周長琳，鄭學(xué)寶，黃曉其，蘇冀彥，李木霞，陳志維，李敏瑤，遲宏罡

1廣東醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 湛江524023；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州510006；3東莞廣州中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院，廣東 東莞523000；4佛山市婦幼保健院南方醫(yī)科大學(xué)附屬佛山婦幼保健院科研實驗室，廣東 佛山528000；5廣東醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 東莞523000

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種慢性、復(fù)發(fā)性腸道炎癥性疾病。UC 的常規(guī)治療藥物如5-氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等存在停藥后易復(fù)發(fā),長期用藥副反應(yīng)多等缺點［1］。黃芩湯治療UC的機制研究多集中于抗炎、調(diào)節(jié)免疫及腸道菌群等［2-5］，前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芩湯能夠調(diào)節(jié)UC大鼠Th細胞亞群細胞因子分泌的平衡，緩解實驗大鼠癥狀［6-8］。但黃芩湯在治療UC過程中具體通過哪些上游靶標來調(diào)節(jié)Th細胞亞群平衡有待進一步探討。三型固有淋巴細胞（ILC3s）對UC發(fā)展過程中的Th細胞免疫反應(yīng)具有重要的調(diào)節(jié)作用［9-11］，其通過主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ類（MHCⅡ）分子依賴性方式提呈抗原，促進致炎性Th細胞凋亡，極可能成為UC治療藥物的潛在靶標［12-15］。ILC3s是否可能是黃芩湯的一個作用靶標，黃芩湯在治療UC過程中調(diào)節(jié)Th細胞亞群平衡的作用是否與ILC3s有關(guān)，目前尚未有文獻報道。本研究從ILC3s-Th細胞反應(yīng)調(diào)控角度，通過檢測結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織ILC3s、Th細胞數(shù)目以及反映Th細胞功能的相關(guān)促炎性細胞因子如IL-2、IL-17A、IL-23、TNF-α、IFN-γ等，進一步闡明黃芩湯緩解潰瘍性結(jié)腸炎的作用靶標。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性Ba1b/c小鼠96只，6～8周齡，體質(zhì)量約25 g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，合格證號：SYXK（粵）2018-0002。實驗動物飼養(yǎng)于廣東省微生物研究所實驗動物中心，室溫20～24 ℃，相對濕度40%～70%。實驗過程對小鼠的處理符合動物倫理學(xué)標準，已通過實驗動物倫理審查。

1.2 實驗藥物及試劑

黃芩、白芍、大棗、炙甘草飲片（康美藥業(yè)股份有限公司）；美沙拉嗪（ME 上海愛的發(fā)制藥有限公司）；葡聚糖硫酸鈉（DSS上海源葉生物科技有限公司）；蘇木精、伊紅、分化液、返藍液（武漢賽維爾生物科技有限公司）、RPMI 1640培養(yǎng)基（Thermo fisher）；膠原酶Ⅳ（Sigma）、脫氧核糖核酸酶Ⅰ（廣州菲博生物科技有限公司）、分散酶（上海源葉生物科技有限公司）；淋巴細胞分離液（達科為生物技術(shù)有限公司）；佛波酯、離子霉素、布雷非德菌素（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）；抗小鼠CD3、CD4、CD25、Foxp3、IFN-γ （BD Biosciences） ；Hematopoietic Lineage、CD127、MHCⅡ、RORgamma(t)的熒光抗體及Foxp3/轉(zhuǎn)錄因子固定破膜染色液組合和全蛋白提取試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）、多因子測定試劑盒（Thermo fisher）。

1.3 儀器

GS-20 軌道式搖床（杭州米歐儀器有限公司）、L535R離心機（湘儀）、E-6000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器）、A1pha1-4LDp1us凍干機（博勵行）、全自動HE染色機（Thermo fisher）ML-1600平板顯微鏡（武漢賽維爾生物科技有限公司）、FACSCantoⅡ流式細胞儀（BD Biosciences）、Gabaxy170S+CO2細 胞 培 養(yǎng) 箱（Eppendorf）、BSC-1800ⅡA2超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器郵箱公司）、IC1000自動細胞計數(shù)儀（上海睿鈺生物科技有限公司）、IX71 顯微鏡（O1ympus）、Luminex200 液 相 芯 片 分 析 系 統(tǒng)（Mi11ipore）、ThermoMK3全波長酶標儀（Thermo fisher）。

