楊 濤，孫賢波，劉勇弟，蔡正清

（華東理工大學(xué)高濃度難降解有機(jī)廢水處理技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，上海200237）

大量研究顯示環(huán)境中低濃度的抗生素可能誘導(dǎo)微生物抗藥基因的產(chǎn)生[1]。中國(guó)是抗生素生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，大量抗生素的使用及不當(dāng)排放已對(duì)水環(huán)境健康構(gòu)成重大潛在威脅。目前，國(guó)內(nèi)各大地表水域乃至自來(lái)水中檢測(cè)出了不同濃度的抗生素[2-3]。環(huán)境中的抗生素主要來(lái)自醫(yī)院的醫(yī)用廢水、制藥廠的工業(yè)廢水和養(yǎng)殖場(chǎng)的畜禽廢水等，這些廢水的處理通常采用以生物處理為主、物化法相結(jié)合的傳統(tǒng)廢水處理工藝，該類方法可有效降解常規(guī)污染物，但難以完全降解廢水中的各類抗生素[4]。廢水中微量抗生素進(jìn)入環(huán)境中形成“假持久性”污染物，可導(dǎo)致生物毒性和誘導(dǎo)耐藥性生物[5]，該類問(wèn)題已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

頭孢類抗生素具有抗菌譜廣、低致敏、副作用小、品種繁多、殺菌能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，常被用作臨床抗感染類藥物。頭孢氨芐(Cephalexin,CX)是一種典型的頭孢類抗生素，可抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，使得細(xì)胞原生質(zhì)膨脹破裂而達(dá)到殺菌目的。抗生素CX 的母核“四元環(huán)并六元環(huán)”稠合體系受到的環(huán)張力較小，且含氮六元環(huán)中碳碳雙鍵可與相連氮的未共用電子對(duì)共軛，所以CX 的性質(zhì)很穩(wěn)定，在自然環(huán)境中可以長(zhǎng)期穩(wěn)定存在。本研究旨在篩選出能高效降解CX 抗生素的菌株，為傳統(tǒng)生物法降解CX 提供借鑒。

高效菌法是一種強(qiáng)化生物處理技術(shù)，通過(guò)利用特殊菌群來(lái)提高對(duì)某一種或一類生物難降解污染物的降解率，目前使用高效菌法對(duì)抗生素廢水處理的研究越來(lái)越多，并在工程應(yīng)用方面取得了一定突破。Lin 等[6]從活性污泥中分離出兩株假單胞菌CE21和CE22，在CX 質(zhì)量濃度為1 mg/L 下培養(yǎng)24 h 對(duì)CX 的降解率分別達(dá)到90%和46.7%。孫瑞珠等[7]從長(zhǎng)期堆放泰樂(lè)菌素藥渣附近的土壤中分離出一株泰樂(lè)菌素優(yōu)勢(shì)降解菌，對(duì)泰樂(lè)菌素的降解率可達(dá)99%，且將該菌成功應(yīng)用于修復(fù)泰樂(lè)菌素廢渣、廢水污染的環(huán)境，取得了較好的效果。Wang 等[8]利用硝化菌在銨離子存在條件下通過(guò)共降解作用來(lái)降解質(zhì)量濃度為50μg/L 的CX，降解率可達(dá)99%以上，但在無(wú)銨離子情況下降解率小于44%。目前，對(duì)難生物降解的頭孢類抗生素的高效生物降解研究比較少，尤其在高效降解菌的分離以及降解機(jī)理方面的研究較少。

為保證所得CX 降解菌在污水環(huán)境中的耐受性，本文從長(zhǎng)橋生活污水廠的污泥中篩選純化出了降解CX 的高效菌，并對(duì)其進(jìn)行了菌種鑒定，研究了溫度、pH、轉(zhuǎn)速、菌種投加量對(duì)微生物生長(zhǎng)及降解效果的影響。同時(shí)，通過(guò)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC-MS/MS）對(duì)高效菌降解CX 的中間產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)定，推測(cè)了CX 可能的生物降解路徑。該工作對(duì)于水環(huán)境中頭孢類抗生素的高效降解方法的開(kāi)發(fā)具有重要理論和現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

