李 潔，毛 宇，蔣可欣，馬 磊，王 蕊

（華東理工大學(xué)藥學(xué)院，上海市新藥設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200237）

目前，血管性癡呆已成為繼阿爾茨海默病之后第二大常見(jiàn)的癡呆類型[1-2]，并且有40%的病例被診斷為阿爾茨海默病混合型，表明在大多數(shù)患者中血管因素發(fā)揮了重要作用[3]。慢性腦灌注不足（CCH）是血管性癡呆發(fā)病機(jī)理中最常見(jiàn)的原因之一。CCH引起的腦能量代謝紊亂和氧化應(yīng)激被認(rèn)為是發(fā)病機(jī)理中的關(guān)鍵危險(xiǎn)因素[4-5]。在缺血性疾病中，血流量減少將導(dǎo)致氧氣和葡萄糖輸送不足以及三磷酸腺苷（ATP）的產(chǎn)生和消耗之間的不平衡[6]。目前，已經(jīng)證明氧化應(yīng)激可以產(chǎn)生活性氧（ROS）的惡性循環(huán)，會(huì)進(jìn)一步抑制正常的電子傳遞，最終導(dǎo)致代謝失衡[7]。雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎（BCCAO）誘發(fā)的CCH 被廣泛用作血管性癡呆的模型[8]。

丹參酮IIA（TSA）是從中藥丹參中分離出來(lái)的活性化合物，具有保護(hù)心臟[9]、抗炎[10]、抗氧化和抗凋亡作用[11]，已被廣泛用作預(yù)防或治療心腦血管疾病[12-13]的有效藥物。據(jù)報(bào)道，TSA 可減少大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）的梗塞體積并改善神經(jīng)功能缺陷[14-15]。星形膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中最豐富的細(xì)胞，其和神經(jīng)元之間雙向信號(hào)的存在也揭示了星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)中的重要作用[16]。星形膠質(zhì)細(xì)胞為神經(jīng)元提供結(jié)構(gòu)和代謝支持，保護(hù)血腦屏障，提供抗氧化防御作用[17-18]。然而，在氧化應(yīng)激中，TSA 對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用仍然未知。本文通過(guò)BCCAO動(dòng)物模型、原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的氧化損傷模型探究TSA 的神經(jīng)保護(hù)作用和機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和藥物

2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）購(gòu)自Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司；膠質(zhì)纖維酸蛋白（GFAP）購(gòu)自EnCor 生物技術(shù)公司；Nissl 染色試劑盒，熒光二抗IgG，Hoechst33242，CCK-8檢測(cè)試劑盒，乳酸脫氫酶（LDH）細(xì)胞毒性試劑盒，ATP檢測(cè)試劑盒，JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒和超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；丙二醛（MDA）和還原型谷胱甘肽（GSH）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物公司；BDNF抗體和復(fù)合物I酶活性檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自Abcam 公司；二抗IgG 購(gòu)自Santa Cruz 生物技術(shù)公司；化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）試劑盒購(gòu)自Thermo Scientific科技（中國(guó)）有限公司；細(xì)胞色素氧化酶活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自BioVision公司；免疫組化中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）抗體，生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG，辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的鏈霉親和素均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

多奈哌齊購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。TSA（圖1）由華東理工大學(xué)藥學(xué)院的馬磊課題組提供。

圖1 TSA 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structureof TSA

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組與模型建立SD大鼠（雄性，8周，200～220 g）購(gòu)自上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。將大鼠隨機(jī)分為4組：BCCAO組，BCCAO+TSA組（15 mg/kg），BCCAO+多奈哌齊組（1 mg/kg）和假手術(shù)組（Sham)。藥物預(yù)給藥2周后，根據(jù)先前報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行BCCAO手術(shù)[19]，術(shù)后連續(xù)4周對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃給藥，隨后進(jìn)行水迷宮（MWM）測(cè)試。

