王彥平，婁芳慧，陳月英，楊會會，趙崢嶸，賈彥杰，孫瑞琳

（河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院食品工程學(xué)院，河南 鄭州 451450）

紫山藥（Dioscorea alata）又名參薯、紫淮山、長芋等，為薯蕷科（Dioscoreaceae）薯蕷屬（Dioscorea）多年生草質(zhì)纏繞藤本植物，以其肥大的掌狀塊根或圓柱狀根供食用，肉質(zhì)紫紅色，口感脆嫩，主要在浙江、湖南、廣西、廣東、江西、福建、云南等地種植[1]。紫山藥含有豐富的淀粉、膳食纖維、維生素、礦物元素和多糖、尿囊素、花青素、薯蕷皂苷等生物活性物質(zhì)。紫山藥多糖作為紫山藥中主要功能成分之一，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[2]、抗氧化[3]、抗衰老[4]、降糖[5]、耐缺氧[6]等生物活性。因此，準(zhǔn)確測定紫山藥中多糖含量，對今后紫山藥在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域開發(fā)應(yīng)用具有深遠(yuǎn)意義。

多糖是自然界生物體中重要的組成成分和生物活性物質(zhì)，廣泛存在于動物、植物和微生物的體內(nèi)和細(xì)胞壁中[3]，常用的多糖檢測定量方法有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、地衣酚-硫酸法和高錳酸鉀滴定法等[7-10]，其中苯酚-硫酸法具有操作簡便、靈敏和不需要使用大型儀器等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用在食品開發(fā)領(lǐng)域。苯酚-硫酸法是利用多糖被濃硫酸水合產(chǎn)生的高溫水解成單糖，單糖迅速脫水生成的糖醛衍生物與苯酚發(fā)生顯色反應(yīng)，生成橙黃色衍生物，再以紫外可見分光光度計(jì)法測定，該衍生物在490 nm波長附近呈現(xiàn)最大吸收峰[11]。苯酚-硫酸法是一種廣泛用于測定食品中多糖含量的方法，可用于多聚糖、戊糖和甲基化糖的測定。大量研究認(rèn)為，與蒽酮-硫酸法、地衣酚-硫酸法等方法相比較而言，該方法具有操作簡便、準(zhǔn)確度高、精密度高、穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)[12-16]。

由于顯色反應(yīng)時所用濃硫酸和苯酚用量與多糖的組成成分有關(guān)，過量濃硫酸可造成顯色物質(zhì)分解，從而影響測定結(jié)果[17]，因此有必要對苯酚-硫酸法用于紫山藥多糖的測定條件進(jìn)行優(yōu)化。目前尚未查到有關(guān)紫山藥多糖檢測方法建立方面的報(bào)道，故本試驗(yàn)以紫山藥為原料，采用苯酚-硫酸法，使用紫外分光光度計(jì)法測定紫山藥中多糖含量，優(yōu)化最大吸收波長、顯色溫度、顯色時間、苯酚用量、濃硫酸用量5個試驗(yàn)條件，并對精密度、加標(biāo)回收率等進(jìn)行考察，旨在建立紫山藥中多糖含量測定的最佳方法。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮紫山藥：廣西南寧；葡萄糖、濃硫酸、無水乙醇、苯酚、乙醚、正丁醇、三氯甲烷均為分析純：科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

SHA-C水浴恒溫振蕩器：江蘇杰瑞爾電器有限公司；VORTEX 21K離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；UV1901PCS雙光束紫外可見光分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DK-98-II恒溫水浴鍋：天津泰斯特儀器有限公司；BSA423S-CW分析天平：德國賽多利斯集團(tuán)；202-3AB電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海喬躍電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)溶液的配制

苯酚溶液：精密稱取6.0 g重蒸苯酚[18]，置于棕色容量瓶中，用蒸餾水定容至100 mL，配制成6%的苯酚溶液，置于棕色試劑瓶中，備用。

Sevag試劑[19]：將三氯甲烷和正丁醇以體積比4：1混合，配制成Sevag試劑。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取0.1 g烘干至恒重的無水葡萄糖，置于棕色容量瓶中，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，配制成1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。再分別取該溶液0.6、1.8、3.0、4.2、5.4mL，置于 100mL 容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，配制成系列葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 樣品處理

