.7.2軟件及MCODE插件分析，篩選出核心DEGs。

1.5 核心DEGs 生存分析

在Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站（http://www.kmplot.com）中，將核心DEGs逐個(gè)進(jìn)行生存分析，選擇總生存率（OS）為指標(biāo)，作出每個(gè)基因的生存曲線圖，篩選出生存分析中P＜0.05的基因，其可能為與預(yù)后相關(guān)基因。

1.6 預(yù)后相關(guān)DEGs 在HCC 與癌旁組織中的表達(dá)情況

把Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站中篩選出的與預(yù)后相關(guān)的基因用GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn）在線分析，選擇表達(dá)圖形選擇Box Plots，數(shù)據(jù)來源選擇LIHC，得到其在HCC組織和癌旁組織中的表達(dá)情況，以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.7 與預(yù)后相關(guān)且在HCC 中高表達(dá)基因的功能及通路富集分析

將獲得的與預(yù)后相關(guān)且在HCC中高表達(dá)基因上傳至Metascape網(wǎng)站（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1），種屬選擇homosapiens，得到功能和通路的富集分析結(jié)果，以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.8 免疫組化染色分析

在本研究中心選取HCC組織和癌旁組織各70例用于將石蠟包埋的組織切成5μm的切片。使用標(biāo)準(zhǔn)的免疫過氧化物酶染色程序進(jìn)行免疫組化分析。分析染色強(qiáng)度（陰性：0分，弱陽性：1分，中等陽性：2分，強(qiáng)陽性：3分）和陽性細(xì)胞百分比（＜5%：0分，5%～25%：1分，26%～50%：2分，51%～75%：3分，76%～100%：4分），最終計(jì)算公式：強(qiáng)度×百分比，其最終范圍為0～12分。用這種方法對(duì)每一張玻片進(jìn)行打分，以6分為界限，分為低表達(dá)樣本和高表達(dá)樣本。然后使用SPSS分別對(duì)HCC組織和癌旁組織進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，再把統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)導(dǎo)入GraphPad prism 8中繪制統(tǒng)計(jì)圖。

2 結(jié) 果

2.1 DEGs 篩選結(jié)果

芯片GSE14520，GSE41804，GSE45267分別篩選出差DEGs 252、257、497個(gè)，其中上調(diào)的DEGs分別為54、63、116個(gè)，下調(diào)的DEGs分別為198、194、381個(gè)，3個(gè)芯片的共差異的上調(diào)基因?yàn)?6個(gè)（圖1A），共差異的下調(diào)基因?yàn)?2個(gè)（圖1B），其共同的DEGs具體詳見（表1）。

圖1 三個(gè)芯片DEGs 的Venn 圖（上調(diào)基因LogFc>2，下調(diào)基因LogFc<-2） A：16個(gè)上調(diào)DEGs；B：62個(gè)下調(diào)DEGsFigure1 Venn diagram of DEGs in the three gene microarrays (up-regulated LogFc＞2,down-regulated LogFc＜-2) A:16 upregulated genes;B:62 down-regulated genes

表1 78個(gè)共同DEGsTable1 The 78 common DEGs

2.2 GO與KEGG分析結(jié)果

經(jīng)過DAVID網(wǎng)站將差異表達(dá)的78個(gè)基因，進(jìn)行GO功能分析和KEGG通路富集分析。

GO功能分析中（表2），BP共涉及48個(gè)方面，主要集中在：細(xì)胞負(fù)增長的調(diào)控、細(xì)胞對(duì)鋅離子的反應(yīng)、外源性藥物代謝過程、異型生物質(zhì)的代謝過程、氧化還原過程、細(xì)胞對(duì)鎘離子反應(yīng)、P450表氧化酶通路、類固醇代謝過程；MF共有21個(gè)相關(guān)方面，其中主要集中于氧化還原酶活性、鐵離子結(jié)合、氧結(jié)合、血紅素結(jié)合、單加氧酶活性、花生四烯酸環(huán)氧合酶活性、氧化還原酶活性、類固醇羥化酶活性、咖啡因氧化酶活性、芳香酶活性；CC共涉及13個(gè)方面，其中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的有以下方面：細(xì)胞器膜、細(xì)胞外泌體、細(xì)胞外區(qū)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、細(xì)胞外間隙、胞質(zhì)核周區(qū)、中間體、血液微粒、次膜攻擊復(fù)合物。KEGG通路富集分析（表3）中，共涉及15個(gè)通路，其主要涉及于視黃醇的新陳代謝、礦物質(zhì)吸收、藥物代謝-細(xì)胞色素P450、化學(xué)致癌性、細(xì)胞色素P450對(duì)外源生物的代謝作用、咖啡因代謝、甾體類激素生物合成、亞油酸代謝、代謝途徑、P53信號(hào)通路、藥物代謝-其他酶。

