張朝霞，王璋，金黎明，譚小軍，王釗穎，沈煉桔，魏光輝，何大維

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院泌尿外科，兒童泌尿生殖發(fā)育與組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地，兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400014

腎母細(xì)胞瘤是兒童泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，同 時(shí)在5歲以下兒童中，腎母細(xì)胞瘤也是最常見的實(shí)體腫瘤之一；15歲以下兒童腎母細(xì)胞瘤發(fā)生率為1/10 000，其平均發(fā)病年齡為38月［1-2］。有研究表明，小于7月齡的腎臟腫瘤患兒中，腎母細(xì)胞瘤占66%，另外34%包括惡性橫紋肌肉瘤、腎透明細(xì)胞癌等［3-4］。手術(shù)、放化療等聯(lián)合治療方式大大提高了腎母細(xì)胞瘤的生存率［5］，目前其5年總生存率高達(dá)85%，但由于其發(fā)病隱匿、病情進(jìn)展快、缺乏特異性標(biāo)志物以及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)等原因，仍有15%的患兒預(yù)后極差［6-7］。因此，研究新的診斷標(biāo)志物及治療措施對腎母細(xì)胞瘤患兒顯得尤為重要。

Piwi互作RNA又稱為piRNA，研究表明piRNA在乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、胃癌等多種實(shí)體腫瘤中有差異表達(dá)［8-10］；雖然目前對piRNA在人類癌癥中相關(guān)功能的研究尚少，但仍有證據(jù)表明piRNA在癌癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其有望作為腫瘤診斷及預(yù)后的標(biāo)志物［11-12］。目前在人類中經(jīng)證實(shí)過的piRNA 已經(jīng)超過3000個(gè)，仍有大量未經(jīng)發(fā)現(xiàn)及驗(yàn)證的piRNA存在［13］。課題組前期通過piwi12重編程成纖維細(xì)胞建立了腫瘤樣干細(xì)胞模型［14-16］，并通過高通量測序篩選出部分未經(jīng)報(bào)道的差異表達(dá)piRNA序列；經(jīng)初步驗(yàn)證，腎母細(xì)胞瘤組織中低表達(dá)的piRNA NU13可能對鑒別兒童腎母細(xì)胞瘤組織和正常腎臟組織具有參考價(jià)值，并且通過生信分析預(yù)測其靶基因?yàn)镹OP56［17］。但piRNANU13是否參與腎母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展及其是否靶向調(diào)控NOP56的表達(dá)仍需進(jìn)一步研究，因此本研究將進(jìn)一步探討piRNA NU13對腎母細(xì)胞瘤增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響，以期為腎母細(xì)胞瘤提供新的診斷標(biāo)志物和治療方法。

1 材料和方法

1.1 主要儀器與試劑

腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞G401、腎小管上皮細(xì)胞HK2（中科院上海生物細(xì)胞研究所），RNA濃度檢測儀（nanodrop），酶標(biāo)儀，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（contar），胎牛血清（Gibco），5A培養(yǎng)基（Gibco），胰酶（Gibco），TRIzo1 試劑（Thermo），miRNA反轉(zhuǎn)錄第一鏈試劑盒/miRNA qRT-PCR 試劑盒[天根]，1ipo LipofectamineTM2000（invitrogen），cck8 試劑盒（MCE），Annexin V FITC 凋亡試劑盒（BD），transwe11小室（康寧），基質(zhì)膠（BD），結(jié)晶紫（碧云天）。

1.2 臨床標(biāo)本

本研究所用臨床標(biāo)本來源于課題組前期收集的重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院泌尿外科2015年6月～2019年6月入院治療的腎母細(xì)胞瘤患兒的手術(shù)標(biāo)本，均為首次行腫瘤切除術(shù)并經(jīng)病理科2位醫(yī)師證實(shí)為腎母細(xì)胞瘤組織。本研究獲得重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，且標(biāo)本均在患兒監(jiān)護(hù)人知情同意后獲取。標(biāo)本具體信息見文獻(xiàn)［17］。

