康 瀚，王 羽，鐘曉紅，殷 偉，李 芳，蔣建平

南方醫(yī)科大學(xué)1南方醫(yī)院腎內(nèi)科，2動物實驗管理中心，廣東 廣州510515

在慢性腎臟病病人心腦血管事件發(fā)生、發(fā)展的眾多危險因素中，殘余腎功能（RRF）的減退是病人發(fā)生心腦血管事件的獨立危險因素［1］。腹膜透析病人的殘余腎功能對病人的預(yù)后起關(guān)鍵作用［2］。保護(hù)腹膜透析患者殘余腎功能有利于控制容量負(fù)荷、減輕心室肥厚的嚴(yán)重程度、緩解機(jī)體炎癥狀態(tài)。有殘余腎功能的腹膜透析病人食欲、膳食蛋白質(zhì)和總熱量攝取比較殘余腎功能完全喪失的病人均有增強［3］。控制血壓、減少尿蛋白、控制患者容量負(fù)荷以及使用腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)阻滯劑，是目前公認(rèn)的能延緩殘余腎功能減退的重要手段［4］。

既往的研究提示高鹽攝入可引起血壓升高、水鈉潴留、容量負(fù)荷增加［5］，同時還進(jìn)一步使腎血流量和腎小球的壓力增加，加重殘余腎單位高灌注［6］，增加尿蛋白排泄量［7］。高鹽的攝入使腎臟氧化應(yīng)激活化［8］，導(dǎo)致腎臟局部RAS系統(tǒng)活化［9-10］，促進(jìn)腎臟炎癥、腎臟纖維化等多種病理改變，造成了腎臟進(jìn)一步的損傷［11］。以Dah1鹽敏感大鼠為實驗對象的研究結(jié)果提示，低鹽對殘余腎臟纖維化的影響更?。?2］，支持上述理論。但有臨床研究發(fā)現(xiàn)低鹽的攝入可使腹膜透析患者的全因死亡率上升［13］，鈉攝入量與心血管病人死亡率呈負(fù)相關(guān)［14-16］。探索適合腹膜透析患者的攝鹽量是非常必要的。

我們前期的臨床研究結(jié)果提示，腹透患者殘余腎功能的下降和攝鈉量相關(guān)，高鈉飲食可使殘余腎功能下降更快［17］。但目前臨床研究樣本量不大，且缺乏深入的機(jī)制探索，本研究利用5/6腎切除的CKD大鼠腹膜透析模型，更精準(zhǔn)地觀察飲食中鹽的攝入對腹膜透析大鼠殘余腎功能的影響，并進(jìn)一步探討腹膜透析狀態(tài)下鹽對殘余腎功能影響的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動物

6～8周齡、體質(zhì)量約為220～250 g的健康雄性SD大鼠[南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心（SCXK(粵）2016-0041）]，飼養(yǎng)在SPF環(huán)境中（SYXK(粵）2016-0167）。所有動物實驗均經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 分組

36只SD大鼠隨機(jī)分為2組，每組18只，一組為腹膜透析組（慢性腎衰+規(guī)律腹膜透析），一組為對照組（慢性腎衰未腹透組），每組再根據(jù)所喂含0.02%NaC1、0.4%NaC1、4%NaC1的飼料，分為3個亞組，每個亞組各6只，分別為：規(guī)律腹膜透析+低鹽飲食（0.02%NaC1）、規(guī)律腹膜透析+正常鹽飲食（0.4%NaC1）、規(guī)律腹膜透析+高鹽飲食（4%NaC1）、慢性腎衰+低鹽飲食（0.02%NaC1）、慢性腎衰+正常鹽飲食（0.4%NaC1）、慢性腎衰+高鹽飲食（4%NaC1）組。

1.3 動物模型的建立

采用5/6腎切除的方法建立SD大鼠慢性腎衰竭（CRF）的模型［18］。SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后行5/6腎切除，術(shù)后第8 周對腹透組大鼠行腹透管植入術(shù)［19］。腹透組大鼠5/6 腎切除第9 周開始給予腹膜透析治療，腹膜透析方案：每次以2.5%的低鈣葡萄糖腹透液10 mL/100 g腹腔內(nèi)注入，每次留腹4 h，透析3次/d，夜間不留腹。