1.2.2 MWM 測(cè)試 通過(guò)MWM 測(cè)試大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力[20]。MWM 系統(tǒng)（AniLab Software&Instruments）包括一個(gè)充滿水的圓形水池，直徑為150 cm，深度為50 cm，分為4個(gè)象限并帶有視覺(jué)提示。第1天為適應(yīng)訓(xùn)練，裝置中放置一個(gè)可見(jiàn)的平臺(tái)（直徑10 cm）來(lái)測(cè)試大鼠的視覺(jué)和運(yùn)動(dòng)能力。在第2～5天，將平臺(tái)下降到水面以下，每天進(jìn)行兩次定位航行訓(xùn)練。在測(cè)試階段，平臺(tái)被移走，將每只大鼠依次從與目標(biāo)象限相反的方向放入裝置，由視頻分析系統(tǒng)記錄大鼠在目標(biāo)象限停留的時(shí)間和運(yùn)動(dòng)軌跡。

1.2.3 尼氏染色 大鼠麻醉后，依次經(jīng)心臟灌注生理鹽水和0.04 g/mL 的多聚甲醛（PFA），將大腦儲(chǔ)存在PFA 中。將梯度脫水、石蠟包埋的大腦組織制作成石蠟切片（厚5μm）。將切片脫蠟后滴加尼氏染色液染色10 min，酒精梯度脫水后浸入二甲苯中使透明，最后用中性樹脂封片。使用Image J 軟件對(duì)Nissl 染色陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.4 Western blot 實(shí)驗(yàn) 將蛋白酶抑制劑和1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)在使用前分別加入裂解緩沖液，并在冰上裂解組織。將組織蛋白（上樣量為30 μg）通過(guò)12%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的分離膠分離，并轉(zhuǎn)膜到孔徑0.45μm的聚偏氟乙烯（PVDF）上。用0.05 g/mL的脫脂牛奶封閉2 h 后，將目標(biāo)條帶依次與BDNF抗體（BDNF抗體與稀釋液體積比1∶1 000）孵育過(guò)夜，室溫下與二抗IgG孵育2 h。通過(guò)ECL 發(fā)光液檢測(cè)顯色條帶，使用化學(xué)發(fā)光成像儀（Tanon 5200s）曝光并用Image J 軟件對(duì)條帶進(jìn)行定量。

1.2.5 免疫組化 石蠟切片脫蠟水化后置于檸檬酸緩沖液中，微波高火15 min 進(jìn)行抗原熱修復(fù)，自然冷卻至室溫。采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，體積分?jǐn)?shù)10%的山羊血清封閉非特異性結(jié)合，加入BDNF一抗（BDNF抗體與稀釋液體積比1∶200）于4℃孵育過(guò)夜。滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗于37℃孵育30 min，滴加HRP標(biāo)記的鏈霉親和素于37℃孵育30 min。滴加二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木精復(fù)染2 min 后流水沖洗10 min返藍(lán)。將切片經(jīng)脫水、透明后封片，于顯微鏡（日本Nikon）下觀察。

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng) 按文獻(xiàn)方法制備原代大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞[21]。簡(jiǎn)言之，通過(guò)斷頭使新生大鼠快速安樂(lè)死，并在冰上分離大腦皮層，去除腦膜后，將組織機(jī)械分散并過(guò)篩75μm 細(xì)胞篩以制成單細(xì)胞懸液，取200 g離心5 min 收集細(xì)胞，將細(xì)胞以2×106個(gè) / mL 的密度接種在25 cm2的培養(yǎng)瓶中，并在37℃和5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～9 d，將混合的細(xì)胞在搖床（Labwit Scientific）中以200 r/min 的轉(zhuǎn)速在37℃搖動(dòng)24 h 以除去附著在頂部的小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，通過(guò)免疫熒光鑒定獲得星形膠質(zhì)細(xì)胞純度。首先，將細(xì)胞接種在經(jīng)過(guò)聚L-賴氨酸預(yù)處理的蓋玻片上，待細(xì)胞貼壁后，用0.04 g/mL 的PFA 在室溫下固定15 min。將細(xì)胞用牛血清白蛋白（BSA，0.05 g/mL）封閉1 h 后與GFAP抗體（GFAP抗體與稀釋液體積比1∶1000）在4℃孵育過(guò)夜。用PBS沖洗細(xì)胞3次，在室溫下與熒光二抗IgG（IgG 與稀釋液體積比1∶500）孵育2 h。將細(xì)胞與Hoechst33242（1μg/mL）孵育15 min。最后，將細(xì)胞漂洗3次，并在倒置熒光顯微鏡（日本Nikon）下觀察。