1.3 方法

1.3.1 piRNA NU13模擬物、抑制劑及對照序列的設(shè)計(jì)和合成 piRNA NU13的模擬物及其對照序列、抑制劑及其對照序列分別命名為Mimics、Mimics NC、Inhibitor、Inhibitor NC（表1），以上序列均由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成。文中piRNA NU13已申請知識產(chǎn)權(quán)專利保護(hù)，專利號：202010201315.8。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) HK2 用含10%胎牛血清DMEM/f12培養(yǎng)基培養(yǎng)，G401用含10%胎牛血清的McCoy's 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件均為5%CO2、37 ℃。

表1 piRNANU13模擬物、抑制劑及其對照序列Tab.1 piRNANU13 interference sequences

1.3.3 腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞株G401 過表達(dá)及抑制piRNA NU13 G401 常規(guī)培養(yǎng)至70%～80%融合度，將NU13 Mimics、NU13 Mimics NC、NU13 Inhibitor、NU13 Inhibitor NC經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)入G401細(xì)胞中，按照1ipo LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作，各組RNA轉(zhuǎn)染濃度為50 nmo1/L，轉(zhuǎn)染后置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.4 總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR G401、HK2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)至80%融合度時(shí)收集細(xì)胞，同樣收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組G401細(xì)胞，用trizo1試劑提取總RNA，使用miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，U6為內(nèi)參，采用miRNA qRT-PCR試劑盒進(jìn)行檢測，反應(yīng)模式為：預(yù)變性95 ℃30 s；PCR反應(yīng)變性95 ℃5 s，退火延伸64 ℃45 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-△△ct方法分析piRNA NU13在細(xì)胞中的相對表達(dá)水平。piRNA NU13引物由生工生物工程有限股份公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見表2。

表2 piRNANU13及內(nèi)參照引物序列Tab.2 piRNANU13 and U6 sequence-specific primers

1.3.5 CCK-8檢測G401細(xì)胞增殖能力 取對數(shù)生長期的G401細(xì)胞，0.25%胰酶消化制備成單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，按5×103/孔接種于96孔板，每組6個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，分別用Mimics、Inhibitor及相應(yīng)的陰性對照轉(zhuǎn)染G401細(xì)胞，置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)0、24、48、72 h后，去除廢液，每孔加入10 μL cck8工作液及90 μL新鮮的培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀讀取吸光度值，繪制細(xì)胞生長曲線。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.6 流式細(xì)胞細(xì)胞術(shù)檢測G401細(xì)胞凋亡能力 于6孔板中培養(yǎng)G401細(xì)胞，分組轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組G401細(xì)胞，無EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，冷PBS洗滌兩次對結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為1×106/mL，每組細(xì)胞取100 μL，加入膜聯(lián)蛋白-V-異硫氰酸熒光素（AnnexinV-FITC）和碘化丙啶各5 μL進(jìn)行染色，室溫避光孵育15 min，然后在流式細(xì)胞儀上對細(xì)胞進(jìn)行分析。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測G401細(xì)胞遷移能力 轉(zhuǎn)染24 h的各組G401細(xì)胞按5×105/孔接種至6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至完全鋪滿培養(yǎng)皿，用20 μL的無菌槍頭在6孔板內(nèi)垂直劃線，制造一個(gè)均勻的傷口，劃痕后用PBS洗去碎片，添加無血清的McCoy's 5A培養(yǎng)基，在5%CO2、37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0、24、48 h，置于倒置顯微鏡下觀察劃痕并拍照，利用Image J軟件分析細(xì)胞遷移的距離。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.8 Transwe11實(shí)驗(yàn)檢測G401細(xì)胞侵襲能力 轉(zhuǎn)染48 h后收集G401細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，用無血清McCoy's 5A培養(yǎng)基重懸細(xì)胞（調(diào)整密度為1×105/mL），取200 μL細(xì)胞懸液接種至8 μm濾膜微孔的Transwe11小室上層（Transwe11小室基底膜預(yù)先用1∶8的matrige1基質(zhì)膠包被），下層加入600 μL含10%FBS的McCoy's 5A培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出小室，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，小室基底膜風(fēng)干后顯微鏡下隨機(jī)選5個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.9 Western b1ot檢測腎母細(xì)胞瘤組織及G401細(xì)胞中BAX、Bc12、MMP2、MMP9 及NOP56 表達(dá)情況 取腎母細(xì)胞瘤組織及癌旁組織，用含1%PMSF的蛋白裂解液RIPA 裂解，12 000×g 離心20 min，取上清液。PiRNA NU13轉(zhuǎn)染72 h的G401細(xì)胞用同樣方法提取蛋白。BCA法檢測蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳，半干電轉(zhuǎn)將蛋白從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)至PVDF膜，快速封閉液封閉10 min，一抗BAX（1∶1000）、Bc12（1∶1000）、MMP2（1∶1000）、MMP9（1∶1000）、NOP56（1∶1000）于4度過夜。用TBST清洗3次，室溫孵育二抗1 h，顯影后保存圖像，Image 1ab分析灰度值。

