仲文博，張 敏，章弘揚，王月榮，胡 坪

（華東理工大學1.藥學院，上海市新藥設計重點實驗室；2.化學與分子工程學院，上海市功能性材料化學重點實驗室，上海200237）

鹽酸阿霉素（Doxorubicin Hydrochloride，Dox）是一種常見的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，該藥物可以嵌入DNA 中破壞拓撲異構酶II介導的DNA 修復，實現(xiàn)抗腫瘤作用[1]。Dox 具有廣譜抗腫瘤的優(yōu)點，對多種癌癥有較好的治療效果，但其毒副作用和腫瘤細胞對Dox 的耐藥性[2]對它的臨床應用造成一定程度的限制。為了解決上述問題，李穎[3]構建了阿霉素/二甲雙胍共載脂質體，從而改變藥物進入細胞的方式，降低了阿霉素的毒副作用。文獻[4]制備了檸檬酸鹽穩(wěn)定的Fe3O4納米顆粒裝載阿霉素，使阿霉素在腫瘤的弱酸性環(huán)境中可以大量釋放，增大藥物濃度以提高藥效。

碳納米管是由單層或多層石墨六邊形網(wǎng)格平面沿手性矢量卷繞而成的管狀結構[5-6]，分別命名為單壁碳納米管（Single-Walled Carbon Nanotubes，SWCNTs）和多壁碳納米管。單層石墨片沿不同的卷曲方向可以獲得手性結構不同的SWCNTs，不同手性的（n,m）SWCNT 具有不同的性質。當n?m=3q（q為正整數(shù)）時，被稱為半金屬型碳管；當n?m=0時，被稱為金屬型碳管，其導電率可高達銅的近千倍；當n?m=3q±1時，被稱為半導體型管，具有優(yōu)異的電子遷移率[7]。SWCNTs具有獨特的結構，可以穿透細胞膜[8]，而且其比表面積較大，可以實現(xiàn)藥物的有效負載[9]。SWCNTs經(jīng)各種物質修飾改性可以制備納米載藥體系，從而實現(xiàn)對藥物的運輸以及可控釋放[10-11]，減小腫瘤細胞對藥物的耐藥性[12]。當前方法制備得到的SWCNTs含有多種手性以及無定形碳等雜質，對其應用造成了一定的限制，因而需要對其分離以獲得單一手性的SWCNT。

葉酸（Folic Acid，F(xiàn)A）受體在多種腫瘤細胞如乳腺癌、子宮內膜癌等中高表達[13]。將FA 作為尋靶分子修飾藥物載體材料，通過FA 與FA 受體特異性結合，增強給藥體系的腫瘤主動靶向性，降低其在正常組織中的分布，減少不良反應的發(fā)生，從而獲得更好的治療效果。人血清白蛋白（Human Serum Albumin，HSA）是人體血漿中含量最高的蛋白質，約占血漿總蛋白含量的50%，由肝臟合成。HSA 具有豐富的可修飾基團，可與藥物以化學鍵共價結合，起到存儲與運輸藥物的作用[14]。HSA 具有安全無毒、無免疫源性和生物相容性高等優(yōu)點。

本文以分離后的SWCNT作為載藥工具，制備了一種（6,5）SWCNT-Dox-HSA-FA 四元靶向納米載藥系統(tǒng)。以HSA 作為橋梁，將FA 和Dox 以共價鍵連接，通過FA 提高給藥的靶向性；HSA 增強了（6,5）SWCNT 在水中的分散性，其生物相容性也降低了（6,5）SWCNT對細胞的毒性作用；同時因單一手性（6,5）SWCNT的存在更進一步提高了復合物對癌細胞的抑制作用。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