1.2.7 H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和細(xì)胞活力檢測(cè) 星形膠質(zhì)細(xì)胞以1×105個(gè)/mL 接種于96孔板中培養(yǎng)24 h，TSA（0.001、0.01、0.1、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L）處理細(xì)胞24 h 后使用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力。在H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷實(shí)驗(yàn)中，星形膠質(zhì)細(xì)胞用TSA（0.001、0.01、0.1、1.0、2.5、5.0 μmol/L）預(yù)處理2 h 后加入H2O2（100 μmol/L）反應(yīng)24 h，每孔中加入10 μL CCK-8，并在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)4 h。根據(jù)Synergy 2多功能酶標(biāo)儀（BioTek）測(cè)得的450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度測(cè)試細(xì)胞活力。乳酸在LDH 的作用下轉(zhuǎn)化為丙酮酸，伴隨著輔酶I（NAD+）還原為還原型輔酶I（NADH），NADH 可以與碘硝基氯化四氮唑藍(lán)（INT）反應(yīng)形成甲臜，從而在490 nm 波長(zhǎng)處產(chǎn)生吸收峰。收集每組的上清液并在25℃下與工作溶液反應(yīng)30 min。實(shí)驗(yàn)前將細(xì)胞與裂解液孵育60 min，以測(cè)定LDH 的總釋放量。各組釋放量RLDH=（ODsample?ODblank）/ （ODTotal?ODblank）。

1.2.8 線粒體膜電位（MMP） 通過(guò)MMP檢測(cè)試劑盒（JC-1）檢測(cè)MMP。純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞在加入H2O2之前用TSA 預(yù)處理2 h，細(xì)胞與染色工作液在37℃下孵育20 min。用染色緩沖液洗滌兩次后，使用酶標(biāo)儀（Perkin Elmer Enspire 2300）在525 nm（激發(fā)光）/590 nm（發(fā)射光）和490 nm（激發(fā)光）/530 nm（發(fā)射光）設(shè)置下分別檢測(cè)聚合物與單體的熒光比值。

1.2.9 ATP水平 使用ATP分析試劑盒分別檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞、皮層和海馬中的ATP 水平。收集細(xì)胞或組織于冰上裂解，將樣品在4℃、12 000 r/min 條件下離心10 min 以獲得上清液用于進(jìn)一步測(cè)定。按照說(shuō)明書要求，將檢測(cè)溶液添加到96孔板中并在室溫下孵育5 min。將10μL 上清液與100μL 檢測(cè)溶液快速混合，并通過(guò)BioTek 酶標(biāo)儀測(cè)試化學(xué)發(fā)光。

1.2.1 0線粒體復(fù)合物ETC的復(fù)合物I（即NADH

脫氫酶）的活性通過(guò)復(fù)合物I酶活性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)試。在動(dòng)力學(xué)測(cè)定中，將線粒體制備物添加到預(yù)先包被的微孔板中，微孔板中包含捕獲復(fù)合物I 的特異性抗體。復(fù)合物I 的活性是通過(guò)NADH氧化為NAD+，同時(shí)染料被還原，從而導(dǎo)致450 nm 處的吸光度增加而確定。按照細(xì)胞色素氧化酶活性測(cè)定試劑盒評(píng)估復(fù)合物IV 的活性。在室溫下制備細(xì)胞色素c的工作液，與待測(cè)樣本混合，還原性細(xì)胞色素c因氧化導(dǎo)致550 nm 處吸光度降低，進(jìn)而測(cè)定酶的活性。

