張梅娟,錢朋智,董力青,韓楊,汲廣習(xí),馮鎮(zhèn)

1(齊齊哈爾龍江阜豐生物科技有限公司,黑龍江 齊齊哈爾,161031) 2(齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院,黑龍江 齊齊哈爾,161006) 3(齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,黑龍江 齊齊哈爾,161006) 4(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,黑龍江 哈爾濱,160030)

木聚糖是最常見的半纖維組分,在自然界中含量豐富,是第二可再生多糖資源,僅次于纖維素[1-2]。木聚糖酶是一類可將木聚糖降解成木糖和低聚糖的木糖苷鍵水解酶[2],在食品、造紙、飼料、飲料、生物轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域具有重要價(jià)值[3-7]。木聚糖酶分布廣泛,反芻動(dòng)物瘤胃微生物、真菌、細(xì)菌、放線菌、酵母、蝸牛之類的甲殼動(dòng)物、陸地植物組織、海洋藻類以及各種無脊椎動(dòng)物中都存在[8-9]。目前報(bào)道的木聚糖酶產(chǎn)生菌主要有短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)等細(xì)菌,以及木霉屬(Trichoderma)、曲霉菌屬(Aspergillus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)等真菌,且真菌木聚糖酶的活性普遍高于細(xì)菌木聚糖酶[8]。

木霉菌包括哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、綠色木霉(Trichodermaviride)、側(cè)耳木霉(Trichodermapleuroticola)、深綠木霉(Trichodermaatroviride)和長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)等250余個(gè)種類,是一類重要的可再生資源,已成為國際上最具有學(xué)術(shù)和應(yīng)用價(jià)值的資源微生物之一[10-11]。在工業(yè)領(lǐng)域,木霉菌部分種類可產(chǎn)纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶和幾丁質(zhì)酶等多種酶類[11]。目前,有關(guān)木霉菌產(chǎn)纖維素酶的研究較多,而產(chǎn)木聚糖酶的研究報(bào)道較少。JAINA等[12]對1株深綠木霉產(chǎn)木聚糖酶活力進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),木聚糖酶活力較低,為5.8 IU/mL。龔愛姣[13]研究的綠色木霉產(chǎn)木聚糖酶活力可達(dá)40 216 IU/mL,比原始菌株產(chǎn)酶量高18%。魏瑛[14]以里氏木霉(Trichodermareesei)為實(shí)驗(yàn)菌株,得到的木聚糖酶活力為228 U/mL,比原始菌株提高了近10倍。錢朋智等[15]鑒定的側(cè)耳木霉菌株ZJ-03所產(chǎn)木聚糖酶活力在3 000 IU/g以上,且該木聚糖酶可產(chǎn)低聚木糖,占總糖含量的72%。KORKMAZ等[16]從地中海沿海沉積物分離出1株側(cè)耳木霉菌株08?K001,可產(chǎn)木聚糖酶。哈茨木霉是木霉屬中應(yīng)用最廣的1個(gè)菌種[9],作為生防制劑,在植物白絹病、幼苗枯病、疫霉病、馬鈴薯黑痣病等病害的防治上起到明顯作用[17-19],還可產(chǎn)生多種活性次級代謝產(chǎn)物,能促進(jìn)植物的生長[10]。

本研究采用平板水解圈法從平菇栽培污染菌包中篩選出1株高產(chǎn)木聚糖酶的菌株ZJ-01,結(jié)合形態(tài)學(xué)以及核糖體18S序列同源性分析對該菌株進(jìn)行鑒定,并通過固態(tài)發(fā)酵法對菌株的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化,以期為進(jìn)一步研究該菌株產(chǎn)木聚糖酶用于生產(chǎn)低聚木糖的可行性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

玉米皮、玉米胚芽粕和玉米蛋白粉,齊齊哈爾龍江阜豐生物科技有限公司；玉米芯、玉米秸稈和玉米苞葉,山東禹城盛之源農(nóng)業(yè)科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯瓊脂葡萄糖培養(yǎng)基(potato dextrose agar medium,PDA)：參照吳健等[19]的方法制備。