1.4 標(biāo)本的采集

分別于5/6腎切除術(shù)8周后和12周后使用大鼠代謝籠采集24 h尿液，記錄尿量后取樣1 mL尿液標(biāo)本凍存。使用剪尾法采集血液標(biāo)本，4 ℃靜置6 h后，4 ℃離心（3000 r/min，10 min），取上清凍存。腹膜透析治療4周后采集腹透流出液標(biāo)本。5/6腎切除術(shù)12周后戊巴比妥麻醉處死大鼠，取腎臟組織用于石蠟包埋和制備腎皮質(zhì)勻漿。

1.5 肌酐和鈉濃度的測定

用自動化學(xué)分析儀（AU480；Beckman Cou1ter）測量采集的血清、尿液和腹透流出液的肌酐、鈉濃度。

1.6 腎纖維化的評估

大鼠取殘余腎臟固定于10%福爾馬林中24 h后，進(jìn)行石蠟包埋。制成2 μm 厚切片進(jìn)行馬森三色染色（Masson 染色）和高碘酸-希夫染色（PAS 染色），使用Image pro p1us進(jìn)行半定量分析評估腎小球硬化指數(shù)［18］和間質(zhì)纖維化分級評分［20］。

1.7 RAS的表達(dá)和活性

采用Western B1ot 分析方法，使用抗AGT（IBL，JP28101）、抗ACE-1（abcam，ab11734）、抗AT1 受體（abcam，ab18801）檢測腎皮質(zhì)勻漿中RAS組分的水平。

1.8 統(tǒng)計分析

使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析處理。符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示。采用配對樣本t檢驗對透析治療前后生化指標(biāo)進(jìn)行比較；采用兩獨立樣本t檢驗對腹透組和對照組間進(jìn)行比較；腹透組和對照組組內(nèi)不同鹽飲食亞組間對比分析采用單因素方差分析（ONE-WAY ANOVA），組間兩兩對比采用LSD-t檢驗。對于等級資料、不符合正態(tài)分布或符合正態(tài)分布但方差不齊的計量資料，則采用非參數(shù)的檢驗方法。相關(guān)性分析使用Spareman相關(guān)性分析。均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同鹽飲食對大鼠血肌酐的影響

大鼠5/6腎切除8周后，腹透組和對照組血肌酐濃度無明顯差異（P=0.856）。12周后，透析組大鼠血肌酐較8周后無明顯差異（P=0.939），而對照組大鼠血肌酐明顯高于8周后（P=0.004）；對照組血肌酐濃度明顯大于腹透組（P=0.023，表1）。

在腹透組大鼠中，5/6腎切除8周后，給予高鹽、正常鹽和低鹽喂養(yǎng)的大鼠血肌酐未見明顯差異（P=0.588），透析前后血肌酐變化幅度也未見顯著差異（P=0.196）。對照組三個亞組中的大鼠血肌酐均出現(xiàn)不同程度的上升，且攝鹽量越大，上升越明顯。同樣喂以高鹽飲食，腹透組大鼠血肌酐上升幅度小于對照組大鼠（P＜0.05）；正常鹽喂養(yǎng)的大鼠，腹透組血肌酐上升幅度與對照組無顯著差異（P=0.207）；低鹽喂養(yǎng)的大鼠，腹透組血肌酐上升幅度明顯小于對照組大鼠（P＜0.05，表2）。