1.2.1 1 ROS水平 根據(jù)先前描述的方法[22]使用DCFH-DA 評(píng)估ROS。DCFH-DA 可以自由通過(guò)細(xì)胞膜，并且容易水解為非熒光2',7'-二氯二氫熒光素（DCFH），后者可以被ROS進(jìn)一步氧化生成熒光2',7'-二氯熒光素（DCF）。分別用終濃度為0、0.1、1.0、2.5、5.0 μmol/L的TSA 處理純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞2 h。細(xì)胞與DCFHDA（10μmol/L）和Hoechst33242（1μg/mL）在37℃下共孵育20 min 后，PBS漂洗細(xì)胞3次，加入100 μmol/L H2O2作用30 min 并通過(guò)熒光顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度。

1.2.1 2 GSH、MDA、SOD的測(cè)定 將星形膠質(zhì)細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)24 h，然后用TSA（0.1、1.0、2.5、5.0 μmol/L）預(yù)處理2 h，加入100 μmol/L H2O2作用24 h，收集細(xì)胞使之在冰上裂解，然后按照說(shuō)明書的要求測(cè)定GSH、SOD、MDA 水平，將結(jié)果通過(guò)蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.1 3數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。在MWM中，通過(guò)雙因素方差分析大鼠的逃避潛伏期。其他數(shù)據(jù)使用單因素方差分析，使用SPSS Statistics 22.0.0.0進(jìn)行組間的差異性比較。n為每組樣本數(shù)，P<0.05被認(rèn)為有顯著性差異，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，#表示P<0.05，##表示P<0.01，###表示P<0.001。

2 結(jié)果與討論

2.1 TSA 改善了BCCAO引起的認(rèn)知障礙

用MWM評(píng)估TSA 對(duì)BCCAO大鼠認(rèn)知功能的影響。在定位航行訓(xùn)練中，BCCAO大鼠比假手術(shù)組大鼠花費(fèi)更多的時(shí)間來(lái)尋找平臺(tái)（訓(xùn)練第2天，P<0.01；第3天，P<0.05）。如圖2（a）所示，TSA 和多奈哌齊（作為陽(yáng)性對(duì)照）處理的BCCAO大鼠的逃避潛伏期短于未處理的BCCAO大鼠。如圖2（b）所示，在測(cè)試階段，BCCAO大鼠在目標(biāo)象限的時(shí)間明顯減少，TSA 處理延長(zhǎng)了BCCAO大鼠在平臺(tái)象限的停留時(shí)間。多奈哌齊也減輕了BCCAO引起的認(rèn)知能力下降，但在測(cè)試劑量下未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)，圖2（c）排除了平均游泳速度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，各組大鼠代表性的游泳路徑如圖2（d）所示。

2.2 TSA 提高BCCAO大鼠海馬神經(jīng)元的存活

海馬主要負(fù)責(zé)工作記憶和定向?qū)Ш降牟课籟23]。通過(guò)尼氏染色對(duì)大鼠的海馬進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析，分別對(duì)海馬的CA1、CA3和齒狀回（DG）區(qū)域中神經(jīng)元存活細(xì)胞計(jì)數(shù)。如圖3（b）和圖3（c）中，BCCAO大鼠與假手術(shù)組大鼠相比，CA1和CA3區(qū)域中的神經(jīng)元明顯減少，而通過(guò)TSA 的治療可以明顯逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元的丟失。如圖3（d）所示，在DG 區(qū)神經(jīng)元存活細(xì)胞數(shù)沒(méi)有顯著差異。

