王永霞，文楚然，葉建森，黃河清，張玉娟，袁惠玲，姚廣裕，于 夢(mèng)

1南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞市人民醫(yī)院乳腺科，廣東東莞523000；南方醫(yī)科大學(xué)2南方醫(yī)院乳腺科，3藥學(xué)院，廣東廣州510515

乳腺癌是中國(guó)乃至全球發(fā)病率最高的女性惡性腫瘤，同時(shí)也在嚴(yán)重威脅乳腺癌患者的生存［1］。其中人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）的乳腺癌約占乳腺癌診出率的20%～30%［2］。曲妥珠單抗（Tmab）是靶向HER的人源化單克隆抗體，臨床研究顯示Tmab與化療聯(lián)合用于HER2過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療以及早期乳腺癌的新輔助和輔助治療［3］。然而，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的異?；罨?、HER家族成員間的相互作用、藥物壓力下代償性生存信號(hào)的激活、腫瘤干細(xì)胞表型形成等均可能導(dǎo)致Tmab發(fā)生耐藥［5］。由于Tmab的使用伴隨嚴(yán)重的心臟毒性問(wèn)題［5］，以及高耐藥風(fēng)險(xiǎn)，因此，亟需設(shè)計(jì)一種精準(zhǔn)安全的藥物遞送體系，使Tmab在HER2+乳腺癌患者治療中更好地發(fā)揮療效。

近來(lái)，已有多種策略克服Tmab的耐藥性問(wèn)題，如應(yīng)用PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的小分子抑制劑或耐藥相關(guān)促生存信號(hào)通路的特異性抑制劑，可一定程度上逆轉(zhuǎn)Tmab耐藥，延長(zhǎng)患者的疾病無(wú)進(jìn)展生存期［6］。此外，活性氧（ROS）已被證實(shí)能有效降低低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1α），從而調(diào)節(jié)信號(hào)通路PI3K/AKT/mTOR，實(shí)現(xiàn)HER2+耐藥性逆轉(zhuǎn)［7］。然而，在這類逆轉(zhuǎn)Tmab耐藥策略中，針對(duì)Tmab心臟毒性問(wèn)題，當(dāng)前研究中未提出有效的解決方案。

采用近紅外光響應(yīng)釋藥納米載體進(jìn)行藥物的體內(nèi)遞送［8］，可實(shí)現(xiàn)在癌灶部位的精準(zhǔn)釋放，有效降低治療藥物對(duì)心臟的毒副作用［9］。因此，本研究圍繞逆轉(zhuǎn)Tmab耐藥并降低心臟毒副作用這一目標(biāo)，設(shè)計(jì)近紅外光響應(yīng)脂質(zhì)體凝膠（Ce6-PC-Tmab@A-Ge1），負(fù)載光敏劑Ce6和腫瘤靶向藥Tmab。該體系在近紅外光刺激下產(chǎn)生高濃度ROS，發(fā)揮光動(dòng)力治療（PDT）作用，并誘導(dǎo)Tmab釋藥以降低毒副作用，同時(shí)通過(guò)ROS逆轉(zhuǎn)Tmab耐藥機(jī)制，促進(jìn)Tmab靶向治療效果。這一設(shè)計(jì)為臨床解決Tmab的耐藥性及心臟毒性問(wèn)題，提供了新思路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

高純蛋黃卵磷脂（PC-98T,Avanti Po1ar Lipids），磷脂酰乙醇胺（PE,Sigma-A1drich），膽固醇（Cho1,Sigma-A1drich），聚乙二醇2000修飾的二硬脂?；字Ｒ掖及罚―SPE-PEG2000,Avanti Po1ar Lipids），醛化黃原膠（ALD-XA），磷酸鹽緩沖液（PBS），二甲基亞砜（DMSO, 北京索萊寶科技有限公司），曲妥珠單抗（Trastuzumab,Tmab，Herceptin,Genetech Inc），人乳腺癌細(xì)胞（SK-BR-3,BRIA），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（北京優(yōu)萊博技術(shù)有限公司），水浴超聲振蕩器（中國(guó)深圳市潔泰超聲洗凈設(shè)備有限公司），細(xì)胞破碎儀（上海比朗儀器制造有限公司），冷凍干燥機(jī)（中國(guó)寧波新芝設(shè)備有限公司），臺(tái)式離心機(jī)（Sigma），紫外分光光度計(jì)（PerkinE1mer），馬爾文激光測(cè)徑儀（Ma1vern），掃描顯微鏡（JEOL電子），觸屏流變儀（Brookfie1d），酶標(biāo)儀（BioTek）。