通過殘余腎肌酐清除率的分析發(fā)現(xiàn)，腹透治療組中，給與高鹽、正常鹽和低鹽喂養(yǎng)的大鼠肌酐清除率均出現(xiàn)了不同程度的下降（P=0.092），高鹽攝入組下降趨勢明顯，尤其較低鹽攝入組大鼠下降幅度更大（P=0.040）。對照組各組大鼠肌酐清除率也出現(xiàn)了不同程度下降（P=0.028），攝鹽量越大，肌酐清除率下降幅度越大。同樣喂以高鹽飲食，腹透組大鼠肌酐清除率下降幅度小于對照組（P=0.047）；無論正常鹽或低鹽喂養(yǎng)的大鼠，腹透組肌酐清除率下降幅度與對照組相比無顯著差異（P=0.057，P=0.589，表2）。

表1 5/6腎切除8周和12周后腹透組和對照組大鼠血肌酐、尿肌酐、肌酐清除率及大鼠質(zhì)量的比較Tab.1 Serum creatinine, urinary creatinine, creatinine clearance rate, and body mass of the rats in peritoneal dialysis group and control group at 8 and 12 weeks after 5/6 nephrectomy(Mean±SD)

2.2 不同鹽攝入大鼠殘腎病理的變化情況

無論是腹透組還是對照組，高鹽攝入組大鼠腎小管間質(zhì)纖維化和腎小球硬化程度均比低鹽攝入組和正常鹽攝入組大鼠重。腹透組中，低鹽攝入組大鼠和正常鹽攝入組大鼠腎小管間質(zhì)纖維化和腎小球硬化程度無明顯差異（P＞0.5）。對照組中，低鹽攝入組大鼠腎小管間質(zhì)纖維化和腎小球硬化程度最低，正常鹽攝入組次之，高鹽攝入組最重。同樣喂以高鹽飲食，腹透組大鼠腎小管間質(zhì)纖維化和腎小球硬化程度明顯輕于對照組大鼠（P＜0.05）。正常鹽喂養(yǎng)的大鼠，腹透組腎小管間質(zhì)纖維化和腎小球硬化程度與對照組無顯著差異（P=0.553，P=0.311）；低鹽喂養(yǎng)的大鼠，腹透組腎小管間質(zhì)纖維化程度與對照組無顯著差異（P=0.063），而腎小球硬化程度重于對照組（P＜0.05，圖1）。

2.3 不同鹽攝入大鼠血壓的變化情況

大鼠5/6腎切除8周后，對照組與腹透組相比，收縮壓（SBP）和舒張壓（DBP）未見明顯差異（P＞0.05）。12周后，對照組大鼠SBP和DBP明顯高于腹透組大鼠（P＜0.05）；對照組大鼠SBP和DBP上升幅度大于腹透組大鼠（P＜0.05）。腹透組大鼠中，給予低鹽和正常鹽喂養(yǎng)的大鼠SBP和DBP變化無顯著差別（P＞0.05），高鹽攝入大鼠SBP和DBP較正常鹽攝入組大鼠明顯升高（P分別為0.004和0.048）。高鹽飲食喂養(yǎng)的大鼠中，腹透組大鼠與對照組大鼠相比，兩組大鼠SBP上升幅度未見明顯差異（P＞0.05），而腹透組大鼠DBP則明顯低于對照組（P=0.000，圖2）。

2.4 鹽攝入對腎臟RAS表達(dá)的影響

取大鼠殘腎皮質(zhì)組織進(jìn)行蛋白印跡法，觀察腎臟局部RAS組分表達(dá)的變化情況。腹透組大鼠中，與正常鹽攝入組大鼠相比較，高鹽攝入組大鼠腎臟局部的血管緊張素原（AGT）、血管緊張素-1（ACE-1）和血管緊張素II 1型受體（AT-1）表達(dá)水平更高（P＜0.05）；而低鹽攝入組大鼠與正常鹽攝入組大鼠腎臟局部AGT、ACE-1和AT-1表達(dá)水平無顯著差異（P＞0.05）。對照組大鼠中，攝鹽量越大大鼠腎臟局部RAS組分AGT、ACE-1、AT-1表達(dá)水平越高。同樣在高鹽飲食喂養(yǎng)下，與對照組大鼠相比，腹透組大鼠殘余腎AGT、ACE-1表達(dá)量有減少的趨勢（P＜0.05）；正常鹽喂養(yǎng)的大鼠，腹透組AGT表達(dá)量與對照組無顯著差異（P=0.190），ACE1、AT-1明顯低于對照組（P＜0.05）；低鹽喂養(yǎng)的大鼠，腹透組AGT、ACE1表達(dá)量與對照組無顯著差異（P=0.977，P=0.699），而AT-1的表達(dá)水平明顯高于對照組（P＜0.05，圖3）。

