摘要：大豆猝死綜合癥是世界大豆主產(chǎn)國(guó)發(fā)生的新真菌病害，近幾年趨于嚴(yán)重，SDS是土傳病害，可隨大豆貿(mào)易傳入新的地區(qū)。中國(guó)是美國(guó)大豆進(jìn)口大國(guó)，為保護(hù)我國(guó)大豆生產(chǎn)，研究確立SDS檢測(cè)技術(shù)，對(duì)口岸采集圖土樣檢測(cè)。對(duì)分子檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，采用PCNB選擇性培養(yǎng)基對(duì)口岸采集圖樣稀釋培養(yǎng)，在ITS2設(shè)立特異引物FVS/A，產(chǎn)生650bp左右的電泳條帶，對(duì)土樣進(jìn)行分子檢測(cè)，表明可鑒別SDS病原菌北美種。

關(guān)鍵詞：大豆猝死綜合癥；檢測(cè)技術(shù)；土壤分離

大豆猝死綜合癥是大豆發(fā)生的鐮刀菌引起的土傳病害，是我國(guó)關(guān)注列入新修訂進(jìn)境植物檢疫危險(xiǎn)性病蟲(chóng)雜草名錄有害生物。1971年在阿肯色州首次發(fā)現(xiàn)，目前廣泛分布于巴西等大豆產(chǎn)區(qū)，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。菜豆根腐病菌在PDA培養(yǎng)基礎(chǔ)上，菌落特征與SDS病原菌相似，2003年Aoki等根據(jù)為害地區(qū)分子系統(tǒng)發(fā)育特征，將SDS病原菌分為南北美種，國(guó)外關(guān)于SDS病原菌的研究較多，但未涉及與F.phaseoli區(qū)分。研究采用分析RFLP圖譜可區(qū)分SDS病原菌。本實(shí)驗(yàn)找到特異引物，將SDS病原菌與其他Fusarium spp區(qū)分，優(yōu)化PCR檢測(cè)技術(shù)，建立適合口岸應(yīng)用的分子檢測(cè)技術(shù)。

1. 大豆猝死綜合癥病原菌相關(guān)研究

大豆為豆科大豆屬，中國(guó)種植大豆已有五千多年的歷史，其品種豐富，世界上其他國(guó)家栽培大豆大多從中國(guó)傳播。大豆是我國(guó)重要油料作物，是主要的牲畜飼料。世界上為害大豆的病蟲(chóng)害有上百種，列入我國(guó)檢疫性有害生物為害病害有菜豆細(xì)菌性萎蔫病菌、煙草環(huán)斑病毒等。近年來(lái)，一些新興有害生物引起各國(guó)學(xué)者的廣泛關(guān)注。大豆猝死綜合癥由2種鐮刀菌引致，造成損失達(dá)100%，病菌可在土壤存活多年。

1982年大豆猝死綜合癥病原菌定名為Fusarium solani，2003年SDS病菌分為南北美種。大豆猝死綜合癥危害性大，美國(guó)約有13個(gè)州發(fā)生過(guò)SDS，常見(jiàn)損失為5%-15%，我國(guó)是大豆生產(chǎn)大國(guó)，產(chǎn)量位列世界第四。大豆猝死綜合征主要分布于巴西等國(guó)，自1971年SDS首次發(fā)現(xiàn)后迅速擴(kuò)展到密蘇里、田納西、依阿華等州。1991年阿根廷在彭巴斯草原首次報(bào)道SDS發(fā)生，阿根廷的SDS病原菌有南北美種。1992年巴西首次報(bào)道SDS，現(xiàn)SDS遍布巴西200多萬(wàn)公頃大豆產(chǎn)區(qū)。

SDS在1971年出現(xiàn)時(shí)未確定病名，1982年M.C.Hirrel將其命名為大豆猝死綜合征，由于病害進(jìn)展與品種抗性等有關(guān)，敏感品種的未成熟植物會(huì)快速死亡，發(fā)病葉部組織很快枯死。SDS可表現(xiàn)在幼苗期，環(huán)境條件適合植株停止發(fā)育。SDS幼苗期癥狀表現(xiàn)為植株矮小，斑點(diǎn)沿葉脈擴(kuò)大。SDS葉部癥狀為葉面出現(xiàn)圓形褪綠色斑點(diǎn)，最終全部枯黃組織壞死。葉片邊緣伴隨卷曲現(xiàn)象。發(fā)病時(shí)葉片脫落，可導(dǎo)致花果發(fā)育不全，高溫天氣癥狀減輕。葉面不表現(xiàn)癥狀，根部無(wú)癥狀，嚴(yán)重感病植株主根形成藍(lán)色菌落，可作為田間鑒定SDS特征。