鹽酸阿霉素（Dox）：純度98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；高碘酸鈉（NaIO4）：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；人血清白蛋白（HSA）：純度96%～99%（瓊脂糖凝膠電泳），上海耐澄生物科技有限公司；氰基硼氫化鈉（NaCNBH3）：純度95%，上海麥克林生化科技有限公司；FA：純度≥97%（液相色譜），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）：純度≥99%，上海笛柏生物科技有限公司；SWCNTs：管徑范圍0.7～0.9 nm，碳質量分數(shù)≥95%，SWCNTs質量分數(shù)≥93%，Sigma-Aldrich 有限公司；聚乙二醇（PEG）：Mw=6 000，Sigma-Aldrich 公司；葡聚糖（Dex）：Mw=70 000，京化成工業(yè)株式會社；十二烷基硫酸鈉（SDS）：化學純，永華化學科技（江蘇）有限公司；脫氧膽酸鈉（SDC）：純度98%，Sigma-Aldrich 公司；二乙烯三胺五甲叉膦酸（DTPMP）：ω為50%的水溶液，阿達瑪斯試劑有限公司；透析袋：截留分子量為12 000～14 000，美國Spectrumlabs公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒：P10012S，上海碧云天生物技術有限公司；實驗用水均為超純水。

1.2 儀器

SCQ-250F型功率可調細胞粉碎機（中國上海聲彥超聲波儀器有限公司）；GT 16-WS型高速離心機（中國賽默飛世爾科技公司）；UV-2600型紫外-可見-近紅外（UV-Vis-Nir）吸收光譜儀（日本島津公司）；ST-360型酶標儀（中國上?？迫A生物工程股份有限公司）；NICOLET 380型傅里葉轉換紅外光譜儀（FTIR，中國賽默飛世爾科技公司）。

1.3 實驗步驟

1.3.1 Dox-HSA-FA 的制備及優(yōu)化Dox-HSA-FA 的制備路線如圖1所示，稱取10.0 mg Dox，加入1.0 mL超純水溶解，再加入稍過量的0.1 mol/L NaIO4溶液，室溫下避光反應1 h。加入適量的1.0 mol/L 丙三醇溶液以中和過量的NaIO4，反應30 min。稱取60.0 mg HSA，加入2.0 mL Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液（0.1 mol/L，pH=9.0）溶解，加入上述反應液中，反應1 h，然后加入適量NaCNBH3，在37℃下避光反應2 h[15-16]。反應液經(jīng)離心，透析后凍干，得到Dox-HSA 的凍干產物。調整NaCNBH3的質量分別為10、20、30、40 mg，同時調整Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液的pH 值(9.0、9.5、10.0、11.0、12.0)，重復上述實驗進行優(yōu)化。

圖1 Dox-HSA-FA 的制備路線Fig.1 Preparation routeof Dox-HSA-FA

稱取5.0 mg FA，加入5.0 mL 二甲基亞砜溶解。再加入30.0 mg 的EDC·HCl，室溫下避光反應1 h 以活化FA 上的羧基。稱取30.0 mg Dox-HSA 的凍干產物，加入1.0 mL Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液（0.1 mol/L，pH=9.8）溶解，加入上述反應液中，反應2 h[17]，然后反應液離心，透析后凍干，得到Dox-HSA-FA 的凍干產物。

1.3.2 Dox-HSA 復合物中Dox 的質量濃度測定 配制1.0 mg/mL Dox 儲備液，并逐級稀釋至質量濃度（ρDox）分別為0.2、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0μg/mL，分別測定其在495 nm 的吸光度（A495），繪制A495對于ρDox的一元回歸曲線。測定Dox-HSA 溶液的A495，代入一元回歸曲線方程，計算Dox-HSA 中Dox 的質量濃度。

1.3.3 復合物中HSA 的質量濃度測定 采用BCA

（二喹啉甲酸）法測定Dox-HSA、Dox-HSA-FA 中HSA的質量濃度。配制1.0 mg/mL HSA 標準母液，逐級稀釋至質量濃度（ρHSA）分別為0.006、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL，每個質量濃度設置兩個平行。將BCA 試劑A 和試劑B以體積比為50∶1混合，配成BCA 工作液。分別取20μL、不同質量濃度的HSA標準溶液以及復合物溶液，再加入200μL BCA 工作液混合，室溫下靜置2 h。分別測定樣品在559 nm 的吸光度（A559），繪制A559對于ρHSA的一元回歸曲線。將復合物樣品的A559代入一元回歸曲線方程，計算復合物中HSA的質量濃度。