1.4 黃芩湯制備

黃芩、芍藥、大棗、炙甘草按質(zhì)量比9∶6∶6∶49加入10倍蒸餾水浸泡30 min后加熱至100 ℃，持續(xù)30 min，藥液過濾；殘余物用蒸餾水稀釋8倍，相同條件下進行第2次提取。將2次提取液混合并旋蒸至濃度為1 g/mL的濃縮液，濃縮液凍干，所得凍干粉于干燥陰涼處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 動物造模及給藥

將96只Ba1b/c小鼠按體質(zhì)量隨機分為6組，正常組、模型組（DSS）、美沙拉嗪組（ME，400 mg/kg）黃芩湯低劑量組（HL，2.275 g/kg）、黃芩湯中劑量組（HM，4.55 g/kg）、黃芩湯高劑量組（HH，9.1 g/kg），每組16只。除正常組外，其余各組小鼠自由飲用3%DSS溶液，同時黃芩湯組小鼠每日予0.1 mL/mg黃芩湯灌胃，正常組及模型組0.1 mL/mg蒸餾水灌胃。各組正常自由飲食。造模及給藥持續(xù)7 d。

1.6 一般狀況及疾病活動指數(shù)（DAI）評分

造模期間每天觀察小鼠活動狀態(tài)、精神狀態(tài)、毛發(fā)光澤度，記錄飲食及飲水量，并每天記錄小鼠糞便性狀、血便及體質(zhì)量，參照Su等［22］的評分標準進行DAI評分（表1）。

表1 DAI評分標準Tab.1 Criteria for DAI scoring

1.7 結(jié)腸宏觀評分

實驗第8天頸椎脫臼處死小鼠，剖取結(jié)腸，測量結(jié)腸長度，觀察有無水腫、充血、組織黏連，然后縱向剖開結(jié)腸，觀察潰瘍、壞死情況，并進行評分，0分：無水腫、充血、粘連及潰瘍點，1分：局部有水腫、充血或粘連，并且每增加1個潰瘍點增加1分。

1.8 各組小鼠結(jié)腸組織病理觀察

切取一塊病變結(jié)腸組織約0.5 cm，10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋并切片（3 μm），組織切片用蘇木素及伊紅染色，然后依次片放入從低到高濃度的乙醇和二甲苯進行脫水，中性樹脂膠封片并于顯微鏡下觀察結(jié)腸組織變化。

1.9 結(jié)腸上皮及固有層淋巴細胞提取

將各組1～10號小鼠結(jié)腸縱向剖開，PBS清洗腸內(nèi)容物，于六孔板每孔中加入7 mL含5 mmo1/L EDTA2Na及1 mmo1/L DTT的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，并將各組內(nèi)結(jié)腸兩兩合并放入其中剪成約0.2 cm大小，37 ℃恒溫搖床上震蕩30 min進行預(yù)消化。預(yù)消化結(jié)束后用200目無菌濾布過濾預(yù)消化液，并相同條件下重復(fù)預(yù)消化1次。收集2次預(yù)消化液離心（300×g，5 min，4 ℃），保存管底細胞。在剩余結(jié)腸組織中加入4 mL含0.5 mg/mLⅣ型膠原酶、0.02 mg/mL DNA酶Ⅰ、0.4 U/mL分散酶Ⅱ的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，37 ℃恒溫搖床上震蕩1 h進行消化。消化結(jié)束后用200目濾布過濾消化液并離心（300 g，5 min，4 ℃），保存管底細胞。采用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，具體操作見說明書。

1.10 流式細胞術(shù)分析相關(guān)免疫細胞變化

1.10.1 ILC3細胞及MHCⅡ 分離的淋巴細胞轉(zhuǎn)移至流式管，PBS洗滌。細胞表面蛋白的流式抗體孵育：流式管中加入含流式抗體FITC-HematopoieticLineage（Lin）、eF1uor450-CD127、PE-MHC Ⅱ的0.5% BSA/PBS，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌，使用固定破膜染色液組合進行固定并破膜。然后細胞與APC-RORγ(t)，室溫避光孵育30 min。最后，加入100 μL0.5%BSA/PBS重懸細胞，上機檢測，收集標記表面抗體陰性（Lin-）細胞，用Divasoftware（version6.0）對數(shù)據(jù)進行分析。