1.3.10 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測NOP56與piRNA的結(jié)合課題組前期通過生信分析預(yù)測出piRNA NU13的靶基因?yàn)镹OP56，進(jìn)一步經(jīng)B1ast 比對分析NOP56 與piRNA NU13的結(jié)合位點(diǎn)。將帶有piRNA NU13結(jié)合位點(diǎn)的NOP56 3'UTR 野生型序列插入pGL3 載體（GeneBio，上海，中國）中，構(gòu)建熒光素酶報(bào)道載體NOP56 3'UTR-WT。同樣，通過突變piRNA的潛在靶位點(diǎn)，建立了NOP56 3'UTR-MUT 報(bào)告載體。 使用Lipofectamine?2000（Invitrogen,Car1sbad,CA,USA）在G401中與重組載體piRNA模擬物和NC質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。共轉(zhuǎn)染后48 h，根據(jù)制造商的說明使用Dua1-Luciferase ReporterAssay Kit（Promega）測量螢火蟲和海腎熒光素酶的活性，并根據(jù)海腎/螢火蟲熒光素酶基因的活性計(jì)算值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)分析用GraphPad8.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間均數(shù)的比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 piRNANU13在腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞G401中低表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果顯示，與人腎小管上皮細(xì)胞HK2相比，piRNA NU13在人腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞G401中低表達(dá)（P＜0.05，圖1）。

圖1 腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞G401和腎小管上皮細(xì)胞HK2中piRNANU13的表達(dá)Fig.1 Expression of piRNA NU13 in Wilms tumor cell line G401 and renal tubular epithelial cells HK2.*P＜0.05.

2.2 在腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞G401 中成功過表達(dá)及抑制piRNANU13

RT-qPCR結(jié)果顯示，與Mimics NC組相比，Mimics組piRNA NU13的表達(dá)量明顯上調(diào)；與Inhibitor NC組相比，piRNA NU13 在Inhibitor 組的表達(dá)量下調(diào)（P＜0.05，圖2）。

圖2 在腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞G401 中成功過表達(dá)及抑制piRNANU13Fig.2 Over-expression and knockdown of piRNA NU13 in G401 cells.**P＜0.01;*P＜0.05.