2.5 大鼠對鈉的清除

腹透組大鼠中，低鹽攝入組和正常鹽攝入組大鼠在5/6腎切除12周后24 h尿鈉排泄量較8周后出現(xiàn)明顯降低（P＜0.05）；而高鹽攝入組大鼠24 h尿鈉排泄量則出現(xiàn)明顯增加（P＜0.05，圖4A）。對照組大鼠中，24 h尿鈉排泄量情況與腹透組大鼠相似。經(jīng)12 h腹透后，低鹽喂養(yǎng)的大鼠經(jīng)腹透凈排鈉量為-2.03±2.54 mmo1，正常鹽喂養(yǎng)的大鼠為0.56±1.24 mmo1，高鹽喂養(yǎng)的大鼠為4.83±2.07 mmo1（圖4B）。12周后，低鹽喂養(yǎng)的腹透大鼠鈉排泄總量為負(fù)值，這于對照組大鼠不同（P＜0.05）；正常鹽喂養(yǎng)的大鼠，腹透組總鈉排量與對照組大鼠無顯著差異（P=0.685）；同為高鹽飲食喂養(yǎng)，腹透組大鼠總排鈉量明顯高于對照組大鼠（P＜0.05，圖4C）。

2.6 大鼠鈉排泄總量與攝鈉量、血壓變化、腎臟RAS表達(dá)相關(guān)性分析

對大鼠攝鈉量與鈉排泄總量、血壓變化、腎臟RAS表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)：鈉的攝鈉量與總排泄量、SBP變化幅度、DBP變化幅度呈正相關(guān)；鈉的攝鈉量與ACE-1、AGT、AT-1表達(dá)量存在正相關(guān)（表3）。

表2 5/6腎切除8周和12周后各組大鼠血肌酐、尿肌酐、尿量、肌酐清除率及大鼠質(zhì)量的對比Tab.2 Serum creatinine,urinary creatinine,creatinine clearance rate,and body mass of the rats in peritoneal dialysis group and control group at 8 and 12 weeks after 5/6 nephrectomy(Mean±SD)

高鹽飲食喂養(yǎng)的12只大鼠（對照組6只，腹透組6 只）中，鈉的總排泄量與DBP 變化幅度、AGT 表達(dá)水平存在負(fù)相關(guān)（r=-0.797，P=0.002；r=-0.636，P=0.026）；與SBP 變化幅度、ACE-1 和AT-1 表達(dá)水平未見顯著相關(guān)性（r=-0.531，P=0.075；r=-0.382，P=0.221；r=-0.466，P=0.126）。

3 討論

本研究實驗結(jié)果提示，無論慢性腎衰未透析或行腹膜透析治療的大鼠，高鹽的攝入均使大鼠殘余腎功能下降加速。同時，本研究首次發(fā)現(xiàn)，腹膜透析治療的大鼠，低鹽攝入和正常鹽攝入對大鼠血壓、殘余腎功能的影響程度類似，這與慢性腎衰未透析大鼠鹽攝入量與血壓的升高、殘余腎功能下降呈正相關(guān)不同。

腎臟纖維化是CKD進(jìn)展為ESRD的共同途徑［21-23］。通過對實驗大鼠腎組織片染色觀察，我們發(fā)現(xiàn)在未透析的慢性腎衰大鼠中，不同含鹽量飼料喂養(yǎng)的大鼠，腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化程度存在差異，高鹽攝入組明顯更重，這與既往的實驗結(jié)論一致［12］。腹透組中，高鹽飲食仍明顯促進(jìn)腎臟纖維化的進(jìn)展；但低鹽攝入和正常鹽攝入的大鼠腎小球硬化指數(shù)和腎小管間質(zhì)纖維化評分并無明顯差異，兩者腎臟結(jié)構(gòu)改變程度相當(dāng)，與殘余腎肌酐清除率下降水平相符合，這是本研究的首次發(fā)現(xiàn)，但其機(jī)制并不明了。