實(shí)驗(yàn)材料：CX（w=98%）、阿莫西林（w=98%）、土霉素（w=98%）、磺胺嘧啶（w=98%）、培氟沙星（w=98%）、甲醇（色譜級(jí)）、蛋白胨（分析純）、牛肉膏（分析純）、瓊脂（分析純）、葡萄糖（分析純），均購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；NaCl、KH2PO4、K2HPO4、(NH4)2SO4、NaNO3、MgCl2、ZnSO4、H3BO3、Na2MoO4、FeSO4、CaCl2、MnSO4純度均不低于99.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；針式濾器（尼龍濾膜，孔徑0.22μm）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

實(shí)驗(yàn)儀器：高效液相色譜儀LC-20AT（日本島津公司）；磁力攪拌器84-1A（上海司樂(lè)儀器有限公司）；BT224s分析天平（北京Sartarius儀器有限公司）；恒溫振蕩培養(yǎng)箱BSD-250（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；潔凈工作臺(tái)（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；PB-10型 pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；H-1型旋渦混合器（上海滬西儀器廠）；JYD-650L 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（上海之信儀器有限公司）；DR5000分光光度計(jì)（美國(guó)Hach 公司）；TGL-16G 飛鴿離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基配方

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（LB）：氯化鈉10 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，調(diào)節(jié)pH 為7.0～7.2。

固態(tài)培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基中加入瓊脂20 g/L，高溫滅菌溶解后冷卻凝固。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：KH2PO41.5 g/L，K2HPO42.3 g/L，(NH4)2SO41 g/L，NaNO30.5 g/L。并加入微量元素：MgCl28 mg/L，ZnSO42 mg/L，H3BO30.4 mg/L，Na2MoO41 mg/L，F(xiàn)eSO42 mg/L，CaCl22 mg/L，MnSO42 mg/L，調(diào)節(jié)pH為7.0～7.2。無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基在使用前先用高壓滅菌鍋滅菌，然后冷卻至室溫，再加入無(wú)菌葡萄糖至其質(zhì)量濃度為5 g/L 時(shí)作為有機(jī)碳源。

篩選培養(yǎng)基：上述培養(yǎng)基經(jīng)115℃高壓滅菌20 min，冷卻后加CX 至質(zhì)量濃度為10 mg/L。

1.3 菌株的分離純化和高效菌的篩選

從長(zhǎng)橋生活污水處理廠污泥中取1 mL 新鮮污泥（混合液揮發(fā)性懸浮固體質(zhì)量濃度（MLVSS）為3.852 g/L），于超凈臺(tái)中轉(zhuǎn)接至150 mL LB培養(yǎng)基中，在30℃、150 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩2 d，設(shè)置不同質(zhì)量濃度梯度（2、4、6、8、10 mg/L）的CX 抗生素的LB培養(yǎng)基，每隔2 d 依次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，直至培養(yǎng)基抗生素質(zhì)量濃度為10 mg/L，得最終菌液培養(yǎng)液。

涂布分離：取10 mL 滅菌離心管裝入0.5 mL最終培養(yǎng)液，并和4.5 mL 無(wú)菌水于旋渦混合器中混合1 min，得到稀釋10倍的混合菌液；再取0.5 mL稀釋10倍的混合菌液于10 mL滅菌離心管中，加入4.5 mL無(wú)菌水，于旋渦混合器中混合1 min，得稀釋102倍的混合菌液；取0.5 mL 稀釋102倍的混合菌液于10 mL滅菌離心管中，采用相同的稀釋方法，依次稀釋得到103至108倍的混合菌液。分別用移液槍從8個(gè)離心管取100μL 稀釋菌液于固態(tài)培養(yǎng)基上，均勻涂布后置于30℃、150 r/min 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d。