2.3 過表達(dá)piRNA NU13 抑制G401 細(xì)胞增殖，抑制piRNANU13促進(jìn)G401細(xì)胞增殖

CCK8結(jié)果顯示，與Mimics NC組相比，Mimics組G401細(xì)胞生長受到明顯抑制；與Inhibitor NC組相比，Inhibitor組細(xì)胞生長能力明顯增強(qiáng)，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

圖3 過表達(dá)piRNA NU13抑制腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞G401增殖，下調(diào)piRNANU13促進(jìn)G401細(xì)胞增殖Fig.3 The proliferation of G401 cells is inhibited by overexpression of piRNA NU13 and promoted by piRNA NU13 knockdown. *P＜0.05, Mimics group vs Mimics NC group;**P＜0.01,Inhibitor group vs Inhibitor NC group.

2.4 過表達(dá)piRNA NU13 促進(jìn)G401 細(xì)胞凋亡，抑制piRNANU13抑制G401細(xì)胞凋亡

與Mimics NC組相比，Mimics組細(xì)胞凋亡率明顯增多；與Inhibitor NC組相比，Inhibitor組細(xì)胞凋亡率明顯減少，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4）。

2.5 過表達(dá)piRNA NU13 抑制G401 細(xì)胞遷移，下調(diào)piRNANU13促進(jìn)細(xì)胞遷移

劃痕實(shí)驗(yàn)檢結(jié)果顯示，與Mimics NC 組相比，Mimics 組細(xì)胞遷移能力能力明顯受到抑制；與Inhibitor NC組相比，Inhibitor組細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖5）。

2.6 過表達(dá)piRNA NU13 抑制G401 細(xì)胞侵襲,下調(diào)piRNANU13促進(jìn)401細(xì)胞侵襲

Transwe11 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Mimics NC組相比，Mimics組細(xì)胞侵襲能力明顯減弱；與Inhibitor NC組相比，Inhibitor組細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng)，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖6）。

2.7 piRNANU13對BAX、Bc12蛋白表達(dá)的影響

與癌旁組織相比，腎母細(xì)胞瘤組織中BAX低表達(dá)，Bc12高表達(dá)（P＜0.05，圖7A）；過表達(dá)piRNA NU13促進(jìn)BAX 表達(dá)，抑制Bc12 表達(dá)；下調(diào)piRNA NU13 抑制BAX表達(dá)，促進(jìn)Bc12表達(dá)（P＜0.05，圖7B）。

2.8 piRNANU13對MMP2及MMP9蛋白表達(dá)的影響

與癌旁組織相比，MMP2及MMP9在腎母細(xì)胞瘤組織中高表達(dá)（P＜0.05，圖8A）；過表達(dá)piRNA NU13后腎母細(xì)胞瘤G401細(xì)胞中MMP2及MMP9的表達(dá)量均明顯下降；下調(diào)piRNA NU13后MMP2及MMP9蛋白表達(dá)量均明顯提高（P＜0.05，圖8B）。

2.9 piRNANU13間接調(diào)控NOP56表達(dá)

與癌旁組織相比，piRNA NU13 的預(yù)測靶基因NOP56在腎母細(xì)胞瘤組織中高表達(dá)（P＜0.05，圖9A）；RT-q PCR 結(jié)果顯示，與腎小管上皮細(xì)胞HK2 相比，NOP56 在腎母細(xì)胞瘤G401 細(xì)胞中同樣高表達(dá)（P＜0.05，圖9B）；經(jīng)B1ast比對出NOP56與piRNA NU13的結(jié)合位點(diǎn)（圖9C），雙熒光素酶結(jié)果為陰性，提示NOP56與piRNA NU13并非直接結(jié)合（P＞0.05，圖9D）；過表達(dá)piRNA NU13，NOP56 蛋白表達(dá)量下降，下調(diào)piRNA NU13后NOP56蛋白表達(dá)量明顯提高（P＜0.05，圖9E）。

圖4 過表達(dá)piRNANU13促進(jìn)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞G401凋亡，下調(diào)piRNANU13抑制G401細(xì)胞凋亡Firg4 Over-expression of piRNANU13 promotes while piRNANU13 knockdown inhibits apoptosis of G401 cells.**P＜0.01.