2.3 TSA 提高了BDNF 表達(dá)水平

據(jù)報(bào)道，BDNF可促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的存活[24]。通過(guò)Western Blot 檢測(cè)各組皮層和海馬中BDNF的表達(dá)水平，圖4（a）和圖4（b）分別為其定量結(jié)果。與假手術(shù)組相比，BCCAO損傷降低了皮層和海馬中的BDNF水平，這與認(rèn)知缺陷的結(jié)果是一致的。與未處理BCCAO大鼠相比，TSA 處理組大鼠的皮層和海馬中BDNF的水平顯著升高（P<0.05）。BDNF免疫組化結(jié)果顯示，各組均可見(jiàn)棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞，但BCCAO大鼠的陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)減少，因此TSA 和多奈哌齊對(duì)損傷具有保護(hù)作用。

圖2 （a）隱藏平臺(tái)試驗(yàn)中的大鼠逃避潛伏期；（b）測(cè)試階段大鼠在目標(biāo)象限的停留時(shí)間；（c）平均游泳速度；（d）測(cè)試階段代表性的游泳軌跡圖（n=17）Fig.2(a)Escape latency of rats in hidden platform trials;(b)Time spent in the target quadrant in probe test;(c)Average swimming speed;(d)Representativeswimming track in probe test (n=17)

圖3 （a）代表性的海馬的顯微照片；（b）～（d）海馬在CA1、CA3、DG 區(qū)（n=3）中的神經(jīng)元存活細(xì)胞計(jì)數(shù)Fig.3(a)Representative photomicrographsof thehippocampus;(b)～(d)Neuronal viablecells in hippocampal CA1,CA3,DG regions(n=3)

圖4 （a）皮層和（b）海馬中BDNF的定量變化；（c）皮層和（d）海馬中BDNF表達(dá)的代表性條帶；（e）免疫組化檢測(cè)皮層和海馬中BDNF的表達(dá)水平Fig.4 Relative BDNF level in the(a)cortex and(b)hippocampus;Representative images of BDNF expression in the(c)cortex and(d)hippocampus；(e) BDNFexpression in thecortex and hippocampusdetected by immunohistochemistry

2.4 TSA 抑制H 2O2誘導(dǎo)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷

星形膠質(zhì)細(xì)胞的免疫熒光鑒定示于圖5（a）。為了確定TSA 的有效濃度，將原代星形膠質(zhì)細(xì)胞用濃度為0.001～20.0 μmol/L 的TSA 處理24 h。圖5（b）中的Cell Counting Kit-8（CCK-8）分析表明5.0 μmol/L 或更低濃度的TSA 對(duì)細(xì)胞活力沒(méi)有影響，而更高濃度（10.0μmol/L和20.0μmol/L）的TSA 則降低了細(xì)胞活力（分別為88.46%±2.675%，83.87%±2.520%）。因此，進(jìn)一步選擇0.001～5.0 μmol/L TSA 檢測(cè)其在H2O2損傷中的保護(hù)作用。H2O2處理后，細(xì)胞活力顯著降低至62.49%±1.722%，而0.01～5.0μmol/L TSA 顯著逆轉(zhuǎn)了H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，如圖5（c）～5（e）中所示，TSA處理組提高了細(xì)胞活力，減少了LDH 釋放，并且緩解了細(xì)胞形態(tài)損傷。

2.5 TSA 改善了線粒體功能障礙

圖6（a）顯示，在H2O2處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞中線粒體膜電位（MMP）明顯下降，而5.0μmol/L TSA 使MMP恢復(fù)到了正常對(duì)照水平。由此推斷TSA 抑制H2O2引起的MMP丟失，可能進(jìn)一步改善線粒體能量代謝的功能障礙。ATP在細(xì)胞的各種生理和病理過(guò)程中起重要作用。通常，ATP水平下降表明線粒體功能受損[25]。圖6（b）～6（d）顯示，H2O2處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞和BCCAO組ATP均下降，TSA 預(yù)處理可以提高它們的ATP水平，表明TSA 在由H2O2和BCCAO引起的能量代謝紊亂中發(fā)揮保護(hù)作用。