1.3.4 Dox-HSA-FA 復合物中FA 的質量濃度測定稱取1.0 mg FA 溶于1 mL Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液，配成1.0 mg/mL FA 標準母液，逐級稀釋至質量濃度（ρFA）分 別 為0.5、10、20、30、40、50μg/mL 的FA 標準溶液，分別測定其在360 nm 的吸光度（A360），繪制A360對于ρFA的一元回歸曲線。測定樣品的A360，代入一元回歸曲線方程，計算Dox-HSA-FA 中FA 的質量濃度。

1.3.5 （6,5）SWCNT的分離 稱取1.0 mg （w=2%，1 mL）SWCNTs加入SDC溶液，在225 W 下超聲1 h，同時冰水浴冷卻，離心1 h，取上清液得到SWCNTs分散原液。移取PEG溶液（w=15%，250μL）和Dex 溶液（w=15%，250μL）混合離心得到上相富含PEG，下相富含Dex 的雙水相系統(tǒng)。加入10μL SWCNTs分散原液后混合，離心。加入SDS溶液（w=10%，18μL）后混合，離心。加入適量DTPMP溶液混合離心，使上相呈現(xiàn)出灰綠色，下相呈現(xiàn)出紫色。棄去上相，然后加入250μL預先靜置平衡的雙水相系統(tǒng)的上相，混合離心，上相呈現(xiàn)紫色。加入適量SDC溶液，混合并離心，下相中最終得到淡紫色（6,5）SWCNT溶液，測定樣品的UV-Vis-Nir 光譜。

1.3.6 （6,5）SWCNT-Dox-HSA-FA 的制備 將15.0 mg Dox-HSA-FA 加入900μL 超純水和100μL Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液中溶解。加入上述方法制備所得的（6,5）SWCNT 液體經(jīng)加熱后析出的（6,5）SWCNT固體，在225 W 下超聲1 h，同時冰水浴冷卻，離心1 h，取上清液得到（6,5）SWCNT-Dox-HSA-FA 溶液。

1.3.7 （6,5）SWCNT-Dox-HSA-FA 對Hep G2細胞抑制率的測定 將含有0.1 mg/mL Dox 的（6,5）SWCNTDox-HSA-FA 溶液用培養(yǎng)基逐級稀釋，使ρDox依次分別為50.0、25.0、12.5、6.3、3.1 μg/mL。將含有0.1 mg/mL Dox 的Dox-HSA、Dox-HSA-FA 溶液以相同的方法進行稀釋。取96孔板進行鋪板，每孔約有6 000個Hep G2細胞，周邊孔用磷酸鹽緩沖液溶液填充，在培養(yǎng)箱中于37℃、體積分數(shù)為5%的CO2的條件下培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)基，加入上述含有不同質量濃度Dox 復合物的新培養(yǎng)基，每個復合物質量濃度設置5 個復孔，培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)基，加入新培養(yǎng)基，并加入MTT（噻唑藍）溶液，培養(yǎng)4 h。棄去舊培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜，振搖10 min 后，用酶標儀在492 nm 下測定其吸收值，考察Hep G2細胞的存活率。

2 結果與討論

2.1 Dox-HSA-FA 的表征

測定Dox、HSA、FA、Dox-HSA-FA 的UV-Vis-Nir 吸收光譜，結果如圖2(a)所示。Dox 在495、290 nm處的吸收峰為其特征吸收峰，HSA 在280 nm 處的吸收峰為其特征吸收峰，F(xiàn)A 在360、280 nm 處的吸收峰為其特征吸收峰。由于HSA 和FA 在495 nm 處無吸收，并且經(jīng)過透析后Dox-HSA-FA 樣品中已不含游離的Dox，故Dox-HSA-FA 在495 nm 處的特征吸收峰來源于已偶聯(lián)的Dox。雖然Dox 在360 nm 處也有弱吸收，但其吸光度僅為495 nm 處吸光度的14.3%，并且Dox-HSA-FA 經(jīng)過透析已經(jīng)完全除去游離的FA，由此可以斷定三元復合物在360 nm 處吸收峰來源于已偶聯(lián)的FA。根據(jù)UV-Vis-Nir 吸收光譜能夠初步證實Dox、HSA、FA 三者實現(xiàn)偶聯(lián)。