1.10.2 Th1、Treg細胞 在96孔板每孔加入含50 ng/mL佛波酯、1 μg/mL離子霉素、10 μg/mL 布雷非德菌素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，并加入分離的淋巴細胞，調(diào)整細胞濃度為1×107/mL，將96孔板放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，轉(zhuǎn)移含細胞的培養(yǎng)液于流式管中，PBS洗滌。細胞表面蛋白的流式抗體孵育：流式管中加入含流 式 抗 體FITC-CD3、PerCP-Cy ?5.5-CD4、BV510-CD25的0.5%BSA/PBS，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌，使用固定破膜染色液組合進行固定并破膜。然后細胞與BV421-Foxp3、PE-Cy?7-IFN-γ，室溫避光孵育30 min。最后，加入100 μL 0.5%BSA/PBS 重懸細胞，上機檢測，收集標記表面抗體陽性（CD3+）細胞，用Divasoftware(version6.0)對數(shù)據(jù)進行分析。

圖1 小鼠的體征變化Fig.1 Changes of body weight(A)and DAI score(B)of the mice in the 6 groups(n=16).##P＜0.01 vs control group;**P＜0.01 vs DSS group.DSS: Dextran sulphate sodium; ME: Mesalazine; HL: Huangqin decoction low-dose; HM: Huangqin decoction medium-dose; HH:Huangqin decoction high-dose.

1.11 細胞因子檢測

取各組11～16號小鼠結(jié)腸采用全蛋白提取試劑盒（北京索萊寶）提取總蛋白并檢測蛋白濃度，按照多因子檢測試劑盒（美國Thermo 公司）的說明書操作并用Luminex 200 液相芯片分析系統(tǒng)測定結(jié)腸組織中IL-17A、IL-23、IL-2、IL-13、IL-15、IL-4、TNF-α、IFN-γ含量，對細胞因子含量除以蛋白濃度所得數(shù)據(jù)進行分析。

1.12 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計軟件進行處理，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，檢測結(jié)果比較采用t檢驗或者單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芩湯緩解DSS誘導(dǎo)的炎癥癥狀

造模期間DSS組小鼠出現(xiàn)懶動、精神狀態(tài)差、毛發(fā)缺少光澤、飲食及飲水減少等癥狀，黃芩湯能夠改善上述癥狀。圖1結(jié)果顯示正常組DAI評分為0，與DSS組評分（2.13±0.57）對比有差異（P＜0.05）；黃芩湯可顯著降低小鼠的DAI 評分，其中HL 組（1.27±0.21）、HM 組（1.12±0.43）、HH組（1.26±0.32）與DSS組對比均有顯著差異（P＜0.01）。

2.2 黃芩湯減輕DSS引起的結(jié)腸損傷

DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎后，受試小鼠結(jié)腸長度明顯縮短，與正常組結(jié)腸長度相比，DSS 組結(jié)腸長度縮短（P＜0.01）。給予黃芩湯治療后結(jié)腸長度明顯延長，HL組結(jié)腸長度、HM組結(jié)腸長度、HH組結(jié)腸長度與DSS組對比均有差異（P＜0.01，圖2）。正常組結(jié)腸宏觀評分為0；而DSS組結(jié)腸有明顯的水腫、充血、潰瘍點及粘連情況，DSS組結(jié)腸宏觀評分（6.88±0.89）與正常組相比有差異（P＜0.01）。給予黃芩湯治療后結(jié)腸水腫、充血、潰瘍點及粘連改善，宏觀評分降低，HL、HM、HH組結(jié)腸宏觀評分分別為3.00±0.85、2.73±0.88、2.69±0.85，與DSS對比均有顯著差異（P＜0.01）。DSS 組結(jié)腸結(jié)構(gòu)出現(xiàn)如腸上皮損傷、腸隱窩模糊、粘膜下層及肌層水腫等明顯特征；ME組的結(jié)腸上皮被修復(fù)，粘膜下層和肌層的水腫明顯改善，腸隱窩加深，但較正常組淺；而在HQD組中，除腸上皮、粘膜下層和肌層的損傷有明顯改善，結(jié)腸的隱窩分支較少（圖3）。

2.3 黃芩湯上調(diào)結(jié)腸ILC3s比例及其表達的MHCⅡ比例

圖2 小鼠結(jié)腸長度變化Fig.2 Comparison of colon length of the mice among the 6 groups.A: Whole colon (from anus to cecum). B: Changes of colon length(n=16).##P＜0.01 vs control group;*P＜0.05 vs DSS group.