選擇性培養(yǎng)基：木聚糖5 g,NaCl 0.5 g,KH2PO41 g,MgSO40.5 g,瓊脂粉20 g,定容至1 L,pH值自然,高壓滅菌備用。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：按4∶3(g∶mL)將玉米皮用水浸泡過夜；將水分60%的玉米胚芽粕粉與浸泡過夜的玉米皮按4∶1質(zhì)量比混合,添加一定量KH2PO4,pH值自然,高壓滅菌備用。

1.2 儀器和設(shè)備

BS-2F型恒溫雙層振蕩培養(yǎng)箱,常州杰諾基儀器有限公司；5418型臺式高速離心機(jī),德國Eppendorf AG公司；2720型PCR儀,美國ABI；DYCP-32A型電泳儀,北京六一生物科技有限公司；DSX-280B不銹鋼自動(dòng)高壓滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠；HH.S11-1數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋,上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的分離純化和形態(tài)學(xué)鑒定

從平菇污染菌包上挑取霉菌孢子,接種到PDA平板培養(yǎng)基上,并設(shè)空白對照,于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)(倒置)；培養(yǎng)4～5 d,待長出肉眼可識別的菌落后,用接種針挑取菌落邊緣長勢較好的菌絲至新的PDA培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)；重復(fù)3～4 次后得到純化菌株,編號為ZJ-01,接入斜面培養(yǎng)基并于 4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將保存于冰箱的ZJ-01菌株活化,待菌落長滿培養(yǎng)皿后,用5 mm打孔器取塊接種于新的PDA培養(yǎng)基上,于28 ℃恒溫暗培養(yǎng)5 d(倒置),每隔12 h觀察菌落形態(tài),記錄菌絲的顏色變化。

1.3.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

菌株ZJ-01基因組DNA的提?。壕闦J-01 DNA采用Solarbio基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行。

PCR擴(kuò)增：以ZJ-01 DNA為模板,進(jìn)行18S-PCR擴(kuò)增,所用引物為通用引物NS1(5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′)和NS8(5′-TCCGCAGCTTCACCTACGGA-3′)。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：2×Master Mix 10.0 μL,DNA模板2.0 μL,NS1和NS8引物(10 mmol/L)各0.8 μL,加雙蒸水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s,56 ℃退火25 s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)35次；72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電進(jìn)行檢測。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物送至青島科創(chuàng)質(zhì)量檢測有限公司進(jìn)行測序。

序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析：將測得的序列與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列進(jìn)行Blast比對,隨機(jī)選取相似性較高的序列,運(yùn)用MEGA7.0軟件進(jìn)行聚類分析,采用鄰近法(Neighbor-Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.3.3 木霉產(chǎn)木聚糖酶的定性

用直徑為0.5 mm的打孔器從純化的木霉菌落平板培養(yǎng)基中取長勢較好的菌落,接種至選擇性培養(yǎng)基中央,于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)5 d,每天觀察菌落生長狀況和水解圈生成情況。

1.3.4 木聚糖酶液的制備

待PDA平板上長滿菌株ZJ-01孢子,用無菌水洗脫,轉(zhuǎn)入裝有玻璃珠的無菌水中,振蕩,制成孢子懸液。待孢子懸液數(shù)目達(dá)到一定數(shù)量后,接種到初始發(fā)酵培養(yǎng)基中,28 ℃恒溫發(fā)酵適當(dāng)時(shí)間,定時(shí)振蕩。發(fā)酵結(jié)束后,將質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%的生理鹽水和固態(tài)發(fā)酵物按6∶1的質(zhì)量比混勻,浸提4 h,6層紗布過濾；濾液4 ℃離心10 min,所得上清液即為粗酶液。

1.3.5 木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參考方楨的方法并稍作修改[21],以吸光值為橫坐標(biāo)x,木糖濃度為縱坐標(biāo)y。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.237 3x-0.007 4,R2=0.998 5。

