李汶，廖怡，趙曉蒙，高伯迪，張前軍，鐘娟芳，杜娟，譚躍球，盧光琇

1.中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生殖與干細(xì)胞工程研究所，湖南 長沙 410078；2.湖南省中信湘雅司法鑒定所，湖南 長沙410078

1 案 例

1.1 簡要案情

因法定父親懷疑孩子（3 歲男孩）非親生，要求進(jìn)行親子鑒定。經(jīng)被鑒定人知情同意后，采集法定父親、孩子、母親、外公和外婆的指尖血，根據(jù)《法庭科學(xué)DNA實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)范》（GA/T 383—2014）采用Chelex-100 法提取DNA。

1.2 檢驗(yàn)過程

1.2.1 39 個(gè)常染色體及X 染色體STR（X-STR）基因座基因分型

對所提取的樣本DNA 采用PowerPlex?21 系統(tǒng)（美國Promega 公司）和AmpF?STRTMIdentifilerTMPlus PCR 擴(kuò)增試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific 公司）在9700 型PCR 儀（美國Applied Biosystems 公司）上共擴(kuò)增20 個(gè)常染色體STR 基因座和Amelogenin基因座，對提取的樣本DNA 采用Goldeneye?DNA 身份鑒定系統(tǒng)22NC［基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)（北京）有限公司］擴(kuò)增另外19 個(gè)常染色體STR 基因座。擴(kuò)增產(chǎn)物在3130xl基因分析儀（美國Applied Biosystems 公司）上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，采用GeneMapperTMID-X軟件（美國Applied Biosystems 公司）進(jìn)行基因分型。

使用Investigator Argus X-12 QS 試劑盒（德國Qiagen 公司）對孩子及母親的DNA 進(jìn)行X-STR 基因座分型檢測。

1.2.2 線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）高變區(qū)檢測

使用表1 所列引物對孩子及母親外周血樣本DNA 進(jìn)行mtDNA 高變區(qū)Ⅰ（hypervariable region Ⅰ，HVR-Ⅰ）、高變區(qū)Ⅱ（hypervariable region Ⅱ，HVR-Ⅱ）的擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性40 s；94 ℃ 40 s，58 ℃40 s，72 ℃40 s，35 個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物于3500xL基因分析儀（美國Applied Biosystems 公司）上進(jìn)行Sanger 測序。根據(jù)《法醫(yī)物證鑒定線粒體DNA 檢驗(yàn)規(guī)范》（SF/Z JD0105008—2018），使用BLAST 在線軟件（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比較孩子及母親的HVR-Ⅰ、HVR-Ⅱ序列，并將孩子和母親的HVR-Ⅰ、HVR-Ⅱ序列分別與mtDNA 修正劍橋參考序列（revised cambridge reference sequence，rCRS）進(jìn)行比較。

表1 mtDNA 高變區(qū)擴(kuò)增引物Tab.1 Amplification primers of mtDNA HVR-Ⅰand HVR-Ⅱ

1.2.3 2 號染色體STR 基因座的檢測

采用Primer-BLAST 在線工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）對2號染色體上15個(gè)STR 基因座進(jìn)行PCR 引物設(shè)計(jì)（表2），其中正向引物進(jìn)行熒光標(biāo)記。

表2 增加的2 號染色體STR 基因座的PCR 引物序列Tab.2 PCR primer sequences of additional autosomal STR loci on chromosome 2

對法定父親、孩子和母親外周血DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性90 s；94 ℃30 s，54 ℃30 s，72 ℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物于3500xL 基因分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，對法定父親、孩子和母親進(jìn)行STR 基因座分型檢測。

1.3 檢驗(yàn)結(jié)果

1.3.1 39 個(gè)常染色體和X-STR 基因座的檢測結(jié)果

在法定父親、孩子和母親的39個(gè)常染色體STR 基因座中發(fā)現(xiàn)4個(gè)基因座不符合孟德爾遺傳定律（表3），其中3 個(gè)位于2 號染色體上，1 個(gè)位于19 號染色體上。孩子在D2S1338、TPOX和D2S441基因座上的兩個(gè)等位基因分型結(jié)果均與法定父親一致，與母親的等位基因分型均不一致。外公、外婆與孩子母親在D2S1338、TPOX和D2S441基因座上的分型結(jié)果符合孟德爾遺傳定律（圖1）。

圖1 3 個(gè)排除母子親權(quán)關(guān)系的2 號染色體STR 基因座的基因圖譜Fig.1 Gene mapping of the 3 STR loci on chromosome 2

表3 法定父親、孩子和母親39 個(gè)常染色體STR 基因座的基因型Tab.3 Genotype of the 39 autosomal STR loci in the alleged father，child and mother