圖5 （a）免疫熒光染色；（b）通過(guò)CCK-8檢測(cè)TSA 作用后細(xì)胞活力；（c）通過(guò)CCK-8測(cè)定H2O2 損傷時(shí)細(xì)胞活力；（d）LDH釋放檢測(cè)；（e）在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化Fig.5(a)Immunofluorescent staining;(b)Cell viability measured by CCK-8 assay after TSA treatment;(c)Cell viability detected by the assaysof CCK-8 in H2O2-induced injury;(d)LDH release;(e)Cellular morphology changesunder biological microscope

圖6（e）和圖6（f）中分別顯示了皮層和海馬中復(fù)合物I的活性。BCCAO大鼠的皮層和海馬中復(fù)合物I的活性均降低，TSA 改善了其皮層和海馬中復(fù)合物I的活性，但在多奈哌齊治療的大鼠中未觀察到顯著變化。圖6（g）和圖6（h）中分別顯示了皮層和海馬中復(fù)合物IV 的活性。復(fù)合物IV 是ETC的末端電子受體，并參與ATP合成。在BCCAO組的皮層中觀察到復(fù)合物IV 的活性顯著增加，TSA 處理逆轉(zhuǎn)了這種變化。與BCCAO組相比，TSA 和多奈哌齊均提高了海馬中復(fù)合物I 和復(fù)合物IV 的活性，但數(shù)據(jù)未顯示出顯著差異。

2.6 TSA 抑制氧化還原紊亂并提高抗氧化能力

圖7（a）所示為通過(guò)熒光顯微鏡觀察的不同組的ROS、Hoechst33242、Merqed 熒光照片，半定量結(jié)果如圖7（b）所示。與對(duì)照組的平均DCF熒光強(qiáng)度（3.93±1.044）相比，H2O2處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞中DCF熒光顯著增加（12.81±1.610，P<0.001），表明有明顯的ROS產(chǎn)生。TSA（0.1～5.0μmol/L）以劑量依賴性方式減弱了H2O2誘導(dǎo)的ROS的生成。檢測(cè)TSA 對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中抗氧化的作用，如圖7（c）所示，H2O2損傷明顯提高了MDA 水平，表明H2O2組具有顯著升高的脂質(zhì)過(guò)氧化水平。同時(shí)，圖7（d）、圖7（e）顯示，H2O2損傷降低了星形膠質(zhì)細(xì)胞中SOD活性和GSH水平，TSA 處理可將這些變化顯著逆轉(zhuǎn)，表明TSA對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

圖6 （a） H2O2損傷模型中星形膠質(zhì)細(xì)胞的MMP水平變化；（b）皮層（n=4）、（c）海馬（n=3）和（d） H2O2損傷模型中星形膠質(zhì)細(xì)胞中的ATP水平；（e）皮層（n=5）和（f）海馬（n=3）中復(fù)合物I 的活性；（g）皮層（n=4）和（h）海馬（n=4）中復(fù)合物IV 的活性Fig.6(a)MMP levels in the astrocytes with H2O2 injury; ATP levels in the(b)cortex(n=4)and(c) hippocampus(n=3),respectively;(d)ATPlevels in the astrocytes with H2O2 injury;Complex I activity in the(e)cortex(n=5)and(f)hippocampus(n=3);Complex IV activity in the(g)cortex (n=4)and (h)hippocampus( n=4)

圖7 （a）熒光顯微鏡拍攝的ROS、Hoechst33242、Merqed 熒光照片；（b）平均DCF熒光強(qiáng)度；（c）MDA 水平；（d）SOD活性；（e）GSH 水平Fig.7(a)Fluorescence photos of ROS,Hoechst33242,Merqed by fluorescent microscope;(b)Mean DCF fluorescence intensity;(c)MDA level;(d)SODactivity;and (e)GSH level