1.3.6 木聚糖酶活力的測定

酶活力定義為：在40 ℃、pH 6.0條件下,1 min水解木聚糖生成1 μmol還原糖所需酶的量為1個(gè)酶活力單位,用U/g表示[22]。

采用3,5-二硝基水楊酸法(DNS)測定木聚糖酶的酶活。取1.0 mL適當(dāng)稀釋的酶液于A、B比色管中,分別加入1.5 mL 1.0% 的木聚糖溶液和蒸餾水(空白對照),45 ℃水浴反應(yīng)30 min,加入1.5 mL DNS溶液后在沸水浴中煮沸5 min,迅速用冷水冷卻至室溫,加蒸餾水定容至25 mL,在540 nm處分別測定A管吸光值(AE)和B管吸光值(AB)。

參考GB/T 23847—2009方法[22],對木聚糖酶活力計(jì)算公式進(jìn)行簡化并稍作修改,按公式(1)計(jì)算:

(1)

式中：r,通過OD540值(AE-AB)從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得與標(biāo)準(zhǔn)木糖溶液相對應(yīng)的濃度,mg/mL；Df,稀釋倍數(shù)；1 000；轉(zhuǎn)化因子,1 mmoL=1 000 μmoL；6,生理鹽水與固態(tài)發(fā)酵物的質(zhì)量比,即水料比；150.14,木糖的摩爾質(zhì)量,g/moL；t,酶解反應(yīng)時(shí)間,min。

1.3.7 發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.3.7.1 最適氮源原料的篩選

保持初始發(fā)酵培養(yǎng)基其他成分不變,分別以玉米酒精酒糟、玉米胚芽粕和玉米蛋白粉為氮源原料,與浸泡過夜的玉米皮按4∶1比例混合制成固態(tài)培養(yǎng)基(含水量為60%),接種木霉菌株ZJ-01,28 ℃恒溫發(fā)酵72 h,定時(shí)振蕩,測定酶活,研究不同氮源原料對菌株ZJ-01發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

1.3.7.2 最適碳源原料的篩選

保持初始發(fā)酵培養(yǎng)基其他成分不變,分別以玉米皮、玉米芯、玉米秸稈、玉米苞葉為碳源原料,與篩選出的最適氮源原料按1∶4比例混合制成固態(tài)培養(yǎng)基(含水量為60%),接種木霉菌株ZJ-01,28 ℃恒溫發(fā)酵72 h,定時(shí)振蕩,測定酶活力,研究不同碳源原料對菌株ZJ-01發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

1.3.7.3 最適氮源和碳源原料質(zhì)量比的篩選

將優(yōu)化出的最適氮源和碳源原料,按2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2和9∶1的質(zhì)量比混合制成固態(tài)培養(yǎng)基(含水量為60%),接種木霉菌株ZJ-01,28 ℃恒溫發(fā)酵72 h,定時(shí)振蕩,測定酶活力,研究不同氮源和碳源原料質(zhì)量比對菌株ZJ-01發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

1.3.7.4 最適發(fā)酵時(shí)間的篩選

將菌株ZJ-01接種到最優(yōu)培養(yǎng)基上,28 ℃恒溫發(fā)酵24、48、60、72、84和96 h,定時(shí)振蕩,測定酶活力,研究發(fā)酵時(shí)間對菌株ZJ-01發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉的形態(tài)學(xué)鑒定

在28 ℃培養(yǎng)條件下,菌落生長迅速,菌落生長初期呈絨毛狀,白色,有明顯的同心圓環(huán)狀產(chǎn)孢區(qū)(圖1-a)；隨著菌絲的老熟,顏色由淡綠色變?yōu)榘稻G色(圖1-b)。本研究所得菌株形態(tài)與方圓[23]所描述的哈茨木霉的形態(tài)一致。因此,綜合所觀察的菌落的形態(tài)學(xué)特征,初步將菌株ZJ-01鑒定為哈茨木霉。

a-菌落生長初期;b-菌落生長后期圖1 菌株ZJ-01在PDA培養(yǎng)基上的形態(tài)Fig.1 Morphology of strain ZJ-01 on PDA medium