1.3.2.1 紫山藥多糖粉末制備

新鮮紫山藥經(jīng)洗凈、去皮、切片后，放置鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，于60℃烘干24 h，粉碎后過50目篩。稱取一定量的紫山藥粉添加到乙醚中，在90℃水浴中回流脫脂2 h，抽濾后，烘干紫山藥粉至恒重。稱取5 g脫脂紫山藥粉末按料液比1∶25（g/mL），在溫度60℃，功率200W條件下超聲輔助提取20min，于4000r/min離心15min。將上清液置于250 mL具塞三角瓶中，加入1/4體積的Sevag試劑，置于振蕩器中振蕩混勻30 min后置于分液漏斗中靜置，分層后棄下層膠狀變性蛋白質(zhì)層，取上面水層于8 000 r/min離心10 min，將沉淀去除，取上清液，此Sevag法除蛋白步驟重復(fù)操作5次[7]。合并水層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后加入無水乙醇至乙醇終濃度為75%，靜置醇沉18 h[19]，于4 000 r/min離心10 min后棄上清液，于60℃真空干燥，得紫山藥多糖粉末。

1.3.2.2 紫山藥多糖溶液配制

精密稱取紫山藥多糖粉末20 mg，用蒸餾水溶解定容至500 mL，得40 μg/mL的紫山藥多糖溶液。

1.3.3 最大吸收波長的考察

移取紫山藥多糖溶液2.0 mL于25 mL具塞試管中，加入6%苯酚溶液0.6 mL，混勻后迅速加入5.0 mL濃硫酸，搖勻后沸水浴中顯色20 min，取出后置于冰水中冷卻10 min，采用紫外可見分光光度計(jì)在400 nm～600 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定其最大吸收波長。

1.3.4 試驗(yàn)條件優(yōu)化

1.3.4.1 顯色溫度的考察

移取紫山藥多糖溶液2.0 mL于25 mL具塞試管中，加入6%苯酚溶液0.6 mL，混勻后迅速加入5.0 mL濃硫酸，搖勻后分別在40、60、80、100℃的顯色溫度下，顯色20 min，取出后置于冰水中冷卻10 min，測定吸光度值。

1.3.4.2 顯色時間的考察

移取紫山藥多糖溶液2.0 mL于25 mL具塞試管中，加入6%苯酚溶液0.6 mL，混勻后迅速加入5.0 mL濃硫酸，搖勻后在80℃水浴中分別顯色10、15、20、25、30、35、40 min，取出后置于冰水中冷卻 10 min，測定吸光度值。

1.3.4.3 濃硫酸用量的考察

移取紫山藥多糖溶液2.0 mL于25 mL具塞試管中，加入6%苯酚溶液0.6 mL，混勻后分別迅速加入4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 mL 濃硫酸，搖勻后在 80 ℃水浴中分別顯色20 min，取出后置于冰水中冷卻10 min，測定吸光度值。

1.3.4.4 苯酚用量的考察

移取紫山藥多糖溶液2.0 mL于25 mL具塞試管中，分別加入 6%苯酚溶液 0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL，混勻后分別迅速加入5.0 mL濃硫酸，搖勻后在80℃水浴中顯色20 min，取出后置于冰水中冷卻10 min，測定吸光度值。

1.3.5 方法準(zhǔn)確度及精密度測定

1.3.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精確移取2.0mL系列葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液至25mL具塞試管中，加入0.7 mL 6%苯酚溶液，搖勻，迅速加入6.0 mL濃硫酸，搖勻后置80℃水浴中顯色20 min，取出后置于冰水中冷卻10 min，在488 nm處測定其吸光度。空白對照用2.0 mL蒸餾水代替葡萄糖溶液。以葡萄糖濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5.2 精密度的考察

精密移取5份2.0 mL紫山藥多糖溶液，按1.3.5.1檢測方法平行測定其吸光度值，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.5.3 加標(biāo)回收率的考察

精密移取3份2.0 mL紫山藥多糖溶液，按1.3.5.1檢測方法測定其吸光度值，并計(jì)算得紫山藥多糖含量（以葡萄糖計(jì)）。另取3份2.0 mL紫山藥多糖溶液，分別加入2.0 mL的0.01 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.5.1檢測方法測定吸光度值，計(jì)算加標(biāo)回收率[20]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行處理及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