1.2 Ce6-PC-Tmab@A-Ge1的制備

PC、PE、Cho1、DSPE-PEG2000按照50：25：25：10的摩爾比（總體系22.1 mg）溶于15 mL氯仿中，50 ℃下全負(fù)壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到均勻的透明薄膜，加入Tmab樣品2 mL（21 mg/mL），冰浴環(huán)境中超聲約15 min制得質(zhì)地均勻脂質(zhì)納米載體。置于0.9%（w/w）氯化鈉溶液中（體積比1∶20）透析48 h后除去離子雜質(zhì)及游離藥物。再將所得納米溶劑置于液氮中72 h，后再于-20 ℃下負(fù)壓冷凍干燥48 h 即得粉末狀的Ce6-PC-Tmab。于黃原膠（XA）（0.5% w/v）水溶液中加入NaIO4（摩爾比：XA∶NaIO4=1∶4），加熱至45 ℃溶解，避光反應(yīng)4 h；加入1%乙二醇中止反應(yīng)，繼續(xù)反應(yīng)1 h，-20 ℃負(fù)壓凍干后制備得醛化黃原膠（ALD-XA）。稱量適量樣品Ce6-PC-Tmab與60 mg醛化黃原膠（ALD-XA）并加入蒸餾水混勻，室溫下采用磁力攪拌交聯(lián)法，速度為400 r/min，攪拌12 h，獲得質(zhì)量濃度為30%的樣品Ce6-PC-Tmab@A-Ge1。

1.3 Ce6-PC-Tmab及Ce6-PC-Tmab@A-Ge1的表征檢測(cè)

Ma1vern激光測(cè)徑儀檢測(cè)其粒徑大小、分布及表面電荷等特性。掃描電鏡（SEM）觀察磷鎢酸負(fù)染法處理后的Ce6-PC-Tmab@A-Ge1 形態(tài)。流變儀測(cè)定Ce6-PC-Tmab@A-Ge1的流變力學(xué)性質(zhì)。

1.4 藥物包封率及載藥量檢測(cè)

配置Tmab標(biāo)準(zhǔn)溶液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算透析凍干后脂質(zhì)體中Tmab 的包封率，包封率（ER,%）=（Wa-Wb）/Wa×100%，Wa為加入Ce6-PC-Tmab中的總藥物量，Wb為通過(guò)透析去除的游離藥物量。載藥量（DL,%）=（Wa-Wb）/Wc×100%，Wc為合成脂質(zhì)載體總質(zhì)量。

1.5 Ce6-PC-Tmab@A-Ge1穩(wěn)定性檢測(cè)

在不同pH值（pH 7.4/6.25/5.5）緩沖液環(huán)境下，將Ce6-PC-Tmab@A-Ge1放置96 h，觀察膠體的穩(wěn)定性、檢測(cè)藥物在介質(zhì)中的釋放率；Ce6-PC@A-Ge1包載不同水溶性成分，如靶向藥Tmab（Tmab）與熒光染料羅丹明B（RhoB），放置96 h觀察不同包載物對(duì)于體系膠體穩(wěn)定性的影響、稱量剩余膠體的質(zhì)量；改變Ce6-PCTmab@A-Ge1載藥體系的濃度，放置96 h觀察膠體的穩(wěn)定性，稱量剩余膠體的質(zhì)量。