2.2 木霉的分子生物學(xué)鑒定

提取菌株ZJ-01的總DNA,通過18S PCR產(chǎn)物測序及序列分析,利用NCBI進(jìn)行Blast比對,發(fā)現(xiàn)ZJ-01的擴(kuò)增序列與已知木霉屬菌株18S序列一致性可達(dá)98%以上。構(gòu)建進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)(圖2),菌株ZJ-01與哈茨木霉位于同一分枝上,進(jìn)一步證明菌株ZJ-01為哈茨木霉。

圖2 菌株ZJ-01系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain ZJ-01

2.3 木霉產(chǎn)木聚糖酶的定性

木聚糖酶是一種水解酶,將能產(chǎn)木聚糖酶的微生物在含有木聚糖的選擇平板上培養(yǎng)可形成明顯的透明水解圈[14,19]。透明圈法具有簡單、直觀和快速等優(yōu)點(diǎn),可用于定性木霉產(chǎn)木聚糖酶的研究[15]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),在產(chǎn)木聚糖酶定性平板培養(yǎng)基上第3天即可出現(xiàn)較明顯的水解圈,說明菌株ZJ-01可產(chǎn)木聚糖酶。

2.4 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.4.1 氮源原料

本研究選用含有豐富蛋白質(zhì)的玉米酒精酒糟、玉米胚芽粕和玉米蛋白粉3種物質(zhì)作為氮源,從中優(yōu)選適宜氮源。由圖3可知,不同氮源對哈茨木霉產(chǎn)木聚糖酶活力的影響較大。在3種氮源中,玉米酒精酒糟為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基中所產(chǎn)木聚糖酶活力最高,可達(dá)3 307 U/g,其次是玉米胚芽粕,玉米蛋白粉相對最低,只有1 849 U/g?？赡苁怯捎谟衩拙凭圃阒械鞍踪|(zhì)含量比較豐富,可達(dá)24%以上,而玉米胚芽粕中蛋白質(zhì)含量相對較低,只有17%左右。玉米蛋白粉雖然有很高的蛋白質(zhì)含量(20%～70%),但加水后黏稠度大,溶氧效果差,會抑制微生物的生長,不利于木聚糖酶的合成。綜上所述,選取玉米酒精酒糟作為最適發(fā)酵氮源。

圖3 氮源原料對哈茨木霉產(chǎn)木聚糖酶活力的影響Fig.3 Effect of nitrogen material on xylanase activity of T.harzianum

2.4.2 碳源原料

在微生物的生長代謝中,80%的碳源被用來維持細(xì)胞生命活動(dòng)所需的能量。大多數(shù)真菌產(chǎn)生的木聚糖酶都是復(fù)合酶,也是誘導(dǎo)酶,半纖維素底物及類似物通常都是木聚糖酶的良好誘導(dǎo)物,而不同碳源誘導(dǎo)產(chǎn)木聚糖酶的水平存在差異性[8]。本研究選用價(jià)格低廉易得的玉米皮、玉米芯、玉米秸稈和玉米苞葉4種農(nóng)副產(chǎn)品副產(chǎn)物為原料,以研究最適碳源。從圖4可以看出,不同碳源原料對哈茨木霉產(chǎn)木聚糖酶活力影響順序依次為：玉米皮>玉米苞葉>玉米芯>玉米秸稈。目前,固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的碳源原料多為玉米芯和麩皮等[5,9],選用玉米皮作為碳源原料的研究相對較少[24]。

圖4 碳源原料對哈茨木霉產(chǎn)木聚糖酶活力的影響Fig.4 Effect of carbon material on xylanase activity of T.harzianum

本研究發(fā)現(xiàn)玉米皮的誘導(dǎo)能力明顯高于其他碳源,可達(dá)到3 346 U/g?？赡苁且?yàn)橛衩灼こ撕胸S富的半纖維素,還含有較高量的蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)等木霉所需的營養(yǎng)成分,更有利于木聚糖酶的合成,且比其他3種原料通透性更好,能提高微生物的產(chǎn)酶性能。該結(jié)果與宮曉等研究脈孢霉產(chǎn)木聚糖酶的研究結(jié)果一致[22]。因此,選用玉米皮作為培養(yǎng)基中的最適發(fā)酵碳源原料。