測定Dox、HSA、FA、Dox-HSA-FA 的FT-IR 光譜，結果如圖2(b)所示。在3 327、1 583、1 284、995 cm?1處的吸收峰為Dox 的特征吸收峰。在3 306、1 656、1 538 cm?1處的吸收峰為HSA 的特征吸收峰。在3 327、3 116、1 694、1 606、1 484 cm?1處的吸收峰為FA 的 特 征 吸 收 峰。Dox-HSA-FA 在3 292、1 655、1 536 cm?1處出現(xiàn)了強吸收峰。比較復合物與Dox、HSA、FA 的IR 光譜，可以得出上述強吸收峰主要來源于HSA。但是由于復合物中HSA 的含量遠遠高于Dox 和FA 的含量，Dox和FA 的特征吸收峰基本被覆蓋。結合UV-Vis-Nir 吸收光譜圖，可以證明Dox、HSA、FA 三者偶聯(lián)成功。

圖2 Dox、HSA、FA、Dox-HSA-FA 的（a）UV-Vis-Nir 光譜圖和（b）FT-IR 光譜圖Fig.2（a）UV-Vis-Nir spectra and （b）FT-IR spectra of Dox,HSA,FA and Dox-HSA-FA

2.2 Dox-HSA 中Dox 對HSA 偶聯(lián)比

2.2.1 Dox-HSA 中Dox 和HSA 的質量濃度HSA 在495 nm 處無吸收，故在495 nm 下測定Dox-HSA 中Dox 的質量濃度。Dox 的A495對ρDox的一元線性回歸曲線方程為：A495=23.1ρDox+0.015 1，R2=0.999 8。將Dox-HSA 溶液的A495代入上述回歸曲線方程，得到Dox-HSA 溶液中ρDox=0.31 mg/mL。

HSA 與BCA 試劑形成紫色的復合物，該復合物的最大吸收波長在559 nm 處，故在559 nm 下測定Dox-HSA 中HSA 的質量濃度。A559對ρHSA的一元線性回歸曲線方程為：A559=1.354 7ρHSA+0.012 7，R2=0.999 8。將Dox-HSA 樣品溶液的A559代入上述回歸曲線方程，得到Dox-HSA 溶液中ρHSA=12.09 mg/mL。

2.2.2 Dox-HSA 中Dox 對HSA 偶聯(lián)比的確定 采用式（1）[17]計算Dox 對HSA 的偶聯(lián)比：

其 中：MDox/MHSA為Dox 對HSA 的 偶 聯(lián) 比；ρDox為Dox 的 質 量 濃 度（mg/mL）；Dox 的 相 對 分 子 量 為597.99；ρHSA為HSA 的質量濃度（mg/mL）；HSA 的相對分子量為66 000。

將ρDox=0.31mg/mL，ρHSA=12.09 mg/mL 代入式（1），得MDox/MHSA=2.8。文獻[18-20]報道當Dox 對血清白蛋白的偶聯(lián)比為2～5時，可以克服Dox 對腫瘤細胞的耐藥性，而且偶聯(lián)比越高，說明每單位質量HSA 負載的Dox 越多。

2.3 Dox-HSA 的制備方法優(yōu)化

按照2.1節(jié)中所述方法測定不同條件下制備所得Dox-HSA 中Dox 對HSA 的偶聯(lián)比，考察NaCNBH3的質量和Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液的pH 用來優(yōu)化實驗。當NaCNBH3的質量分別為10、20、30、40 mg時，偶聯(lián)比分別為3.3、2.9、2.4、2.4，說明10 mg為NaCNBH3的合適用量，過量使用NaCNBH3反而使偶聯(lián)比下降。當Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液的pH分別為9.0、9.5、10.0、11.0、12.0時，偶聯(lián)比分別為2.8、3.3、3.2、3.3、3.2，表明pH>9.5時，偶聯(lián)比均位于3～5之間，具有較高的偶聯(lián)比，可以克服Dox 對腫瘤細胞的耐藥性[18-20]。