劃線純化：從涂布生長(zhǎng)的平板上挑選出不同特征的菌落，劃線分離2～3次得到純菌落，并對(duì)菌落編號(hào)保存，作為菌種使用。

高效菌篩選：將所得菌種在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)24 h，取1 mL 培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到篩選培養(yǎng)基中，每隔一段時(shí)間取樣測(cè)定其OD600（菌液在600 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值）和抗生素質(zhì)量濃度，并分別繪制微生物的生長(zhǎng)曲線和抗生素的降解曲線。

1.4 菌株降解最佳條件

選出最佳降解菌株，以培養(yǎng)溫度、pH、接種量、混合強(qiáng)度為研究對(duì)象，將之前純化培養(yǎng)24 h 后的降解菌株轉(zhuǎn)接到150 mL 篩選培養(yǎng)基中，在不同條件下培養(yǎng)2 d，定時(shí)取樣測(cè)定微生物質(zhì)量濃度和CX 降解率，具體參數(shù)如下：

(1)溫度：調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH 為7.0，接種量為1%（體積分?jǐn)?shù)），轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)時(shí)間2 d。設(shè)置溫度梯度為20、25、30、35、40℃。

(2) pH：調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱溫度為30℃，接種量為1%（體積分?jǐn)?shù)），轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)時(shí)間2 d。設(shè)置培養(yǎng)基pH 為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。

(3)混合強(qiáng)度：調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH 為7.0，接種量為1%（體積分?jǐn)?shù)），培養(yǎng)箱溫度為30℃，培養(yǎng)時(shí)間2 d。設(shè)置培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)速為90、120、150、180 r/min。

(4)接種量：調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min，培養(yǎng)基pH 為7，培養(yǎng)時(shí)間2 d。設(shè)置接種量（體積分?jǐn)?shù)）分別為1%、2%、3%、5%、10%。

每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)。

1.5 菌種鑒定

16SrDNA 鑒定：采用天根細(xì)菌基因組提取試劑盒（DP302-02）提取細(xì)菌DNA。以基因組DNA 為模板，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）引物：27F：AGAGTTT GATCMTGGCTCAG；1492R：GGTTACCTTGTTACG ACTT。擴(kuò)增體系為20μL，其中Taq 酶10μL，上下游引物各1μL，模板1μL，加入無(wú)菌水補(bǔ)充到20μL，稍加混合后立即進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 程序：94℃預(yù)變性3 min；進(jìn)入循環(huán)：94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸100 s，共35個(gè)循環(huán)；最后在72℃下保溫10 min。取10μL PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂糖凝膠電泳，割取目的條帶，按照天根回收試劑盒（DP214-03）純化回收。采用Sanger 法進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序用的試劑盒為：BigDye v3.1 Chemistry kit(Applied Biosystems,Foster City,CA)。之后使用3730XL DNA序列分析儀進(jìn)行測(cè)序，并用DNA Sequencing analysis軟件分析測(cè)序結(jié)果，Sequencing Analysis 5.2.0 軟件進(jìn)行解讀。

菌種經(jīng)過(guò)16S rDNA 基因測(cè)序，所得堿基序列上傳NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)后，與GenBank庫(kù)中核酸數(shù)據(jù)比對(duì)分析，得到多個(gè)該菌株基因序列相近的種、屬的DNA 堿基序列，使用CLUSTALX1.81軟件對(duì)該菌種和與其相近參比菌株的DNA 堿基序列比較，并運(yùn)用Mega 軟件臨近法構(gòu)建菌株試樣和與其相近參比菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.6 分析方法

樣品經(jīng)0.22μm 尼龍濾膜過(guò)濾后采用高效液相色譜（HPLC）測(cè)定CX 質(zhì)量濃度。HPLC條件：流動(dòng)相為超純水和甲醇（超純水和甲醇體積比為75∶25）；流量：1 mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；色譜柱Inertsil ODS-Sp,5μm×4.6 mm×250 mm，在該條件下CX 質(zhì)量濃度檢出范圍為0.1～100 mg/L。