表2 78個(gè)DEGs GO 功能分析Table2 GO function analysis of the 78 DEGs

表3 78個(gè)DEGs 的KEGG 通路富集分Table3 KEGG pathway enrichment analysis of the 78 DEGs

2.3 PPI分析結(jié)果

將78個(gè)DEGs基因上傳至STRING網(wǎng)站分析后，有15個(gè)基因未出現(xiàn)在PPI網(wǎng)絡(luò)分析中，剩余共有63個(gè)基因，其中包括上調(diào)基因17個(gè)，下調(diào)基因46個(gè)，共有蛋白之間相互作用關(guān)系線條156條（圖2A）。通過Cytoscape 3.7.2軟件及MCODE插件分析后，得到兩簇相交點(diǎn)最多的基因簇，分別有9、8個(gè)基因，分別有36、21條線，其分值分別為9、6，將其定義為核心EGs。共獲得22個(gè)核心DEGs（圖2B）。

圖2 共同DEGs 的PPI分析（黃色表示上調(diào)基因，藍(lán)色表示下調(diào)基因） A：63個(gè)DEGs 的PPI 圖；B：22個(gè)核心共同DEGsFigure2 PPI analysis of the common DEGs (yellow color representing up-regulated genes,blue color representing down-regulated genes) A:PPI network of the 63 DEGs;B:The 22 common core DEGs

2.4 核心DEGs 生存分析結(jié)果

17個(gè)核心DEGs經(jīng)過Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站生存分析后，共有9個(gè)基因（CDK1、ASPM、CENPF、RRM2、CCNB1、TOP2A、PTTG1、ECT2、CDKN3）的生存分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），另8個(gè)基因的生存分析差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）（圖3）。

2.5 預(yù)后相關(guān)DEGs表達(dá)量分析結(jié)果

將上述9個(gè)與預(yù)后相關(guān)的DEGs在GEPIA網(wǎng)站進(jìn)行表達(dá)量分析后，9個(gè)基因均在HCC組織中較癌旁組織高表達(dá)（均P＜0.05）（圖4）。

2.6 高表達(dá)核心DEGs功能及通路富集分析結(jié)果

將上述9個(gè)在HCC組織中高表達(dá)的基因上傳至Metascape網(wǎng)站分析，得到功能和通路的富集分析主要集中表現(xiàn)在細(xì)胞有絲分裂的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞周期、核染色體隔離和雌配子的產(chǎn)生等方面（圖5）（表4）。

2.7 關(guān)鍵DEGs驗(yàn)證結(jié)果

在篩選出來的9個(gè)基因中選取CDK1在HCC組織和癌旁組織中的染色，結(jié)果顯示，CDK1在HCC組織中的評(píng)分為（7.871 8±1.524 9）分，在癌旁組織中的評(píng)分為（3.410 3±1.163 4）分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.429，P＜0.0001）（圖6）。

圖3 核心DEGs 生存分析圖Figure3 Survival curves of the core DEGs

圖4 9個(gè)DEGs 在組織中表達(dá)盒形圖Figure4 Box plots of expressions of the 9 DEGs

圖5 9個(gè)核心DEGs 功能和通路富集圖Figure5 Function and pathway enrichment plots of the 9 core DEGs

表4 9個(gè)核心DEGs 功能和通路富集分析數(shù)據(jù)Table4 Function and pathway enrichment data of the 9 core DEGs

圖6 免疫組化檢測(cè)CDK1 在HCC 與癌旁組織的表達(dá)Figure6 Immunohistochemical staining for CDK1 expressions in HCC and adjacent tissue