1.6 脂質(zhì)體凝膠的近紅外光刺激響應(yīng)藥物釋放

將脂質(zhì)體凝膠材料分為光響應(yīng)載體接受光照刺激組（Ce6-PC-Tmab@A-Ge1+1aser）、光響應(yīng)載體不接受光照刺激組（Ce6-PC-Tmab@A-Ge1）、非光響應(yīng)載體接受光照刺激組（PC-Tmab@A-Ge1+1aser）共3組，每組設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，PBS為對(duì)照組。接受近紅外光刺激后，在不同時(shí)間點(diǎn)取樣檢測(cè)藥物釋放量，非光照組在相同時(shí)間點(diǎn)取樣檢測(cè)。

用紫外分光光度計(jì)在280 nm波長(zhǎng)下測(cè)定釋放介質(zhì)吸光度并計(jì)算Tmab累積釋放量（Ct），用同樣的方法計(jì)算其他各組中藥物的累積釋放量（Ct），取相同質(zhì)量原始凍干樣品用二甲基亞砜（DMSO）裂解，測(cè)裂解后的藥物濃度（Cf）作為載體中藥物釋放前的初始濃度。藥物釋放率=Ct/Cf×100%。

1.7 納米脂質(zhì)體溶液的體外SK-BR-3細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

將耐藥性HER2+人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3 按1×105/孔的濃度接種于96孔板生長(zhǎng)貼壁后，設(shè)置光響應(yīng)載體接受光照刺激組（Ce6-PC-Tmab+1aser，光照功率0.5 W，光照2 min）、光響應(yīng)載體不接受光照刺激組（Ce6-PC-Tmab）、非光響應(yīng)載體接受光照刺激組（PCTmab+1aser），每組5個(gè)復(fù)孔(加入的Ce6-PC-Tmab濃度為250 μg/mL)，孵育4 h后進(jìn)行近紅外光刺激，細(xì)胞再繼續(xù)培養(yǎng)24 h，向每孔加入10 μL的MTT試劑，30 min后在490 nm的吸收波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀定量檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組SK-BR-3增殖情況。

1.8 Ce6-PC-Tmab@A-Ge1聯(lián)合近紅外光治療小鼠乳腺腫瘤

選擇體質(zhì)量為18～22 g的雌性BALB/c小鼠，采用皮下接種法建立乳腺癌小鼠皮下腫瘤模型。造模成功后，將小鼠模型隨機(jī)分為3組，每組5只，一組按12 mg/kg劑量于原位瘤旁注射PC-Tmab@A-Ge1，在注射后每3 d進(jìn)行近紅外光關(guān)照治療（光照強(qiáng)度為0.5 w，光照時(shí)長(zhǎng)為2 min/次），另一組則注射同樣量的PC-Tmab@A-Ge1，不進(jìn)行光照處理。注射PBS溶液小鼠作為對(duì)照組。每組均在治療第0，7，14天置于小動(dòng)物活體成像儀下觀察腫瘤生物發(fā)光，并每隔2 d記錄腫瘤體積大小及動(dòng)物體重。第14天治療結(jié)束后，視為一個(gè)完整的治療周期，根據(jù)動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定，結(jié)束動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用單因素方差分析，P＜0.01判定為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ce6-PC-Tmab及Ce6-PC-Tmab@A-Ge1的表征檢測(cè)

本研究制備的Ce6-PC-Tmab為墨綠色粉末，溶于PBS后為均勻淺綠色懸液，Ce6-PC-Tmab@A-Ge1為淺綠色凝膠狀，對(duì)照組為乳白色凝膠（圖1A），使用注射劑抽吸具有良好剪切效應(yīng)，凝膠注入水中具有顯著的附著性及穩(wěn)定性（圖1A），SEM觀察到的Ce6-PC-Tmab@AGe1為帶有孔隙和附著有微小顆粒的片層海綿結(jié)構(gòu)（圖1B）。Ma1vern激光測(cè)徑儀測(cè)得的Ce6-PC-Tmab平均粒徑Size為（239.7±9.7）nm，電位Zeta為（-2.03±0.09）mV（表1）。紫外分光光度計(jì)測(cè)定可見(jiàn)樣品Ce6-PC-Tmab在280 nm（Tmab）及416 nm（Ce6）處有明顯特征峰（圖1C）。流變分析儀測(cè)定Ce6-PC-Tmab@A-Ge1觀察到良好的剪切效應(yīng)及粘附性（圖1D）。