采用LC-MS/MS分析中間產(chǎn)物。質(zhì)譜條件：流動(dòng)相為超純水和甲醇（超純水和甲醇體積比為75∶25）；流量：1 mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：2μL；掃描范圍：m/z為50～350；正離子模式；霧化氣流量：3 L/min；加熱氣流量：10 L/min；接口溫度：300℃；干燥氣流量：10 L/min；色譜柱（Shin-pack Giss C18-P，19μm×3.0 mm×150 mm）。

OD600值由分光光度計(jì)在600 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定菌液吸光度得到。

2 結(jié)果與討論

2.1 CX 高效降解菌株的篩選

從生活污水中通過(guò)不同質(zhì)量濃度梯度的抗生素馴化，涂布劃線得到依次命名為CQ1、CQ2和CQ3的不同菌株。各菌株在以CX 為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中不會(huì)生長(zhǎng)，有研究表明，加入外碳源作為共代謝基質(zhì)后，微生物利用外碳源不僅可以合成細(xì)胞物質(zhì)，使細(xì)胞大量增殖，還能保持胞內(nèi)β-內(nèi)酰胺類抗生素降解酶的活性，可大大提高抗生素的降解效率[9]，故實(shí)驗(yàn)中添加葡萄糖作為外加碳源。菌株在含葡萄糖的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況見(jiàn)表1。其中菌株CQ2生長(zhǎng)狀況最好，且對(duì)CX 具有最高的降解率，因此，選取CQ2菌進(jìn)一步研究其降解特性。

表 1 微生物生長(zhǎng)及CX 降解狀況Table 1 Microbe growth and CX degradation

2.2 菌株鑒定結(jié)果

菌落直徑為4～6 mm，在1 000倍光學(xué)顯微鏡下，CQ2菌呈桿狀，菌體直徑0.4～0.6 μm，長(zhǎng)度1.2～2.5μm，如圖1所示。經(jīng)16SrDNA 鑒定，CQ1為鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas sp.），CQ2和CQ3均為蒼白桿菌屬（Ochrobactrum sp.），并依照《真菌鑒定手冊(cè)》、《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第9版）對(duì)1.3節(jié)篩選的高效菌株進(jìn)行菌株形態(tài)鑒定，如表2所示。菌株CQ2和親緣性相近的其他微生物的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖2所示。有研究表明，鞘氨醇單胞菌和蒼白桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素具有耐藥性，其中蒼白桿菌對(duì)青霉素類、酶抑制復(fù)合劑和頭孢菌素類等β-內(nèi)酰胺類抗生素具有顯著抗性[10-12]。蒼白桿菌是具有平行邊和圓端的桿菌，靠周身鞭毛運(yùn)動(dòng)，專性好氧型異養(yǎng)菌，能利用各種有機(jī)酸、氨基酸和碳水化合物作為有機(jī)碳源，目前為止，利用蒼白桿菌降解頭孢菌素類抗生素的研究仍非常少。

2.3 CQ2的生長(zhǎng)曲線及CX 的降解曲線

圖1 CQ2菌形態(tài)觀察：（a）菌落形態(tài)；（b）單菌株形態(tài)Fig.1 Morphology of strain CQ2:(A)Colony morphology;(B)Singlestrain morphology

表2 高效菌株的形態(tài)學(xué)觀察和鑒定結(jié)果Table2 Morphological observation and identification results of the highly effectivestrains

圖2 基于16SrDNA 序列同源性構(gòu)建的CQ2菌和親緣性相近的其他微生物的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strain CQ2 and other microbe with closeaffinity constructed based on 16SrDNA sequencehomology