3 討 論

HCC的發(fā)生發(fā)展通常是涉及基因、環(huán)境、飲食等多種因素的共同作用過程，利用生物信息學(xué)技術(shù)準(zhǔn)確篩選出導(dǎo)致HCC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因，這對(duì)于HCC的早期診斷、精準(zhǔn)靶向治療提供了重要依據(jù)。近年來伴隨著生物信息學(xué)的蓬勃發(fā)展，大量基因芯片應(yīng)用于研究疾病的發(fā)生發(fā)展和靶向基因的篩選等方面。例如Cao等[11]利用3個(gè)GEO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物信息學(xué)分析，確定參與IL-10信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的CXCL8、CXCL1和IL-1β是潰瘍性結(jié)腸炎的前3個(gè)核心基因；Mo等[12]利用生物信息學(xué)分析確定DNAJB4作為潛在的乳腺癌標(biāo)記物；Xue等[13]綜合生物信息學(xué)分析確定了4個(gè)（CDC45、GINS2、MCM2和PCNA）可能與宮頸癌患者預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因，可作為宮頸癌潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物。本研究基于生物信息學(xué)的分析方法在GEO數(shù)據(jù)庫中篩選出近幾年的、樣本量較大的3份HCC及癌旁組織基因芯片，并在多個(gè)生物信息分析網(wǎng)站中進(jìn)行了系統(tǒng)全面的分析，最終得出CDK1（細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1）、ASPM（紡錘體微管組裝因子）、RRM2（核糖核苷酸還原酶調(diào)節(jié)亞基M2）、TOP2A（DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶2A）、CENPF（著絲粒蛋白F）、CCNB1（細(xì)胞周期蛋白B1）、PTTG1（垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因1）、ECT2（上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化序列2）、CDKN3（細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子3）與HCC發(fā)生、發(fā)展有重要關(guān)系，并最后在本研究中心選取臨床樣本進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證。篩選出的9個(gè)基因主要作用于細(xì)胞有絲分裂的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞周期、核染色體隔離和雌配子的產(chǎn)生等方面，從而引起細(xì)胞周期的紊亂、基因的突變，最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生、發(fā)展。

CDK1屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程、DNA復(fù)制和分離、細(xì)胞成熟和增殖所必需的，CDK1的異常激活通過促進(jìn)細(xì)胞增殖在腫瘤發(fā)生中起重要作用。CDK1在多種癌癥中均有表達(dá)，在結(jié)直腸癌中，CDK1作為miR-769的直接靶點(diǎn)，在癌組織中高表達(dá)，miR-769通過直接作用CDK1來抑制腫瘤進(jìn)展[14]；CDK1的表達(dá)可被嗜酸乳桿菌CICC 6074 S層蛋白下調(diào)，阻止G1細(xì)胞周期，從而發(fā)揮其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞毒活性[15]；CDK1可作為PKN蛋白磷酸化的對(duì)應(yīng)激酶，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞貼壁依耐性生長和遷移，充當(dāng)原癌基因的作用[16]；在骨肉瘤中，Huang等[17]研究證實(shí)，CDK1在骨肉瘤組織的細(xì)胞質(zhì)中陽性表達(dá)，被確定是miR-199a-3p的潛在靶基因。在甲狀腺癌中，研究者使用組織芯片證實(shí)CDK1蛋白在甲狀腺癌（THCA）組織中的表達(dá)明顯高于在非腫瘤組織中的表達(dá),CDK1基因在THCA組織中共表達(dá)的KEGG分析表明：細(xì)胞周期、甲狀腺激素合成、引起自身免疫性甲狀腺疾病等是CDK1在甲狀腺癌中表達(dá)最豐富的途徑[18]。在乳腺癌中，由于選擇性阻斷CDK1單獨(dú)或與其他治療藥物聯(lián)合使用與有效的抗癌效果有關(guān)，因此CDK1可能被認(rèn)為是乳腺癌治療的靶點(diǎn)之一[19]。在腺樣囊性癌和非小細(xì)胞肺癌中的研究表明，CDK1的高表達(dá)與癌癥患者的總體生存率較低相關(guān)，因此CDK1可作為診斷和預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物或藥物治療靶點(diǎn)之一[20-21]；在宮頸癌中，Luo等[22]的研究揭示了CDK1在宮頸癌發(fā)展過程中對(duì)基因相互作用網(wǎng)絡(luò)的綜合作用，從而表明CDK1作為治療靶點(diǎn)的潛在作用。此外，有研究[23]表明，CDK1活躍于多種腫瘤調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附的細(xì)胞周期，可作為多種癌癥的臨床預(yù)后生物標(biāo)志物。