2.2 藥物包封率及載藥量檢測(cè)

根據(jù)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，Tmab的最大吸收波長(zhǎng)在280 nm。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程：y=0.0015x-0.0162，R2=0.9992；平均包封率（ER%）為（40.22±0.73）%，載藥量（DL%）為（36.78±0.06）%（表1）。

2.3 Ce6-PC-Tmab@A-Ge1穩(wěn)定性檢測(cè)

分別在不同的pH外液環(huán)境（pH=7.4/6.25/5.5）下放置96 h，觀察發(fā)現(xiàn)模擬接近腫瘤微環(huán)境的pH 環(huán)境下（pH=6.25），Ce6-PC-Tmab@A-Ge1穩(wěn)定性更好，釋放外液更加澄清（圖2A），在緩慢釋放24 h 內(nèi)，外液pH 為6.25的情況下膠體藥物釋放量控制效果最好為（32.54±0.58）%（圖2B），能達(dá)到緩釋的實(shí)際效果，膠體剩余質(zhì)量也同樣證明腫瘤微環(huán)境pH中膠體損失最小，為（73.64±1.83）%（圖2C）。

凝膠材料分別包載不同的水溶性成分，Tmab與羅丹明B（RhoB），得到合成物Ce6-PC-Tmab@A-Ge1 and Ce6-PC-RhoB@A-Ge1，在相同PBS 外液環(huán)境中放置96 h。由于Tmab和Ce6在π-π鍵的作用能夠交聯(lián)得更加緊密，在PBS外液環(huán)境中放置96 h后，能緩慢釋放藥物且能維持膠體完整結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)包載Tmab的組別膠體剩余質(zhì)量大于包載RhoB 組別，分別為（87.34±2.57）%、（30.13±1.80）%（圖3A），包載Tmab組膠體外觀更加牢固，附壁性更優(yōu)，穩(wěn)定性更加顯著（圖3B，P＜0.01）。

包載不同濃度水溶性成分時(shí)（w=10%/20%/30%），在相同PBS外液中放置96 h后，膠體外觀可見(jiàn)w=30%時(shí)膠體最為穩(wěn)固，膠體剩余質(zhì)量也是最大的為（92.21±2.05）%（圖4A）?？梢?jiàn)當(dāng)包載治療材料濃度為30%時(shí)膠體穩(wěn)定性最好（圖4B）。

2.4 近紅外光控釋藥物試驗(yàn)

體外近紅外光（670 nm）光控釋藥時(shí)發(fā)現(xiàn)，Ce6-PCTmab@A-Ge1中Tmab的釋放量有隨光照強(qiáng)度的增加和光照時(shí)間的延長(zhǎng)而增多的趨勢(shì)，控制光照時(shí)間為2 min，隨著光照功率增大（0.1 w/0.2 w/0.5 w），Tmab釋放率顯著增加（圖5A），而且當(dāng)光照作用時(shí)間為2 min，光照功率為0.5 w 時(shí)，放置120 h 后Tmab 的釋放率可達(dá)到（84.54±0.54）%?？刂乒庹展β蕿?.5 w，隨著光照時(shí)間增加（60 s/120 s/180 s），釋放率也穩(wěn)步增加，在光照180 s時(shí)，Tmab的釋放率達(dá)到（10.36±0.49）%（圖5B）。

2.5 體外抑制SK-BR-3增殖實(shí)驗(yàn)

圖1 Ce6-PC-Tmab及Ce6-PC-Tmab@A-Ge1的表征Fig.1 Characterization of Ce6-PC-Tmab and Ce6-PC-Tmab@A-Gel.A:Shear,adsorption and stability of Ce6-PC-Tmab@A-Gel in water.B:SEM image of Ce6-PC-Tmab@A-Gel(Phosphotungstic acid staining,original magnification:×500 and 1000). C: Ultraviolet spectrogram of Ce6-PC-Tmab, PC-Tmab, PC-LP,Ce6(416 nm)and Tmab(280 nm).D:Change of storage modulus(G)and loss modulus(G")with time of Ce6-PC-Tmab@A-Gel.