在含葡萄糖的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，CX 初始質(zhì)量濃度10 mg/L，溫度30℃，pH 7.0，轉(zhuǎn)速150 r/min，接種量1%（體積分?jǐn)?shù)），采用分光光度法在波長(zhǎng)600 nm下測(cè)定CQ2降解菌的吸光度，并繪制生長(zhǎng)曲線如圖3所示（圖中ρt表示t時(shí)刻CX 的質(zhì)量濃度，ρ0表示CX 初始質(zhì)量濃度，單位mg/L），同時(shí)擬合單位體積內(nèi)微生物總數(shù)（CFU）與OD600的線性關(guān)系，發(fā)現(xiàn)線性相關(guān)性良好，擬合后線性相關(guān)系數(shù)可達(dá)0.991 2，表明OD600可以有效地描述單位體積內(nèi)微生物的個(gè)數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：0～48 h 為對(duì)數(shù)期，在此期間微生物數(shù)量呈幾何數(shù)增殖，生物代謝能力最強(qiáng)，研究CQ2菌性狀取對(duì)數(shù)期最佳；48～60 h 為穩(wěn)定期，微生物的生長(zhǎng)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物大量消耗以及有害代謝產(chǎn)物積累，從而導(dǎo)致微生物個(gè)數(shù)整體趨于飽和。

微生物世代時(shí)間計(jì)算如下：

式中：G為世代時(shí)間；t為微生物生長(zhǎng)時(shí)間；Mt為培養(yǎng)結(jié)束時(shí)活菌數(shù)；M0為初始活菌數(shù)。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中取OD600速率變化較快的時(shí)間段（18～32 h）代入式（1），計(jì)算得到CQ2的世代時(shí)間為367 min。

目前，Monod 方程和Logistic方程被廣泛應(yīng)用于生物群體在約束條件下數(shù)量與時(shí)間的數(shù)學(xué)模型[13]。運(yùn)用Logistic 方程四參數(shù)擬合算法對(duì)CQ2菌的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行擬合，以此描述該菌的生長(zhǎng)狀況。

Logistic 方程：

圖3 CQ2菌的微生物生長(zhǎng)曲線及CX 降解曲線Fig.3 Microbial growth curve and CX degradation curve of strain CQ2

式中：Y為某時(shí)刻的微生物OD600值；A1為OD600的最小估計(jì)值；A2為OD600的最大估計(jì)值；t為微生物生長(zhǎng)時(shí)間；t0為微生物OD600值等于最大OD600值的一半時(shí)的時(shí)間，即微生物生長(zhǎng)速度最快的時(shí)刻；P為t0處曲線的斜率。如圖3所示，生長(zhǎng)曲線經(jīng)Logistic 方程擬合后相關(guān)系數(shù)可達(dá)0.999 9，擬合曲線的表達(dá)式為Y=1.422+1.4075/(1+(T/23.639 9)4.2825）。與式（2）對(duì)比知T0=23.699 9，故取培養(yǎng)24 h 的CQ2菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)效果較好。

從圖3 CX 降解曲線看出，CX 在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期時(shí)被快速降解，36 h 時(shí)微生物對(duì)CX 降解率可達(dá)100%。Al-Gheethi等[14]從污水處理廠中篩選出67株能耐受質(zhì)量濃度為10 mg/L CX 的微生物，但該混合微生物群對(duì)質(zhì)量濃度為5 mg/L CX 的降解率僅為46.66%，且以生物吸附為主。盡管Lin 等[6]從活性污泥中分離出的假單胞菌CE21和CE22在24 h 時(shí)對(duì)CX 降解率分別達(dá)到90%和46.7%，但CX質(zhì)量濃度僅為1mg/L。因此，CQ2菌對(duì)CX 具有較好的降解效果。

2.4 高效菌培養(yǎng)條件對(duì)CQ2菌生長(zhǎng)及CX 降解效果的影響

2.4.1 溫度的影響 溫度對(duì)微生物的生長(zhǎng)以及部分污染物降解相關(guān)酶的活性具有顯著作用[15]。本實(shí)驗(yàn)將CQ2菌接種到含葡萄糖的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在不同溫度培養(yǎng)箱下避光培養(yǎng)36 h。由圖4可知，CQ2隨溫度的升高對(duì)CX 降解率先升高后降低，30℃時(shí)達(dá)到最大降解率100%。隨著溫度的升高OD600值也呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，30℃時(shí)OD600最大值為1.281（CFU 為3.06×108個(gè)/mL），20℃和40℃時(shí)分別為0.758和1.233，這可能是由于溫度影響了微生物胞內(nèi)酶的活性和膜的通透性，高溫或低溫都會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)繁殖，進(jìn)而影響對(duì)CX 的降解率[16]。所以，適宜菌株CQ2的最佳溫度為30℃。