大豆猝死綜合癥危害性大，容易導(dǎo)致植株豆粒小，嚴(yán)重影響大豆產(chǎn)量。近幾年在美國(guó)發(fā)生趨于普遍，低溫多雨年份損失達(dá)100%。數(shù)據(jù)表明，SDS成為制約大豆產(chǎn)量的重要因素。我國(guó)每年要從國(guó)外進(jìn)口大量大豆，主要出口國(guó)為大豆猝死綜合征疫區(qū)。大量進(jìn)口國(guó)外大豆會(huì)增加危害性有害生物入侵中國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)。國(guó)家質(zhì)檢局設(shè)立大豆猝死綜合征病菌檢疫技術(shù)研究課題，已列入我國(guó)公布禁止進(jìn)境的危險(xiǎn)性病蟲(chóng)雜草名單。

2. SDS土壤分離與分子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

供試菌株來(lái)自阿肯色大學(xué)植物病理系大豆實(shí)驗(yàn)室，大豆疫霉菌由實(shí)驗(yàn)室分離保存。檢測(cè)土樣來(lái)自沿?？诎洞蠖勾?，主要來(lái)自巴西等大豆猝死綜合癥多發(fā)國(guó)家。實(shí)驗(yàn)儀器包括核算蛋白檢測(cè)儀、臺(tái)式冷凍離心機(jī)、PTC-200型PCR擴(kuò)增儀。試劑購(gòu)自華美生物工程公司，MgCl、Taq DNA聚合酶購(gòu)自Promega公司，引物由上海英俊生物公司合成。

PCNB選擇性培養(yǎng)基，參照?qǐng)?bào)告SDS病菌選擇性培養(yǎng)基MNSM配方，以其中1/5氯硝基苯英文縮寫(xiě)命名為PCNB，配方為15g蛋白胨，0.5g硫酸鎂。高壓滅菌冷卻50℃，加入0.34g新霉素，0.1g氯四環(huán)素。從5株Etucumamiea菌種保存土壤中挑取少量土壤，加入1ml無(wú)菌水中，取200μl涂于PCNB平板，23℃光照培養(yǎng)。從斜面培養(yǎng)基挑取少量菌絲，每份土樣取2g放入100ml0.2%水瓊脂中，稀釋10倍，取土壤稀釋液1ml涂抹于PCNB平板，23℃光照培養(yǎng)，參照SDS病原菌特征，挑取菌落轉(zhuǎn)移至PDA營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)。

挑取目標(biāo)菌落孢子，用無(wú)菌水稀釋到孢子清晰個(gè)數(shù)，挑取單個(gè)孢子轉(zhuǎn)移到PDA平板培養(yǎng)，用滅菌刀片掛去菌絲。真菌ITS區(qū)通用引物ITS1/4，在TIS2區(qū)SDS病原菌南北美種與菜豆種有少量穩(wěn)定突變位點(diǎn)，用OMIGA對(duì)比，設(shè)計(jì)特異引物FVS/A。PCR反映體系：25mmol/1MgCl2 2μl，10μmol/l引物各1μl，模板DNA4ng。反應(yīng)條件經(jīng)35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，EB染色15min。大豆猝死綜合征病原菌在選擇性培養(yǎng)基PCNB上生長(zhǎng)緩慢，中心有黃色突起，缺乏氣生菌絲。PDA上菌落缺乏氣生菌絲。在PDA上菌落與SDS病原菌絡(luò)相似。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)菌株未發(fā)現(xiàn)與病原菌相似菌落，挑選菌落培養(yǎng)進(jìn)行分子檢測(cè)。

3. 結(jié)束語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)對(duì)大豆猝死綜合癥病原菌分子檢測(cè)的改進(jìn)，進(jìn)行普通PCR可達(dá)到檢測(cè)目的。相比其他研究，技術(shù)成本低，結(jié)果易于分析。Southern雜交是很好的研究植物病原種群結(jié)構(gòu)工具，是復(fù)雜的DNA檢測(cè)技術(shù)。等位基因特異性PCR對(duì)引物要求高，為避免反映中出現(xiàn)假陰性結(jié)果，加入陽(yáng)性質(zhì)控引物。大豆猝死綜合征病原菌北美種廣泛分布于阿根廷，傳入中國(guó)可能性大，實(shí)驗(yàn)建立北美種檢測(cè)鑒定方法。未來(lái)應(yīng)研究SDS致病機(jī)制，建立南美種鑒定方法，用于實(shí)際檢疫工作。

作者簡(jiǎn)介：

徐鑫（1983.4-），男，漢族，山東濟(jì)寧人，研究生，中級(jí)農(nóng)藝師，研究方向：農(nóng)業(yè)環(huán)保。