表1 Ce6-PC-Tmab脂質(zhì)體的一般性質(zhì)表征Tab.1 Characterization of Ce6-PC-Tmab

通過(guò)觀察對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組抑制SK-BR-3增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，光響應(yīng)載體接受光照刺激組（a：Ce6-PC-Tmab+1aser，光照1，2，3，4 min）、光響應(yīng)載體不接受光照刺激組（b：Ce6-PC-Tmab）、非光響應(yīng)載體接受光照刺激組（c：PC-Tmab+1aser）以及PBS組（d），各組間SK-BR-3存活率分別為（31.37±1.73）%、（66.19±1.12）%、（79.51±1.27）%、（98.31±0.70）%。Ce6-PC-Tmab@A-Ge1聯(lián)合近紅外光治療組抑制SK-BR-3細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖6A）。經(jīng)近紅外光刺激后，固定光照功率為0.5 w，隨著光照時(shí)間的增加（0，1，2，3，4 min），各組產(chǎn)生ROS 增量分別為（5.03±0.07）%、（9.41±0.30）%、（22.09±0.91）%、（22.60±0.17）%、（22.36±0.11）%，光照2 min后與初始組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖6B）。

2.6 體內(nèi)抑制SK-BR-3增殖實(shí)驗(yàn)

在小鼠乳腺癌皮下移植瘤模型中，活體成像下通過(guò)生物發(fā)光（圖7A）直接判斷腫瘤大?。▓D7B），記錄各組小鼠腫瘤體積大小及體質(zhì)量變化（圖7C），在第14天治療完成后，結(jié)束實(shí)驗(yàn)，測(cè)量腫瘤質(zhì)量（圖7D）?？梢?jiàn)聯(lián)合治療組（Ce6-PC-Tmab@A-Ge1+1aser）在治療第7天、第14天即有顯著抑瘤效果，腫瘤得到有效抑制直至完全消融，非光照組（Ce6-PC-Tmab@A-Ge1）和對(duì)照組（PBS）腫瘤體積呈持續(xù)增大的趨勢(shì)。

圖2 Ce6-PC-Tmab@A-Ge1在不同的pH外液環(huán)境（pH=7.4/6.25/5.5）下的穩(wěn)定性Fig.2 Stability of Ce6-PC-Tmab@A-Gel under different pH conditions (pH=7.4/6.25/5.5). A:Appearance stability.B:Release rate of Tmab.C:Residual mass percentage of Ce6-PC-Tmab@AGel.**P＜0.01.

圖3 Ce6-PC@A-Ge1分別包載不同的水溶性成分Tmab與RhoB的穩(wěn)定性Fig.3 Stability of Ce6-PC@A-Gel loaded with Tmab and RhoB.A:Residual mass percentage of Ce6-PC-Tmab@A-Gel and Ce6-PC-RhoB@A-Gel,**P＜0.01.B:Appearance changes after 96 h storage.

圖4 Ce6-PC-Tmab@A-Ge1包載不同濃度水溶性成分時(shí)（w=10%/20%/30%）的穩(wěn)定性Fig.4 Stability of Ce6-PC-Tmab@A-Gel containing different concentrations(10%,20%,or 30%)of water-soluble components.A:Residual mass percentage,**P＜0.01;B:Appearance changes after 96 h storage.

圖5 體外近紅外光（670 nm）控釋藥物試驗(yàn)性Fig.5 Release test controlled by near-infrared light (670 nm) in vitro. A: The release rate of Tmab increased significantly with the increase of light power(0.1,0.2,and 0.5 W)when the illumination time was 2 min.B:With the increase of illumination time(60 s/120 s/180 s)the release rate increased steadily.