圖3 小鼠結(jié)腸組織宏觀及病理變化Fig.3 Macroscopic and pathological changes of the colon in the 6 groups(Original magnification:×100). A: Control group. B: DSS group. C: ME group.D:HL group.E:HM group.F:HH group.G:Changes of colonic macroscopic score in the 6 groups. n=16,##P＜0.01 vs control group; **P＜0.01 vs DSS group.

小鼠結(jié)腸組織ILC3s的結(jié)果如圖4，與正常組小鼠結(jié)腸ILC3s比例[（27.83±3.39）%]相比，DSS組小鼠結(jié)腸上皮及固有層ILC3s細胞比例[（4.40±5.09）%]，顯著減少（P＜0.01）。給予黃芩湯治療后，HM、HH組與DSS組相比顯著增加（P＜0.05）。DSS組ILC3s的MHCⅡ表達比例為[（0.92±1.2）%]，與正常組MHCⅡ表達比例[（6.89±3.18%）]相比顯著減少（P＜0.01）。而黃芩湯可增加ILC3s的MHCⅡ表達比例，HL、HM、HH組MHCⅡ表達量分別為[（4.37±2.88）%]、[（4.02±0.46）%]、[（5.60±2.13）%]，與正常組相比HM組有差異（P＜0.05），HL、HH組差異顯著（P＜0.01，圖5）。

2.4 黃芩湯上調(diào)結(jié)腸Treg比例并下調(diào)Th1比例

圖6與圖7流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，DSS組Treg及Th1細胞比例與正常組相比無顯著差異，HL、HM組較DSS組明顯增加（P＜0.05，圖6）。DSS組流式細胞結(jié)果顯示HL、HM組與DSS組相比Th1細胞比例有顯著差異（P＜0.01，圖7）。

2.5 黃芩湯下調(diào)促炎細胞因子

多因子檢測結(jié)果顯示，DSS組小鼠結(jié)腸細胞因子IL-2、IL-4、IL-13、IL-15、IL-17A、IL-23、TNF-α較正常組明顯升高（P＜0.05），IFN-γ較正常組有升高趨勢（P=0.06）。HQD各劑量組可明顯降低小鼠結(jié)腸IL-15、IL-17A、IL-23、TNF-α、IFN-γ含量（P＜0.05），同時HQD可降低IL-2、IL-4、IL-10、IL-13的生成（P＜0.05，圖8）。

圖4 流式細胞術(shù)分析各組結(jié)腸ILC3s比例的變化Fig.4 Flow cytometric analysis of the proportion of colonic ILC3s in the 6 groups.A:Representative plots.B:Statistical analysis(n=3-5).##P＜0.01 vs control group;*P＜0.05 vs DSS group.

圖5 流式細胞術(shù)分析各組小結(jié)腸MHC II比例的變化Fig.5 Flow cytometric analysis of the proportion of colonic MHC II.A:Representative plots.B:Statistical analysis(n=3-5).##P＜0.01 vs control group;*P＜0.05 and**P＜0.01 vs DSS group.

圖6 流式細胞術(shù)分析各組小鼠結(jié)腸Th1的比例變化Fig.6 Flow cytometric analysis of the proportion of colonic Th1.A:Representative plots;B:Statistical analysis.n=3-5,**P＜0.01 versus DSS group.

圖7 流式細胞術(shù)分析各組小鼠結(jié)腸Treg的比例變化Fig.7 Flow cytometric analysis of the proportion of colonic Treg.A:Representative plots;B:Statistical analysis.n=3-5,*P＜0.05 vs DSS group.