圖5 過表達(dá)piRNANU13抑制腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞G401遷移，下調(diào)piRNANU13促進(jìn)G401細(xì)胞遷移Fig.5 Over-expression of piRNA NU13 inhibits while piRNA NU13 knockdown promotes migration of G401 cells(Original magnification:×100).*P＜0.5,**P＜0.01.

3 討論

腎母細(xì)胞瘤占兒童所有惡性腎臟腫瘤的90%以上，隨著治療手段的提高，目前其總生存率已經(jīng)高達(dá)85%［18］。但由于腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)以及對放化療抵抗等原因，仍有部分患兒無法治愈［19-20］。研究表明，腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)以及耐藥是由于腫瘤干細(xì)胞的存在［21-22］，本課題組前期通過piwi12重編程人成纖維細(xì)胞，已經(jīng)成功構(gòu)建出理想的腫瘤干細(xì)胞模型［14-16］，而piRNA與piwi蛋白的相互聯(lián)系可能是使其構(gòu)建成功的關(guān)鍵。piRNA作為與piwi蛋白緊密聯(lián)系的一類sncRNA，已經(jīng)有許多研究顯示其在人類腫瘤中異常表達(dá)，強(qiáng)調(diào)了piRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要性［23-25］。RTqPCR以及下一代測序技術(shù)更加明確了piRNA與致癌作用之間的關(guān)系［8］?；诖?，我們前期通過高通量測序篩選出在腫瘤樣干細(xì)胞模型中差異表達(dá)的新型piRNA，并用RTqPCR技術(shù)在腎母細(xì)胞瘤組織中進(jìn)一步驗(yàn)證，初步發(fā)現(xiàn)了新型piRNA NU9、NU13、ND5、ND7、ND9 對鑒別兒童腎母細(xì)胞瘤的腫瘤組織與正常腎組織具有參考價(jià)值［17］。

有國外學(xué)者分析了包含11個(gè)器官的腫瘤組織及癌旁組織的6000多個(gè)轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)在所有腫瘤組織共有522個(gè)piRNA特異性表達(dá)［26］。研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)piRABC能抑制膀胱癌細(xì)胞增殖、克隆形成并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［27］；過表達(dá)piR39980會抑制纖維肉瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和集落形成［28］；piR36712作為一種新型腫瘤抑制因子，可預(yù)測乳腺癌患者預(yù)后［24,29］。以上研究顯示出piRNA可能影響腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，并且piRNA可能為腫瘤診斷、預(yù)后評估提供新的指標(biāo)。有研究發(fā)現(xiàn)，通過對冰凍良性腎組織及腎細(xì)胞癌組織進(jìn)行小RNA測序分析顯示在腎組織中有26 991 個(gè)piRNA 表達(dá)［29］，但piRNA在腎母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展及治療中的作用鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。

本課題組前期發(fā)現(xiàn)piRNA NU13在34例腎母細(xì)胞瘤組織中表達(dá)量明顯下降，并通過生信分析預(yù)測其靶基因?yàn)镹OP56［17］，NOP56為小分子核仁核糖核蛋白復(fù)合物的組成部分，可參與核糖體RNA前體核糖甲基化的修飾［30］。研究表明，NOP56在結(jié)腸癌中高表達(dá)，沉默NOP56會大大降低結(jié)腸癌細(xì)胞的活性［31］，NOP56的過表達(dá)與急性淋巴細(xì)胞白血病的復(fù)發(fā)有關(guān)［32］，NOP56的異常表達(dá)與Burkitt淋巴瘤的Myc基因突變有關(guān)［33］，以上研究均表明NOP56在癌癥中高表達(dá)，且與癌癥復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)；然而，有研究表明NOP56高表達(dá)可改善轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌的預(yù)后［34］。因此，NOP56在癌癥中的表達(dá)與作用尚未有統(tǒng)一的結(jié)論。