圖6 體外抑制SK-BR-3增殖實(shí)驗(yàn)Fig.6 In vitro inhibition of SK-BR-3 cells.A,B:Survival rate of SK-BR-3 and ROS increment among groups(a:Ce6-PCTmab+laser;b:Ce6-PC-Tmab;c:PC-Tmab+laser;d:PBS),**P＜0.01.

3 討論

HER2+乳腺癌的治療在乳腺癌治療中占有重要地位，Tmab作為新輔助化療藥物的使用帶來(lái)曙光的同時(shí)也帶來(lái)很多值得思考的問(wèn)題，藥物的耐藥性導(dǎo)致治療效果不佳［10］以及藥物本身的心臟毒副作用［11］，使得Tmab的臨床應(yīng)用面臨巨大挑戰(zhàn)。納米材料包裹藥物能有效解決藥物本身帶來(lái)的全身毒性問(wèn)題，有效降低心臟毒副作用［12］；同時(shí)具備刺激響應(yīng)釋藥功能的納米載體，能精準(zhǔn)調(diào)控藥物釋放，靶向治療病灶，提高藥物有效性［13］。

本課題中設(shè)計(jì)的藥物載體為脂質(zhì)體凝膠，納米級(jí)脂質(zhì)體粒徑為（239.7±9.7）nm，脂質(zhì)體膜材中摻雜不飽和磷脂成分，使載體具有ROS響應(yīng)釋放性能。SEM結(jié)果顯示本課題中制備的脂質(zhì)體凝膠材料為疏松多孔結(jié)構(gòu)，這有利于在植入部位進(jìn)行內(nèi)外物質(zhì)交換，使從納米載體中釋放的治療成分可通過(guò)凝膠基質(zhì)中的孔洞快速擴(kuò)散并發(fā)揮藥效。水溶性大分子藥物的包載和體內(nèi)遞送一直都是載體設(shè)計(jì)中的難題，水溶性大分子藥物，尤其是大分子蛋白類物質(zhì)的包載率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于脂溶性小分子藥物。Xie等［14］采用納米載體包裹紫杉醇和Tmab進(jìn)行聯(lián)合給藥，遺憾的是，單抗負(fù)載量低于25%（w/w）。在本課題設(shè)計(jì)中，充分考慮了藥物本身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，利用多肽藥物可以通過(guò)結(jié)構(gòu)中的π-π共軛效應(yīng)實(shí)現(xiàn)較高載藥量的特點(diǎn)［15］，通過(guò)光敏劑Ce6結(jié)構(gòu)中羧基（-COOH）與Tmab形成氫鍵作用來(lái)實(shí)現(xiàn)藥物高效共載，雙藥共載體系中Tmab載藥量提高到（36.78±0.06）%（w/w）。同時(shí)考慮到抗體結(jié)構(gòu)易變性，為確?？贵w活性，在制備階段保證Ce6-PC-Tmab的制備在-4 ℃的冰浴環(huán)境中進(jìn)行，之后取用透析手法去除可能因物理操作產(chǎn)生的抗體游離碎片，保證包載抗體的結(jié)構(gòu)完整性及活性。利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)制備完成的Ce6-PC-Tmab的結(jié)構(gòu)峰分布，Tmab特征峰明顯（280 nm），并與同濃度游離Tmab對(duì)比，證明包載抗體結(jié)構(gòu)完整（圖1C）。在體內(nèi)外治療實(shí)驗(yàn)中，分組a（Ce6-PC-Tmab@A-Ge1+1aser）表現(xiàn)出比分組c（Ce6-PC@A-Ge1+1aser）顯著增強(qiáng)的治療效果（圖6A），證明該抗體藥物被包裹到載體后，仍然保留完整結(jié)構(gòu)和高度活性。

圖7 Ce6-PC-Tmab@A-Ge1聯(lián)合近紅外光治療荷瘤小鼠模型Fig.7 Treatment of tumor-bearing mice model with near-infrared light by Ce6-PC-Tmab@A-Gel.A:Tumor morphology and volume shown by in vivo imaging. B, C: Changes of tumor volume and body-weight of mice during treatment. D: Tumor weight at the end of treatment,**P＜0.01.