圖4 溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)及CX 降解效果的影響Fig.4 Effectsof temperature on microbial growth and CX degradation

2.4.2 pH的影響 調(diào)節(jié)不同的pH，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)避光培養(yǎng)CQ2菌36 h。如圖5所示，當(dāng)pH 為3.0時(shí)，微生物的OD600值僅為0.214，CX 降解率為33.25%。隨著pH 的升高，OD600值和CX 降解率都是先升高再降低，在pH 為7.0時(shí)OD600達(dá)到最大值1.281，CX降解率達(dá)到100%。pH 過(guò)高或過(guò)低均影響酶的活性和細(xì)胞膜的通透性，不利于微生物的生長(zhǎng)。堿性條件下的CX 降解率要略高于酸性條件下的CX 降解率，根據(jù)CX 的理化性質(zhì)（表3）和CX 的水解平衡示意圖（圖6）[17]，這可能是由于CX 具有典型的β-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)，在堿性條件下被·OH親核攻擊?；I導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺環(huán)開(kāi)環(huán)形成水解產(chǎn)物，從而使得液相色譜儀檢測(cè)的CX 質(zhì)量濃度更低[18]。OD600值和CX 降解率均在pH為7.0時(shí)達(dá)到最大值，說(shuō)明CQ2菌的最適宜pH 為7.0，這與黃倩萍等篩出的蒼白桿菌屬的最適宜pH一致[19]。

圖5 pH 對(duì)微生物生長(zhǎng)及CX 降解效果的影響Fig.5 Effectsof pH on microbial growth and CX degradation

2.4.3 混合強(qiáng)度的影響 改變培養(yǎng)箱的轉(zhuǎn)速，其他條件不變。如圖7所示，在90、120、150、180 r/min 轉(zhuǎn)速下，OD600值始終在1.25左右，且CX 降解率都在99%以上，這說(shuō)明溶液混合強(qiáng)度對(duì)CQ2菌影響較小。轉(zhuǎn)速150 r/min 和180 r/min 下微生物的OD600值略高于其他轉(zhuǎn)速下的OD600值，經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定，90、120、150、180 r/min 轉(zhuǎn)速下對(duì)應(yīng)的溶解氧數(shù)值分別為0.21、0.23、0.22、0.25 mg/L，無(wú)顯著性差異，所以不同轉(zhuǎn)速可能通過(guò)均勻分布培養(yǎng)基中菌體和污染物以及加快傳質(zhì)來(lái)影響降解速率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)速對(duì)CQ2菌生長(zhǎng)影響程度較小，綜合考慮微生物生長(zhǎng)速率和均質(zhì)問(wèn)題，選擇150 r/min作為最佳轉(zhuǎn)速。

表3 CX 理化性質(zhì)Table3 Physicochemical properties of cephalexin

圖6 CX 的水解平衡示意圖Fig.6 Schematic diagram of hydrolysisequilibrium of CX

圖7 轉(zhuǎn)速對(duì)微生物生長(zhǎng)及CX 降解效果的影響Fig.7 Effects of rotation speed on microbial growth and CX degradation