在400 nm～600 nm波長區(qū)域的掃描結(jié)果見圖1。

由圖1可知，紫山藥多糖溶液的最大吸收波長在488 nm處。

圖1 紫山藥多糖吸收光譜Fig.1 Absorption spectrum of polysaccharides in purple yam

2.2 試驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.2.1 顯色溫度的確定

顯色溫度對吸光度的影響見圖2。

由圖2可知，吸光度隨著顯色溫度升高呈現(xiàn)先升后降低的趨勢。在80℃時，吸光度值最高。水浴溫度達(dá)到100℃時，溶液吸光度值輕微下降，其原因可能是水浴溫度過高，使反應(yīng)底物遭到破壞所致。因此，試驗(yàn)選擇的顯色溫度為80℃。

圖2 不同顯色溫度下的溶液吸光度Fig.2 Absorbance of solution at different reaction temperature

2.2.2 顯色時間的確定

顯色時間對吸光度的影響見圖3。

圖3 不同顯色時間下的溶液吸光度Fig.3 Absorbance of solution at different reaction time

由圖3可知，在10 min～20 min時間段內(nèi)，吸光度值隨著顯色時間增加而增加，20 min后吸光度會輕微下降，但是下降幅度不大，說明該方法的穩(wěn)定性較好。但為保證檢測準(zhǔn)確度，試驗(yàn)選擇顯色反應(yīng)20 min冷卻后迅速測定其吸光度。

2.2.3 濃硫酸用量的確定

濃硫酸用量對吸光度的影響見圖4。

由圖4可知，溶液吸光度隨著濃硫酸用量的增加呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，濃硫酸用量為5.0 mL時，多糖溶液的吸光度達(dá)到最高值。但加入量超過5 mL后，吸光度下降幅度較大，經(jīng)分析可能是由于濃硫酸濃度過高導(dǎo)致多糖碳化嚴(yán)重所致。因此，試驗(yàn)選擇濃硫酸用量為5 mL。

圖4 不同濃硫酸用量下的溶液吸光度Fig.4 Absorbance of solution with diferente amounts of sulfuric acid

2.2.4 苯酚用量的確定

苯酚用量對吸光度的影響見圖5。

圖5 不同苯酚用量下的溶液吸光度Fig.5 Absorbance of solution with diferente amounts of phenol

由圖5可知，6%的苯酚加入量在0.4 mL～0.7 mL之間時，溶液吸光度隨著苯酚加入量迅速升高，說明此時反應(yīng)底物隨著苯酚用量增加而增多；苯酚加入量超過0.7 mL后，吸光度反而下降，說明苯酚用量適中時才能達(dá)到最佳顯色效果。因此，試驗(yàn)選擇6%苯酚用量為0.7 mL。

2.3 方法準(zhǔn)確度和精密度考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖6。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度與濃度之間的線性回歸方程為y=0.016 4x+0.013 8，其R2值為0.999。說明葡萄糖在0～54 μg/mL范圍之間呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

圖6 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of glucose

2.3.2 精密度試驗(yàn)

精密度試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of precision test

結(jié)果表明，通過5次平行試驗(yàn)測定吸光度，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.19%，證明該方法精密度較高，具有良好的重現(xiàn)性。

2.4 加標(biāo)回收率

加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2可知，該方法的加標(biāo)回收率在97.26%～102.63%之間，RSD為2.90%，說明該方法具有良好的回收率，且試驗(yàn)結(jié)果相對穩(wěn)定。

表2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of standard addition and recovery test

3 結(jié)論

試驗(yàn)通過單因素比較分析，優(yōu)化了苯酚-硫酸法對紫山藥多糖含量的測定條件。結(jié)果表明，最優(yōu)測定條件為在2.0 mL待測液中加入0.7 mL苯酚溶液，緩慢勻速加入5.0 mL濃硫酸，混勻后置于80℃水浴中加熱20 min，取出后置于冰水中冷卻10 min，在吸收波長為488 nm條件下測定吸光度。該方法在0～54 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，精密度良好，加標(biāo)回收率高，可作為紫山藥中多糖的測定方法。