3 討 論

許多神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)元功能喪失與線粒體功能障礙有關(guān)[26]。在這項(xiàng)研究中，TSA 治療顯著逆轉(zhuǎn)了BCCAO引起的認(rèn)知缺陷（圖2）以及CA1和CA3區(qū)的神經(jīng)元丟失（圖3）。除了神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用外，BDNF還具有神經(jīng)保護(hù)作用，包括抗凋亡、抗氧化和抑制自噬[27]。BDNF可以保護(hù)大鼠原代皮層細(xì)胞的線粒體功能[28]，據(jù)報(bào)道多奈哌齊可通過(guò)提高BDNF的表達(dá)來(lái)改善大鼠BCCAO模型的認(rèn)知功能[29]。與先前的研究[30]一致，本文結(jié)果顯示BCCAO大鼠的空間學(xué)習(xí)和認(rèn)知能力明顯下降。TSA 和多奈哌齊可增強(qiáng)腦組織中BDNF的水平（圖4），表明BDNF的升高可能參與TSA 的促智和神經(jīng)保護(hù)作用。

用100μmol/L H2O2處理的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯導(dǎo)致細(xì)胞活力下降、LDH 釋放增加和異常形態(tài)變化（圖5）。ROS異常升高可引起線粒體MMP降低，從而引起線粒體功能障礙，并加劇氧化還原狀態(tài)的不平衡[31]，從而加速細(xì)胞ATP耗竭，繼而引起線粒體膜通道孔（mPTP）的開(kāi)放和細(xì)胞凋亡[32]。TSA 處理可以顯著維持MMP 并改善ATP水平。TSA 可以顯著逆轉(zhuǎn)H2O2和BCCAO引起的氧化損傷，可能是通過(guò)改善ROS引起的代謝功能障礙和維持線粒體功能參數(shù)而實(shí)現(xiàn)的。

復(fù)合物I和復(fù)合物III是呼吸鏈中ROS的主要來(lái)源[33]。復(fù)合物IV 將電子轉(zhuǎn)移到最終的電子受體，而復(fù)合物V 或ATP合酶則利用膜電位作為驅(qū)動(dòng)力來(lái)產(chǎn)生ATP[34]。與先前的研究一致[35]，圖6結(jié)果表明BCCAO可以顯著降低線粒體復(fù)合體I 的活性。TSA可以提高腦組織（尤其是皮層）中復(fù)合物I的活性，表明它可以保護(hù)ETC復(fù)合物活性和ATP產(chǎn)生。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)BCCAO在皮層中具有明顯增加的線粒體復(fù)合物IV 活性，這與以前的研究[35]不一致，而TSA 處理逆轉(zhuǎn)了該變化。

H2O2是ROS的主要形式，也是氧化應(yīng)激的誘因。在H2O2處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞中觀察到明顯的細(xì)胞內(nèi)ROS積累現(xiàn)象。用H2O2處理后，脂質(zhì)過(guò)氧化的生物標(biāo)志物MDA 顯著增加。在H2O2處理過(guò)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中觀察到GSH 水平和SOD活性顯著降低（圖7），這可能進(jìn)一步導(dǎo)致自由基清除和氧化還原失衡，進(jìn)而刺激ROS的形成[36]。TSA 處理后ROS含量和MDA 水平降低，同時(shí)，SOD活性增加，GSH水平上調(diào)（圖7）。因此，TSA 可以有效增強(qiáng)線粒體的生物能并改善氧化應(yīng)激，該機(jī)制可能在TSA 改善腦灌注不足和氧化損傷中發(fā)揮重要作用。

總之，本文研究表明，TSA 可能通過(guò)維持線粒體功能和減輕ROS引起的氧化應(yīng)激，從而增強(qiáng)抗氧化防御，對(duì)BCCAO和H2O2引起的氧化損傷發(fā)揮有效的神經(jīng)保護(hù)作用。本文研究為TSA 在腦缺血、腦灌注不足引起的認(rèn)知障礙的保護(hù)作用方面提供了新的證據(jù)。