將可植入凝膠用于腫瘤治療，有助于在植入部位更好地發(fā)揮療效，極大地降低對(duì)其他臟器的毒副作用，因此受到研究人員廣泛關(guān)注。Luo等［16］采用含有一個(gè)聚乙二醇嵌段和兩個(gè)多肽嵌段的功能性三嵌段共聚物制備植入凝膠用于藥物遞送。這類凝膠體系對(duì)納米藥物的結(jié)合方式多為物理包埋，在包載及釋藥過(guò)程中存在諸多的不穩(wěn)定因素?？紤]到納米載體與凝膠材料結(jié)合的穩(wěn)定性，本研究采用醛化修飾黃原膠作為凝膠基質(zhì)，與脂質(zhì)體中富含氨基的磷脂成分之間形成具有剪切響應(yīng)性的席夫堿（－RC=N－）化學(xué)連接鍵［17］。得到的可注射脂質(zhì)體凝膠Ce6-PC-Tmab@A-Ge1經(jīng)流變力學(xué)測(cè)試，具有優(yōu)良的剪切響應(yīng)性，在模擬腫瘤微環(huán)境的PBS緩沖液中，保持良好的成膠性和穩(wěn)定性。這一性質(zhì)不僅有利于該凝膠材料在病灶部位的局部注射成型，也保證了在體內(nèi)水環(huán)境中的載體穩(wěn)定性，有效避免藥物泄露和毒副作用。

可注射脂質(zhì)體凝膠Ce6-PC-Tmab@A-Ge1中的脂質(zhì)體的膜材采用不飽和磷脂摻雜，并同時(shí)負(fù)載光敏劑Ce6和靶點(diǎn)藥物Tmab。由于光敏劑的存在，該脂質(zhì)體在接受近紅外光照射下，會(huì)產(chǎn)生大量細(xì)胞毒性ROS成分，ROS與膜材中不飽和磷脂發(fā)生氧化反應(yīng)［18］，破壞脂質(zhì)體完整結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步導(dǎo)致Tmab釋放。隨著光照強(qiáng)度和光照時(shí)間的增加，Tmab釋放速率明顯加快。這一發(fā)現(xiàn)提示我們，本研究中近紅外光響應(yīng)釋藥脂質(zhì)體在一次性局部注射后，通過(guò)調(diào)整誘導(dǎo)條件相關(guān)參數(shù)，對(duì)藥物釋放速率可控調(diào)節(jié)，對(duì)于臨床靈活調(diào)整給藥方案有十分重要的意義

從載體釋放出來(lái)的Tmab在發(fā)揮腫瘤治療作用時(shí)，常常由于異?；罨ER家族成員間的相互作用等原因?qū)е履退?，造成治療效率低下。已有研究表明，PI3KAKT 通路異?；罨且餞mab 耐藥的重要原因之一［19］。而ROS被報(bào)道可有效降低低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1α），從而調(diào)節(jié)信號(hào)通路PI3K/AKT/mTOR［20］，從而逆轉(zhuǎn)HER2+乳腺癌患者的Tmab耐藥［21］。本研究中將可產(chǎn)生大量ROS的PDT療法與Tmab聯(lián)用，通過(guò)逆轉(zhuǎn)Tmab耐藥，增強(qiáng)靶向藥物療效，實(shí)現(xiàn)協(xié)同治療作用。在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平上，協(xié)同治療組Ce6-PC-Tmab+1aser和Ce6-PC-Tmab@A-Ge1+1aser與單一Tmab靶向治療組相比，表現(xiàn)出更優(yōu)越的抑制腫瘤細(xì)胞增殖和抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力，從另一方面證明了該體系對(duì)Tmab耐藥性逆轉(zhuǎn)的潛力。