3 討論

黃芩湯是《傷寒論》的治痢經(jīng)典名方［17］，臨床上用于治療潰瘍性結(jié)腸炎［18］。在UC動物模型中，黃芩湯可通過調(diào)節(jié)Th細胞亞群的平衡顯著緩解UC炎癥癥狀［19-20］。本研究中，經(jīng)黃芩湯治療后，UC小鼠體質(zhì)量增加，結(jié)腸長度增長，DAI評分降低，結(jié)腸炎癥改善。此外，黃芩湯可通過上調(diào)ILC3s細胞的比例及MHCⅡ分子的表達，進而上調(diào)Treg細胞的比例和下調(diào)Th1細胞的比例，并降低多種促炎細胞因子的分泌，與本課題組的前期研究結(jié)果一致［6-7,19-20］，進一步說明黃芩湯能通過調(diào)節(jié)機體免疫功能達到治療UC的功效。

圖8 各組小鼠結(jié)腸細胞因子表達比較Fig.8 Expression of pro-inflammatory cytokines in the colon in the 6 groups.A:IL-2.B:IL-4.C:IL-13.D:IL-15.E:IL-17A.F:IL-23.G:IFN-γ.H:TNF-α.n=4-6,#P＜0.05 and##P＜0.01 vs control group.*P＜0.05 and**P＜0.01 vs DSS group.

本研究首次探討了黃芩湯對DSS誘導(dǎo)的UC小鼠結(jié)腸組織ILC3s及其表達的MHCⅡ分子的調(diào)節(jié)作用。ILC3s能夠不依賴細胞因子、抗原及微生物源性刺激并持續(xù)地表達MHCⅡ分子，通過MHCⅡ分子加工、提呈抗原，直接誘導(dǎo)效應(yīng)性T細胞（Th1,Th2,Th17）凋亡，因此ILC3s的MHCⅡ依賴性抗原提呈過程能夠調(diào)節(jié)Th細胞亞群的平衡［9］。動物實驗表明，當(dāng)敲除小鼠MHCⅡ基因后，小鼠體質(zhì)量降低，出現(xiàn)明顯結(jié)腸炎癥，結(jié)腸長度縮短，脾質(zhì)量增加，同時結(jié)腸組織中效應(yīng)性T細胞比例顯著升高［13-14］。有研究表明，在IBD患者結(jié)腸組織中，ILC3s細胞及其表達的MHCⅡ降低［14,21］。從文獻報道來看，當(dāng)ILC3s的MHCⅡ依賴性抗原提呈功能受損時，效應(yīng)性T細胞的過度活化不能夠被有效抑制，進而發(fā)生結(jié)腸炎癥［13-14,21］。本實驗的研究結(jié)果與上述文獻研究的結(jié)論相一致，初步驗證了黃芩湯通過上調(diào)ILC3s，增加MHCⅡ的表達進而發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用及抗炎藥效，因此ILC3s及MHCⅡ可能成為黃芩湯調(diào)節(jié)Th細胞的上游靶標。

在UC患者的腸黏膜及UC小鼠的結(jié)腸中，存在效應(yīng)性T細胞與調(diào)節(jié)性T細胞的失衡，效應(yīng)T細胞過度活化并產(chǎn)生大量促炎性細胞因子［22-24］，如IL-2、IL-13、IL-15、IL-17A及IL-23，這些細胞因子可破壞腸上皮屏障、誘導(dǎo)效應(yīng)性T細胞分化，也會促進其他促炎性細胞因子的分泌，因此機體中免疫細胞的失衡在UC的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［25-28］。抑制效應(yīng)性T細胞相關(guān)促炎性細胞因子的表達，能夠有效緩解小鼠UC癥狀［28］，前期研究表明，黃芩湯可調(diào)節(jié)UC小鼠結(jié)腸組織效應(yīng)性T細胞及Treg細胞的平衡，降低促炎性細胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-4含量［30］。本實驗還檢測了Th細胞分泌的其他促炎性細胞因子如IL-2、IL-13、IL-15、IL-17A、IL-23，實驗結(jié)果表明，黃芩湯可降低上述細胞因子的表達，進一步說明黃芩湯可抑制效應(yīng)性T細胞的分化及功能，具有免疫調(diào)節(jié)及抗炎的藥效。

綜上所述，本研究利用DSS誘導(dǎo)的UC小鼠模型，探討了黃芩湯可能通過調(diào)節(jié)ILC3s及MHCⅡ等Th細胞反應(yīng)調(diào)節(jié)的可能上游靶標的表達，調(diào)節(jié)UC發(fā)展過程中病變部位微環(huán)境免疫穩(wěn)態(tài)，發(fā)揮黃芩湯治療UC的藥效。本實驗從ILC3s-Th細胞角度進一步探討了黃芩湯緩解UC的可能作用靶點，闡釋了中藥復(fù)方治療UC的可能作用機制，為黃芩湯的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。