2.4.4 接種量的影響 培養(yǎng)條件不變，改變微生物的接種量培養(yǎng)CQ2菌28 h。如圖8所示，當(dāng)接種量為1%（體積分?jǐn)?shù)）時(shí)，培養(yǎng)CQ2菌28 h 后微生物的OD600值為0.845，CX 降解率為83.25%；當(dāng)接種量增加到5%（體積分?jǐn)?shù)）時(shí)，OD600值為1.402，CX 降解率為100%；當(dāng)接種量繼續(xù)增加至10%（體積分?jǐn)?shù)）時(shí)，OD600值和CX 降解率無(wú)明顯變化。微生物進(jìn)入新的環(huán)境后需要調(diào)整代謝，合成新的代謝酶和某些有機(jī)物，然后進(jìn)入延滯期，而接種量主要與微生物的延滯期有關(guān)。有研究表明，接種量在7%～10%（體積分?jǐn)?shù)）時(shí)菌液生長(zhǎng)密度差異不大，接種量小于5%（體積分?jǐn)?shù)）就會(huì)導(dǎo)致延滯期加長(zhǎng)[20-21]。本實(shí)驗(yàn)表明CQ2菌優(yōu)化后的最佳接種量為5%（體積分?jǐn)?shù)）。

圖8 接種量對(duì)微生物生長(zhǎng)及CX 降解效果的影響Fig.8 Effects of inoculation volume fraction on microbial growth and CX degradation

2.4.5 最佳優(yōu)化條件下CQ2菌對(duì)其他抗生素的降解通過(guò)正交試驗(yàn)得到CQ2菌最優(yōu)的培養(yǎng)條件：溫度30℃，pH 7.0，轉(zhuǎn)速150 r/min，接種量5%（體積分?jǐn)?shù)）。為進(jìn)一步研究CQ2菌對(duì)其他常見(jiàn)抗生素的降解性能，在該條件下，以阿莫西林（青霉素類）、土霉素（四環(huán)素類）、磺胺嘧啶（磺胺類）、培氟沙星（喹諾酮類）為目標(biāo)降解物，初始質(zhì)量濃度為10 mg/L，在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h，測(cè)定剩余抗生素含量，見(jiàn)表4。如表4所示，CQ2菌對(duì)初始質(zhì)量濃度為10 mg/L的阿莫西林、土霉素和磺胺嘧啶均有一定的耐藥性，但對(duì)培氟沙星抗生素較為敏感，OD600值由接種前的0.038降至接種后的0.027。CQ2菌對(duì)抗生素敏感程度依次為培氟沙星>磺胺嘧啶>土霉素>阿莫西林，且CQ2對(duì)阿莫西林的降解效果極佳，最佳條件下培養(yǎng)36 h 可以對(duì)阿莫西林降解率達(dá)到100%。這可能是因?yàn)樯n白桿菌染色體內(nèi)含有特定的AmpC/R 基因，能產(chǎn)生頭孢菌素酶ApmC酶，因此對(duì)具有β-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)的阿莫西林和CX 具有較強(qiáng)的耐藥性[22]。細(xì)菌易對(duì)磺胺類藥物產(chǎn)生耐藥性，且葡萄糖上的C-6羥基被微生物氧化為羧基形成糖醛酸，能與磺胺類藥物結(jié)合使其失活。隨著降解實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，反應(yīng)環(huán)境不斷酸化，土霉素在酸性或堿性條件下都不穩(wěn)定，所以可能導(dǎo)致土霉素被分解。而培氟沙星是喹諾酮類抗生素，通過(guò)干擾DNA 的復(fù)制和菌體蛋白質(zhì)的合成來(lái)抑制細(xì)菌的活性，尤其是革蘭氏陰性桿菌，對(duì)蒼白桿菌具有較強(qiáng)的抑制性[23]。