在HCC中，CDK1的異常表達(dá)可以調(diào)節(jié)凋亡素誘導(dǎo)的凋亡，在腫瘤進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用[24]。CDK1的過度表達(dá)也被發(fā)現(xiàn)與HCC的門脈侵犯、甲胎蛋白水平高和預(yù)后不良直接相關(guān)[25]。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以通過誘導(dǎo)G2/M期阻滯來顯著抑制HCC細(xì)胞的增殖，并能有效地降低CDK1的表達(dá)[26]，提示CDK1可能參與了HCC細(xì)胞周期中的細(xì)胞增殖過程。另一項(xiàng)研究表明miR-582-5p通過直接抑制CDK1和Akt3的表達(dá)，間接抑制cyclin D1的表達(dá)來調(diào)控HCC的進(jìn)展[27]，Wang等[28]綜合生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CDK1、CCNB1、CCNB2、MAD2L1和TOP2A等5個(gè)HUB基因可作為預(yù)測(cè)肝癌預(yù)后的生物標(biāo)志物；Sun等[29]應(yīng)用生物信息學(xué)分析篩選發(fā)現(xiàn)CCNB1、CDK1、RRM2和BUB1B在肝癌組織中的過度表達(dá)與肝癌患者的不良生存相關(guān)，這些基因可能成為肝癌治療的潛在靶點(diǎn)；He等[30]通過生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)CDK1可能通過細(xì)胞周期和p53信號(hào)通路在肝硬化轉(zhuǎn)化為HCC過程中發(fā)揮重要作用。Zou等[31]發(fā)現(xiàn)CDK1、CCNB1和CCNB2是HCC潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物，并與HCC免疫細(xì)胞浸潤有關(guān)。

在HCC中，通過3組芯片共369例HCC組 織和160例癌旁組織的基因表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，CDK1在HCC組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，后期的生存分析曲線顯示CDK1高表達(dá)患者的生存時(shí)間較CDK1低表達(dá)患者明顯減少，但上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均來源于生物信息學(xué)，由于其固有缺陷如平臺(tái)與樣本選擇的不同可產(chǎn)生一定的差異，且數(shù)據(jù)信息混雜、缺乏足夠?qū)嶒?yàn)基礎(chǔ)，所以最后在本研究中心選取70例HCC組織和癌旁組織進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證，結(jié)果為CDK1在HCC組織中的評(píng)分為（7.871 8±1.524 87）分，在癌旁組織中的評(píng)分為（3.410 3±1.163 43）分，兩組進(jìn)行比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.429，P＜0.0001），與預(yù)期結(jié)果相符。

綜上所述，本研究基于生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)CDK1、ASPM、RRM2、TOP2A、CENPF、CCNB1、PTTG1、ECT2、CDKN3基因可能是HCC發(fā)生、發(fā)展的重要基因，且涉及細(xì)胞有絲分裂的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞周期、核染色體隔離和雌配子的產(chǎn)生等方面，最后，選用CDK1在HCC組織和癌旁組織中進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在HCC組織中CDK1的表達(dá)高于癌旁組織，與本研究預(yù)期結(jié)果相符。生物信息學(xué)在發(fā)現(xiàn)新靶點(diǎn)方面具有強(qiáng)大功能，但是需要分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、臨床實(shí)驗(yàn)及療效方面的研究來驗(yàn)證。這9個(gè)HCC相關(guān)基因均在HCC的發(fā)生、發(fā)展過程中具有巨大的作用，有望成為HCC篩查及治療的新靶點(diǎn)，同時(shí)也將為研究HCC的發(fā)生、發(fā)展提供一定的理論基礎(chǔ)。