腎臟通過一系列復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制來精確地控制水、鈉平衡［24-25］。本實驗對大鼠殘腎和腹膜24h鈉清除情況進(jìn)行了觀察。殘余腎臟和腹膜對大鼠體內(nèi)鈉平衡的調(diào)節(jié)都起到了重要作用。對照組大鼠通過殘腎進(jìn)行鈉排泄，隨著大鼠攝鈉量的增加鈉排泄量也相應(yīng)增加。腹透組大鼠能通過殘腎和腹膜兩種途徑進(jìn)行鈉清除，隨著大鼠攝鈉量的增加，殘腎的鈉排泄量隨之增加；但低鹽飲食的大鼠腹透液凈排鈉量為負(fù)值，其經(jīng)腹膜透析獲得的鈉補充；而正常鹽和高鹽飲食的大鼠，隨攝鈉量的增加，經(jīng)腹膜透析排鈉量也相應(yīng)升高。通過計算總排鈉量，我們發(fā)現(xiàn)同樣給予高鹽飲食喂養(yǎng)，腹透組大鼠排鈉量明顯高于對照組；同樣給予低鹽飲食，對照組大鼠排鈉量極少，而腹透組大鼠總排鈉量呈負(fù)值，腹膜透析的鈉反向進(jìn)入了體內(nèi)補充了大鼠鈉攝入的不足。這提示腹膜透析通過調(diào)節(jié)機(jī)體鈉的平衡，或彌補鈉攝入不足或協(xié)助排鈉減緩了高鹽飲食對大鼠殘余腎臟的不利影響。從病理改變的結(jié)果看，同樣給與高鹽飲食喂養(yǎng)，腹透組大鼠腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化程度明顯較對照組大鼠輕，腹膜透析一定程度上緩解了高鹽飲食對CKD大鼠纖維化的影響。這提示體內(nèi)鈉平衡對殘余腎功能可能存在影響。

不同鹽飲食通過影響血壓、容量負(fù)荷、腎臟局部RAS的激活等多種方式對殘余腎功能產(chǎn)生影響。高血壓是鹽影響殘余腎功能的主要途徑之一［26］。CKD大鼠鹽攝入量越大，大鼠血壓升高幅度也越大。本研究對慢性腎衰大鼠攝鈉量的分析，發(fā)現(xiàn)攝鈉量與SBP和DBP變化幅度存在顯著相關(guān)，隨著攝鈉量的增加，SBP 和DBP隨之升高，對腎臟造成的損傷也越重，這與以往研究結(jié)論一致［12］。但在接受腹膜透析治療的慢性腎衰大鼠，高鹽飲食使大鼠SBP和DBP上升幅度明顯大于低鹽攝入組和正常鹽攝入組大鼠；但由于通過腹膜透析能補給低鹽攝入大鼠的攝鈉不足，使得低鹽攝入組大鼠和正常鹽攝入組大鼠SBP和DBP變化幅度無明顯差異。這在以往的研究中并未見報道。這種現(xiàn)象可能仍與體內(nèi)鈉平衡有關(guān)。

表3 大鼠攝鈉量與鈉排泄總量、血壓變化、RAS表達(dá)相關(guān)性分析Tab.3 Correlation between sodium intake and total sodium excretion, changes of blood pressure, and renal RAS expression in the rats

圖1 大鼠腎組織腎小管間質(zhì)纖維化和腎小球硬化情況Fig.1 Renal tubulointerstitial fibrosis and glomerular sclerosis in rat renal tissue.A:Masson staining and PAS staining of rat renal tissue. B: Tubulointerstitial fibrosis scoreof rat renal tissue. C: Glomerulosclerosis index of rat renal tissue. *P＜0.05, low or high salt intake group versus normal salt intake group in peritoneal dialysis group;#P＜0.05,low or high salt intake group vs normal salt intake group in the control group.PAS:Periodic acid-Schiff.