2.4 Dox-HSA-FA 中FA 對HSA 偶聯(lián)比

2.4.1 Dox-HSA-FA 中FA 和HSA 的質量濃度 FA 的特征吸收峰位于360 nm 處，故360 nm 作為測定Dox-HSA-FA 中FA 質量濃度的特征吸收波長。FA 的A360對ρFA的一元線性回歸曲線方程為：A360=16.2 ρFA+0.011 6，R2=0.999 8。將Dox-HSA-FA 的A360代入上述回歸曲線方程，得到Dox-HSA-FA 溶液中ρFA=0.48 mg/mL。將Dox-HSA-FA 樣品溶液的A559代入HSA 的一元線性回歸曲線方程，得到Dox-HSAFA 樣品溶液中ρHSA=20.91 mg/mL。

2.4.2 Dox-HSA-FA 中FA 對HSA 偶聯(lián)比的確定采用式（2）[17]計算FA 對HSA 偶聯(lián)比：

其中：MFA/MHSA為FA 對HSA 的偶聯(lián)比；ρFA為FA的質量濃度（mg/mL）；FA 的相對分子量為441.40。

將ρFA=0.48 mg/mL，ρHSA=20.91mg/mL 代入式（2），得出MFA/MHSA=3.4。

2.5 （6,5）SWCNT-Dox-HSA-FA 的制備及表征

本文選用的SWCNTs中含有多種手性體，如（7,6）SWCNT、（7,5）SWCNT、（8,3）SWCNT、（6,5）SWCNT、（9,1）SWCNT、（7,3）SWCNT和（6,4）SWCNT。未分離的SWCNTs分散液中由于多種手性SWCNTs的存在而呈現(xiàn)出黑色，分離后的（6,5）SWCNT溶液呈現(xiàn)出紫色，如圖3(a)所示。分離后的（6,5）SWCNT 溶液在571 nm 和985 nm 處出現(xiàn)了較強的吸收峰，且峰形尖銳。與未分離的SWCNTs溶液相比，（6,5）SWCNT在1 120、1 024、912、952、873 nm 處和505 nm處并未出現(xiàn)明顯的吸收峰，而這些吸收峰分別為（7,6）SWCNT、（7,5）SWCNT、（9,1）SWCNT、（8,3）SWCNT、（6,4）SWCNT、（7,3）SWCNT 的特征吸收峰。因此，可以確定分離所得為單一手性的（6,5）SWCNT。

由圖3(b)可知，四元復合物（6,5）SWCNT-Dox-HSA-FA 在360 nm 處的吸收峰為FA 和（6,5）SWCNT共同疊加得到的吸收峰。四元復合物（6,5）SWCNTDox-HSA-FA 在495 nm 處 的 吸 收 峰 為Dox 和（6,5）SWCNT共同疊加得到的吸收峰。571 nm 和985 nm 處的吸收峰為（6,5）SWCNT 的特征吸收峰，可以證明復合物中（6,5）SWCNT的存在，進一步證明成功制備得到（6,5）SWCNT-Dox-HSA-FA。

2.6 （6,5）SWCNT-Dox-HSA-FA 中（6,5）SWCNT的質量濃度

由于985 nm 處的吸收峰為（6,5）SWCNT的特征吸收峰，而且Dox、FA、HSA 均在此波長處無吸收峰，故位于985 nm 處的吸光度（A985）可以作為測定（6,5）SWCNT質量濃度的依據(jù)。配制SWCNTs的質量濃度（ρSWCNTs）分別為0.1、1、2、4、8、10μg/mL的SWCNTs分散液。由于SWCNTs中（6,5）SWCNT的初始質量分數(shù)為41%，故（6,5）SWCNT的質量濃度（ρ(6,5)SWCNT）分 別 為0.041、0.41、0.82、1.64、3.28、4.1μg/mL。測定其A985并繪制A985對ρ(6,5)SWCNT的一元線性回歸曲線方程：A985=0.224 4ρ(6,5)SWCNT+0.023 6，R2=0.999 1。測定（6,5）SWCNT-Dox-HSA-FA 的A985，代入上述回歸曲線方程，得到ρ(6,5)SWCNT=48.4μg/mL。