2.5 CX 降解路徑初探索

提取CQ2菌降解CX 24 h 時(shí)的培養(yǎng)液，經(jīng)過(guò)0.22μm 濾膜處理后采用LC-MS/MS對(duì)中間產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果如圖9所示。通過(guò)Xcalibur 軟件對(duì)質(zhì)核比（m/z）分析比對(duì)，在圖譜中檢測(cè)到m/z=348.10、152.07、158.03、131.07、366.11、176.04、320.12、106.07、219.08等多個(gè)信號(hào)，再通過(guò)MS2的圖譜分析，推測(cè)其結(jié)構(gòu)式分別為CX、BD1-1、BD3-2、BD4、HD1、BD2-2、BD5、BD7-1、BD7-2，推測(cè)CX 降解的路線包括直接生物降解和水解后生物降解。直接生物降解的產(chǎn)物主要是BD1-1和BD1-2，這也是產(chǎn)物中檢測(cè)出的質(zhì)量濃度相對(duì)較高的有機(jī)物，所以推測(cè)這是CQ2菌降解CX 的主要路徑，可能與微生物產(chǎn)生的青霉素?；赣嘘P(guān)[24]，且產(chǎn)物BD1-1可能會(huì)脫羧生成BD7-1，BD1-2進(jìn)行分子內(nèi)加氫生成BD7-2。CX分子中的四元環(huán)易發(fā)生水解導(dǎo)致開(kāi)環(huán)生成HD1，有研究表明，β-內(nèi)酰胺類抗生素的礦化過(guò)程是生物和非生物相結(jié)合的過(guò)程，而水解產(chǎn)物只會(huì)短暫積累，再進(jìn)一步降解為其他代謝物[25]。CX 分子水解后脫羧形成BD5，分子自身的氨基和羧基脫水形成一個(gè)新的六元環(huán)BD6[26]。HD1中含硫六元環(huán)可能會(huì)被開(kāi)環(huán)生成BD2-1和BD2-2；另一方面，產(chǎn)物中檢測(cè)到相對(duì)較多的BD3-1（2-羥基-3-苯基吡嗪），這是由HD1側(cè)鏈上的胺分子內(nèi)攻擊形成，推測(cè)這是CX 水解后生物降解的主要路徑，作為CX 的降解產(chǎn)物BD3-1在很多文獻(xiàn)中被報(bào)道[10,27-28]，BD3-2中含氮雙鍵發(fā)生斷裂，氮被羥基取代，甲硫基被甲基取代生成BD4。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，這些初步降解產(chǎn)物可能會(huì)被進(jìn)一步降解成其他未知物質(zhì)，如產(chǎn)物中檢測(cè)到部分乙酸和碳酸，雖然在只含葡萄糖的培養(yǎng)液中也能檢測(cè)到，但不排除這是CX 降解產(chǎn)物進(jìn)一步礦化形成，也是隨著微生物生長(zhǎng)溶液pH 下降的原因。

表4 CQ2菌對(duì)其他類抗生素的降解率Table4 Degradation rate of strain CQ2 to other antibiotics

圖9 CQ2菌生物降解CX 的初步途徑Fig.9 Preliminary biodegradation of CX by strain CQ2

3 結(jié) 論

（1）本文分離出一株能高效降解抗生素CX 的菌株CQ2，經(jīng)16SrDNA 基因序列鑒定，該菌株系蒼白桿菌（Ochrobactrum sp.）。

（2）實(shí)驗(yàn)條件下，CQ2菌對(duì)CX 降解效果優(yōu)異，最佳培養(yǎng)條件為：溫度30℃，pH 7.0，轉(zhuǎn)速150 r/min，接種量5%（體積分?jǐn)?shù)）。該條件下培養(yǎng)28 h，對(duì)CX的降解率可達(dá)100%。

（3）CQ2菌在最優(yōu)條件下，對(duì)阿莫西林（青霉素類）、土霉素（四環(huán)素類）、磺胺嘧啶（磺胺類）、培氟沙星（喹諾酮類）抗生素的36 h 降解率分別為100%、62.34%、50.29%、5.12%，表明CQ2菌對(duì)阿莫西林也具有較好的降解效果，但對(duì)培氟沙星耐藥性較差。

（4）基于降解中間產(chǎn)物的鑒定提出了CQ2菌降解CX 可能的初步路徑，推測(cè)了CQ2菌降解CX 主要的兩條路徑為直接生物降解和水解后生物降解，其中直接生物降解為主要降解途徑；2-羥基-3-苯基吡嗪為水解后生物降解的主要降解中間產(chǎn)物。