我們假設(shè)piRNA NU13可能通過某種機(jī)制參與調(diào)控腎母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。但由于piRNA NU13屬于新型piRNA，目前仍未有文獻(xiàn)對其進(jìn)行深入研究，本研究首次在腎母細(xì)胞瘤G401細(xì)胞中對其表達(dá)情況及作用進(jìn)行初步探索。本研究結(jié)果顯示，piRNA NU13在腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞G401中低表達(dá)，與課題組前期發(fā)現(xiàn)的piRNA NU13在腎母細(xì)胞瘤組織中低表達(dá)結(jié)論一致。本研究結(jié)果顯示上調(diào)piRNA NU13會抑制腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，并抑制其凋亡；反之，下調(diào)piRNA NU13后，腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力增強(qiáng)，同時(shí)細(xì)胞凋亡減少。有研究表明MMP2及MMP9與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［35-36］；本研究Western b1ot結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，MMP2、MMP9在腎母細(xì)胞瘤組織中高表達(dá)，同時(shí)，過表達(dá)piRNA NU13 后G401細(xì)胞中MMP2及MMP9蛋白表達(dá)水平下降，提示piRNA NU13 可能通過下調(diào)MMP2 及MMP9 表達(dá)抑制腎母細(xì)胞瘤遷移及侵襲。凋亡缺陷是癌癥發(fā)展和進(jìn)展的主要原因，Bc12 家族成員是凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［37］。有研究發(fā)現(xiàn)Bc12及Bc12/BAX在肺類癌癥中表達(dá)水平較高，并證明Bc12減毒或提高BAX表達(dá)量可能對肺類癌癥治療有效［38］。本研究結(jié)果顯示，Bc12在腎母細(xì)胞瘤組織中同樣高表達(dá)，而BAX在腎母細(xì)胞瘤組織中低表達(dá)，表明Bc12可能通過抑制腎母細(xì)胞瘤凋亡而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展；同時(shí)，過表達(dá)piRNA NU13會上調(diào)BAX表達(dá)水平并抑制Bc12表達(dá)水平，提示piRNA NU13可通過調(diào)節(jié)Bc12家族表達(dá)水平抑制腫瘤進(jìn)展。本研究初步證實(shí)了piRNA NU13可能對腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞具有抑制作用，顯示出piRNA NU13可能作為抑癌基因參與調(diào)控腎母細(xì)胞瘤的惡性生物學(xué)行為。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)其預(yù)測的靶基因NOP56在腎母細(xì)胞瘤組織中及腎母細(xì)胞瘤G401細(xì)胞中高表達(dá)；因此我們猜測piRNA NU13可能通過靶向調(diào)控NOP56的表達(dá)從而抑制腎母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。而雙熒光素酶結(jié)果陰性表明，piRNA NU13 非直接靶向NOP56 的表達(dá)，而過表達(dá)piRNA NU13后NOP56蛋白表達(dá)下降，反之明顯提高。有研究表明，piRNA與miRNA不同，大多數(shù)piRNA與潛在靶基因的mRNA不互補(bǔ)，這表明piRNA可能參與表觀遺傳調(diào)控，而不是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，以控制包括癌癥在內(nèi)的多種生物學(xué)現(xiàn)象［39］。因此本研究猜測piRNA NU13可能間接調(diào)控NOP56表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控腎母細(xì)胞瘤的增殖、遷移、侵襲，從而發(fā)揮其抑癌基因的作用。

綜上所述，piRNA NU13在腎母細(xì)胞瘤組織及腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)，并且過表達(dá)piRNA NU13可抑制腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，顯示其抑癌基因的作用。此發(fā)現(xiàn)為我們進(jìn)一步探索腎母細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制及治療靶點(diǎn)提供新的思路及依據(jù)。但由于piRNA NU13為新型piRNA，目前沒有文獻(xiàn)報(bào)道其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，因此對其在腎母細(xì)胞瘤中的具體調(diào)控機(jī)制及下游通路仍需進(jìn)一步研究。