圖3 (a)SWCNTs 分散液、（6,5）SWCNT 的實物圖和UV-Vis-Nir 光譜圖；(b)Dox-HSA-FA、（6,5）SWCNT、（6,5）SWCNT-Dox-HSA-FA 的UV-Vis-Nir 光譜圖Fig.3(a)Photo of SWCNTs dispersion and(6,5)SWCNT,and UV-Vis-Nir spectra of SWCNTs dispersion and（6,5）SWCNT;(b) UV-Vis-Nir spectra of Dox-HSA-FA,（6,5）SWCNT,and （6,5）SWCNT-Dox-HSA-FA

2.7 （6,5）SWCNT-Dox-HSA-FA 對Hep G2細胞的毒性作用

（6,5）SWCNT-Dox-HSA-FA 對Hep G2細胞的抑制作用的結果如圖4所示。經(jīng)3種復合物作用后，隨著Dox 質量濃度的增加，Hep G2細胞整體的存活率逐漸減小。但各復合物的作用效果之間存在一定的差異，當ρDox由3.1μg/mL 增加至50.0 μg/mL，經(jīng)Dox-HSA作用后的細胞存活率由95.7%減少至70.1%，僅減少了25.6%；而經(jīng)Dox-HSA-FA 作用后的細胞存活率由87.3%減少至13.7%，減少了73.6%；經(jīng)（6,5）SWCNTDox-HSA-FA 作用后的細胞存活率由84.9%減少至11.1%，減少了73.8%。由此得出，隨復合物質量濃度的增加，細胞存活率的下降幅度為：（6,5）SWCNTDox-HSA-FA>Dox-HSA-FA>Dox-HSA。由GraphPad Prism 軟件計算Dox-HSA-FA 和（6,5）SWCNT-Dox-HSA-FA 的IC50（半數(shù)抑制濃度）分別為27.3μg/mL和25.7 μg/mL。Dox-HSA-FA、（6,5）SWCNT-Dox-HSAFA 的IC50與Dox-HSA 相比，差異均為極顯著性。

圖4 經(jīng)Dox-HSA、Dox-HSA-FA、（6,5）SWCNT-Dox-HSAFA 作用24 h 后Hep G2細胞的存活率Fig.4 Cell viability of Hep G2 cells treated with Dox-HSA, Dox-HSA-FA,（6,5）SWCNT-Dox-HSA-FA for 24 h

在ρDox相同的條件下，經(jīng)Dox-HSA-FA 作用后的細胞存活率均小于經(jīng)Dox-HSA 作用后的細胞存活率，經(jīng)（6,5）SWCNT-Dox-HSA-FA 作用后的細胞存活率又略微小于Dox-HSA-FA 作用后的細胞存活率。綜合比較得出，Dox-HSA 對細胞的毒性作用一般，而Dox-HSA-FA 和（6,5）SWCNT-Dox-HSA-FA 對 細 胞的毒性作用明顯，并且后者的毒性作用更強。由此可見復合物中FA 起到了很好的靶向作用，增強了復合物對細胞的毒性作用，并且分離后的（6,5）SWCNT在一定程度上可以協(xié)助Dox 在Hep G2細胞內的輸送，又在一定程度上增強了復合物對細胞的毒性作用。