本研究設(shè)計(jì)的凝膠給藥體系在臨床中有顯著突出的應(yīng)用價(jià)值。在實(shí)際的臨床環(huán)境中，癌癥患者的治療方案通常需要根據(jù)實(shí)際病情對(duì)藥物劑量及方案進(jìn)行靈活調(diào)整［22］，本研究設(shè)計(jì)的近紅外光刺激響應(yīng)釋放凝膠體系，可以根據(jù)患者的實(shí)際需求，調(diào)整相關(guān)的參數(shù)如光照強(qiáng)度、時(shí)間、光照次數(shù)、光敏劑載量、藥物貯存量等，來(lái)實(shí)現(xiàn)藥物的不同釋放速率和釋放治療量；同時(shí)也可根據(jù)患者治療方案的調(diào)整，更換或增加包載藥物內(nèi)容，實(shí)現(xiàn)“一平臺(tái)多藥多重治療”。另外，患者在以往的治療過(guò)程中，常常涉及中心靜脈導(dǎo)管等的建立和維護(hù)，長(zhǎng)期使用會(huì)帶來(lái)導(dǎo)管通道的治療效果下降、棄用等情況，長(zhǎng)期滯管還會(huì)帶來(lái)感染的風(fēng)險(xiǎn)，且一定量患者存在天生血管畸形而不適宜建立［23］。我們研究設(shè)計(jì)的凝膠體系有著低風(fēng)險(xiǎn)、低損傷、高舒適度的優(yōu)點(diǎn)，腫瘤旁注射貯存藥物凝膠，體外光照刺激響應(yīng)，實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)便捷釋藥治療；并且由于凝膠的可貯藥性和緩釋型，我們能實(shí)現(xiàn)“一次給藥、多次光照治療”的效果，有效降低患者新一輪治療的感染風(fēng)險(xiǎn)、提高治療舒適度。結(jié)合我們前面已經(jīng)提及的逆轉(zhuǎn)耐藥機(jī)制、降低原藥毒性的特質(zhì)，我們?cè)O(shè)計(jì)的凝膠給藥體系在臨床應(yīng)用中擁有不可小覷的應(yīng)用價(jià)值。

該凝膠給藥體系在研究腫瘤生物學(xué)行為方面亦有顯著的價(jià)值。在針對(duì)不同分型的乳腺癌診治中，我們可以借用此凝膠給藥平臺(tái)，包載不同的治療藥物，如Basa1-1ike型（表現(xiàn)為ER和/或PR-，HER2-）［24］，考慮包載免疫靶向藥物PD-L1等治療；HER2過(guò)表達(dá)型（ER和/或PR-，HER2+）［24］，考慮包載曲妥珠單抗或帕妥珠單抗治療。同時(shí)針對(duì)腫瘤常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散等生物學(xué)行為，我們可以利用該凝膠給藥平臺(tái)，建立多種體內(nèi)給藥研究模型：如針對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移治療模型，進(jìn)行原位瘤旁凝膠注射治療，觀察對(duì)肺轉(zhuǎn)移或肝轉(zhuǎn)移的療效；再如針對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)再治療模型，可再次光照原貯存凝膠，實(shí)現(xiàn)藥物釋放，觀察對(duì)于復(fù)發(fā)瘤的療效?？梢?jiàn)，該凝膠給藥體系在研究腫瘤的異型性、擴(kuò)散轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為方面有著可觀的臨床前景。

綜上所述，本研究所構(gòu)建的多功能納米載體Ce6-PC-Tmab@A-Ge1，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)近紅外光控響應(yīng)釋藥，還能集光動(dòng)力治療與靶向治療為一體，緩釋藥物同時(shí)實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效治療，有效逆轉(zhuǎn)Tmab的耐藥性、降低心臟毒副作用。本研究為進(jìn)一步構(gòu)建集控釋、診斷、靶向治療于一體的多功能載藥平臺(tái)奠定研究基礎(chǔ)，也為后續(xù)診療不同分型乳腺癌、構(gòu)建個(gè)性化治療方案提供新的思路。