圖2 大鼠血壓變化Fig.2 Change in SBP (A) and DBP (B) of the rats. *P＜0.05, low or high salt intake group vs normal salt intake group in peritoneal dialysis group;#P＜0.05, low or high salt intake group vs normal salt intake group in the control group.SBP:Systolic blood pressure.DBP: Diastolic blood pressure.

圖3 大鼠腎臟AGT、ACE-1、AT-1 Western b1ot檢測和蛋白表達(dá)定量Fig.3 Western blot analysis of AGT, ACE-1, and AT-1 in the renal tissues of the rats (A) and quantitative assessment of protein expressions (B). *P＜0.05, low or high salt intake group vs normal salt intake group in the peritoneal dialysis group;#P＜0.05,low or high salt intake group vs normal salt intake group in the control group.

腎臟局部RAS的激活是加速殘余腎功能下降的重要機(jī)制，其參與腎臟炎癥［27］和纖維化的進(jìn)程［28］，有報道指出腎臟ACE活性的升高可用于預(yù)測大鼠腎臟疾病模型的腎臟損傷［29］。同時腎臟局部RAS的激活使得轉(zhuǎn)化生長因子—β1 mRNA和蛋白表達(dá)增加［6,30］，介導(dǎo)腎臟纖維化的發(fā)生。阻斷腎臟RAS的激活能有效減輕腎臟纖維化［31］，通過適當(dāng)控制鈉的攝入能減輕腎內(nèi)RAS的激活表達(dá)［32］。我們的研究中發(fā)現(xiàn)：CKD大鼠腎臟RAS組分AGT、ACE-1和AT-1的表達(dá)水平隨攝鈉量的增加而增加。無論是腹透組還是CRF未腹透組，高鹽喂養(yǎng)4周后腎臟局部RAS組分如AGT、ACE-1和AT-1表達(dá)均明顯增高。但同為高鹽飲食飼養(yǎng)條件下，腹透組大鼠腎臟局部AGT、ACE-1表達(dá)量卻比對照組有所減少。通過對高鹽攝入組大鼠鈉總排泄量與AGT表達(dá)水平之間相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，兩者存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.636，P=0.026），推測這可能與高鹽攝入的腹透組大鼠鈉總排泄量大于對照組大鼠有關(guān)。腹透組中，低鹽攝入的大鼠腎臟AGT、ACE-1和AT-1表達(dá)量與正常鹽喂養(yǎng)的大鼠無差異，其機(jī)制目前尚不清楚，這種現(xiàn)象可能仍與腹透維持體內(nèi)鈉平衡存在一定的關(guān)聯(lián)。

總之，在腹透大鼠和慢性腎衰未透析大鼠中，高鹽飲食的攝入均促使腎臟RAS系統(tǒng)激活，血壓升高，腎纖維化加重，加速大鼠殘余腎功能下降。腹膜透析通過對鈉的清除，部分減輕了高鈉飲食對慢性腎衰大鼠殘余腎功能的損傷。

圖4 大鼠鈉清除的情況Fig.4 Sodium excretion of rats. (A) Sodium excretion by the urine. *P＜0.05, 12 weeks vs 8 weeks inperitoneal dialysis group;#P＜0.05, 12 weeks vs 8 weeks in the control group. (B) Sodium excretion by peritoneal dialy sisafter 12 weeks.*P＜0.05, loworhigh salt intake group vs normal salt intake group in peritoneal dialysis group;#P＜0.05, loworhigh salt intake group vs normal salt intake group in the control group. (C) Total sodium excretion after 12 weeks. *P＜0.05,loworhigh salt intake group vs normal salt intake group inperitoneal dialysis group;#P＜0.05, loworhigh salt intake group vs normal salt intake group in the control group.