2.4.3 氮源原料和碳源原料質(zhì)量比

適當(dāng)?shù)牡春吞荚磁浔扔兄谖⑸锏纳L代謝和發(fā)酵分解。玉米酒精酒糟和玉米皮均含有微生物生長所需的多種營養(yǎng)成分,且玉米皮又可為微生物的生長提供一個(gè)蓬松的環(huán)境,兩者的合理比例可誘導(dǎo)哈茨木霉高產(chǎn)木聚糖酶。調(diào)整玉米酒精酒糟和玉米皮的質(zhì)量比分別為2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2和9∶1。由圖5可知,隨著氮源和碳源質(zhì)量比的增加,木聚糖酶活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當(dāng)?shù)幢壤^高時(shí),木聚糖酶活力較大,氮源和碳源質(zhì)量比為8∶2時(shí),活力最高,可達(dá)3 430 U/g,說明高比例的氮源為細(xì)胞的快速生長提供了可快速吸收的營養(yǎng)物質(zhì),對哈茨木霉的產(chǎn)酶能力有較大影響,而碳源的影響相對較低,但又不能缺少。本結(jié)果與魏桃英等的研究結(jié)論一致[25]。隨著氮源含量的增加,培養(yǎng)基的蓬松性變差,容易結(jié)塊成團(tuán),影響溶氧和散熱,不利于菌體的生長和產(chǎn)酶,導(dǎo)致酶活力下降。確定適宜氮源和碳源質(zhì)量比為8∶2。

圖5 氮源和碳源質(zhì)量比對哈茨木霉產(chǎn)木聚糖酶活力的影響Fig.5 Effect of mass ratio of nitrogen and carbon on xylanase activity of T.harzianum

2.4.4 發(fā)酵時(shí)間

分別選用24、48、60、72、84和96 h作為發(fā)酵時(shí)間,以確定適宜發(fā)酵時(shí)間。由圖6可知,隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,木聚糖酶活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。發(fā)酵72 h時(shí),木聚糖酶活力最高,達(dá)到3 574 U/g；之后,由于培養(yǎng)基的消耗和菌株生長的衰退,酶活力逐漸降低。同時(shí),在整個(gè)培養(yǎng)過程中,接種后48 h左右可見白色菌絲,接入的孢子開始萌發(fā)；60 h左右培養(yǎng)基表面布有大量淺綠色孢子；72 h后整個(gè)培養(yǎng)基長滿暗綠色孢子。由此確定最適發(fā)酵時(shí)間為72 h。此結(jié)果與權(quán)淑靜等優(yōu)化桔綠木霉產(chǎn)木聚糖酶固態(tài)發(fā)酵條件的研究結(jié)論一致[5]。

圖6 發(fā)酵時(shí)間對哈茨木霉產(chǎn)木聚糖酶活力的影響Fig.6 Effect of fermentation time on xylanase activity of T.harzianum

3 結(jié)論

本研究從平菇栽培污染菌包中分離的綠色霉菌菌株ZJ-01,可在PDA培養(yǎng)基上迅速生長,且形態(tài)特征與哈茨木霉特征相符。在此基礎(chǔ)上,利用分子生物方法對其進(jìn)行測序,所得序列與木霉屬中的許多種類具有較高相似性,可達(dá)98%以上。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn),ZJ-01與哈茨木霉親緣關(guān)系較近,可聚為一類,因此將該菌株鑒定為哈茨木霉。通過單因素試驗(yàn)篩選,得到哈茨木霉ZJ-01固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的適宜碳源為玉米皮,氮源為玉米酒精酒糟,氮源和碳源質(zhì)量比為8∶2,發(fā)酵時(shí)間為72 h。在優(yōu)化條件下,木聚糖酶活力為3 574 U/g。本研究的發(fā)酵培養(yǎng)基以玉米酒精酒糟和玉米皮為原料,成本低廉,具有應(yīng)用潛力,可為進(jìn)一步研究哈茨木霉產(chǎn)木聚糖酶用于生產(chǎn)低聚木糖奠定基礎(chǔ)。