選取ρDox分別為6.3、12.5μg/mL 的SWCNTs-Dox-HSA-FA 和（6,5）SWCNT-Dox-HSA-FA 4個復合物，分別將其與Hep G2細胞共培養(yǎng)24、48、72 h，測定Hep G2細胞的存活率，結果如圖5所示。在ρDox為6.3、12.5μg/mL 質量濃度下，經(jīng)（6,5）SWCNT-Dox-HSA-FA 作用后的細胞存活率均低于經(jīng)SWCNTs-Dox-HSA-FA 作用后的細胞存活率。原因可能為經(jīng)分離后所得的（6,5）SWCNT去除了SWCNTs樣品中的無定形碳等雜質，更有利于Hep G2細胞對藥物的內吞與擴散。因此，分離純化后的（6,5）SWCNT比未分離的SWCNTs有更好的藥物運輸作用。

圖5 經(jīng)SWCNTs-Dox-HSA-FA、（6,5）SWCNT-Dox-HSAFA 作用24、48、72 h 后Hep G2細胞的存活率Fig.5 Cell viability of Hep G2 cells treated with SWCNTs-Dox-HSA-FA and（6,5）SWCNT-Dox-HSA-FA for 24,48,72 h

與此同時，隨著復合物與Hep G2細胞共培養(yǎng)時間逐漸增加，Hep G2細胞的存活率逐漸降低。當ρDox=6.3 μg/mL 時，Hep G2細胞經(jīng)SWCNTs-Dox-HSAFA 作用后，細胞存活率由24 h 時的75.0%分別下降到52.6%（48 h）和40.4%（72 h），分別下降了22.4%、34.6%；經(jīng)（6,5）SWCNT-Dox-HSA-FA 作用后，細胞存活率由24 h 時的70.8%分別下降到43.2%（48 h）、31.3%（72 h），分別下降了27.6%、39.5%。當 ρDox=12.5μg/mL 時，Hep G2細胞經(jīng)SWCNTs-Dox-HSAFA 作用后的細胞存活率由51.7%下降到47.5%再到32.1%；經(jīng)（6,5）SWCNT-Dox-HSA-FA 作用后，細胞存活率由44.0%下降到32.7%再到23.7%，可以證明，此兩種復合物對Hep G2細胞的抑制作用均隨著時間的增加而相應增強。培養(yǎng)48、72 h 以后，（6,5）SWCNT-Dox-HSA-FA 作用下的細胞存活率與SWCNTs-Dox-HSA-FA 相比，差異均為極顯著性。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，4種條件下細胞的存活率隨時間增加而造成的下降趨勢存在細微差異。當 ρDox=6.3μg/mL時，兩種復合物在培養(yǎng)時間由24 h 增加到48 h時細胞的存活率下降幅度非常明顯，在48 h增加到72 h后呈現(xiàn)平緩下降趨勢。分析原因可能是由于當 ρDox=6.3μg/mL 時，此質量濃度相對較低，培養(yǎng)24 h后無法對Hep G2細胞起到明顯的抑制作用，適當延長培養(yǎng)時間到48 h，可以增強抑制作用。值得注意的是，給藥48～72 h 后，低質量濃度（6,5）SWCNT復合物的抑制作用與高質量濃度未分離SWCNTs復合物的抑制作用接近。

3 結 論

本文建立了一種（6,5）SWCNT-Dox-HSA-FA 復合物的制備方法。首先，以HSA 為橋梁，通過反應將Dox 和FA 共價偶聯(lián)，制備了Dox-HSA-FA。其次，用雙水相萃取法分離得到單一手性且純度較高的（6,5）SWCNT。最后，利用Dox-HSA-FA 對（6,5）SWCNT進行分散，制備了（6,5）SWCNT-Dox-HSA-FA。本方法有效地將Dox、HSA、FA、（6,5）SWCNT 四者復合。利用復合物中FA 的靶向性，以（6,5）SWCNT作為藥物載體，實現(xiàn)Dox 靶向運送到Hep G2細胞，不僅提高腫瘤細胞對Dox 的攝取，使其抗腫瘤活性得到增強。相較于未經(jīng)分離的包含多種手性體的SWCNTs混合物，（6,5）SWCNT去除了SWCNTs樣品中其他手性體及無定形碳等雜質，更有利于Hep G2細胞對藥物的內吞及在胞內擴散。