X-STR 基因座分型結(jié)果提示孩子所有X-STR 基因座等位基因均能從母親處找到來源，符合伴性遺傳規(guī)律（表4）。

表4 孩子和母親的X-STR 基因座的基因分型Tab.4 Genotype of X-STR loci of the child and mother

1.3.2 mtDNA 高變區(qū)序列分析結(jié)果

與mtDNA rCRS 進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示，孩子和母親的mtDNA 高變區(qū)均存在11 個(gè)堿基的差異，但母子之間mtDNA 高變區(qū)序列一致（表5）。

表5 孩子和母親的mtDNA 高變區(qū)序列與mtDNA rCRS 匹配分析結(jié)果Tab.5 Matching analysis between mtDNA hypervariable regions of the child and mother and mtDNA rCRS

1.3.3 增加的15 個(gè)2 號染色體STR 基因座分析及連鎖分析結(jié)果

孩子在增加檢測的15 個(gè)2 號染色體STR 基因座的2 個(gè)等位基因片段大小與法定父親一致（表6）。綜合之前試劑盒檢測體系中3 個(gè)2 號染色體STR 基因座，以及增加的19 個(gè)2 號染色體STR 基因座的分析結(jié)果，所有2 號染色體STR 基因座的2 個(gè)等位基因均遺傳自其法定父親。

表6 法定父親、孩子及母親增加的2 號染色體STR 基因座的分析結(jié)果Tab.6 Analysis results of additional STR loci on chromosome 2 of the alleged father，child and mother（bp）

1.4 鑒定意見

依據(jù)現(xiàn)有資料和DNA 分析結(jié)果，支持法定父親為孩子的生物學(xué)父親。

2 討論

在本例親子鑒定案例中，法定父親和孩子在法醫(yī)實(shí)踐中常規(guī)檢測的39 個(gè)常染色體STR 基因座上均符合孟德爾遺傳定律，而母親與孩子在4個(gè)常染色體STR基因座上不符合孟德爾遺傳定律，其中3 個(gè)在2 號染色體上、1 個(gè)在19 號染色體上，但母親與孩子在12 個(gè)X-STR基因座上均符合遺傳規(guī)律，且mtDNA HVR-Ⅰ、HVR-Ⅱ序列一致。經(jīng)檢測分析，4 個(gè)不符合孟德爾遺傳定律母子親權(quán)關(guān)系的遺傳標(biāo)記中，有3 個(gè)是由于父源2 號染色體單親二體（uniparental disomy，UPD）所致，1 個(gè)是由于19 號染色體STR 基因座發(fā)生了一步突變所致。增加檢測的15 個(gè)2 號染色體STR 基因座的分析結(jié)果支持這一結(jié)論。

UPD 是在減數(shù)分裂和（或）有絲分裂期間發(fā)生的兩條同源染色體或部分染色體片段均來源于一個(gè)親本的現(xiàn)象。自1980年首次被報(bào)道[1]后，1988年SPENCE等[2]報(bào)道了第1 例人類UPD。據(jù)報(bào)道[3]，人類UPD 的發(fā)生率約為1/3 500 活產(chǎn)兒。臨床上，UPD 可導(dǎo)致印跡異常、常染色體隱性遺傳病發(fā)生及體細(xì)胞嵌合體等，然而有些染色體（如1 號、2 號、6 號、16 號、21 號等）的UPD 并沒有臨床異常表現(xiàn)[4-7]，但可能會(huì)在檢測的STR等遺傳標(biāo)記上表現(xiàn)為不符合孟德爾遺傳定律，對親子鑒定造成干擾。1988 年，BEIN 等[6]報(bào)道了第1 例因UPD 引起的錯(cuò)誤排除的親子鑒定案例。據(jù)文獻(xiàn)[4-7]報(bào)道，目前已發(fā)現(xiàn)了5 條染色體的UPD 干擾親子鑒定導(dǎo)致錯(cuò)誤排除的現(xiàn)象，這些報(bào)道涉及整條2 號染色體UPD（UPD2）的有6 例[3，8-12]，包括2 例母源UPD2 和4 例父源UPD2，且均為同型UPD。而本例為異型的父源UPD2，可能是由于三體拯救導(dǎo)致，即2 號染色體二體精子與正常卵母細(xì)胞受精產(chǎn)生2 號染色體三體受精卵后丟失母源2 號染色體形成異型父源UPD2。同時(shí)本例證實(shí)了2 號染色體上很少或沒有父系印跡基因。

STR 基因座等位基因突變較為罕見，通常男性突變率（2‰）高于女性（1‰～0.5‰）[13]，STR 基因座的突變會(huì)嚴(yán)重干擾親子鑒定。本例還涉及D19S253基因座發(fā)生了一步突變。D19S253基因座突變較為罕見，在葡萄牙白人、巴西人中突變率分別為3.89×10-3、3.07×10-3[14-15]，此前文獻(xiàn)報(bào)道中國漢族人群中該基因座沒有發(fā)現(xiàn)突變[16-17]。

綜上所述，UPD 和基因突變都會(huì)影響親子鑒定結(jié)果的判斷，尤其是UPD 和突變同時(shí)發(fā)生時(shí)，可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的鑒定意見。因此，當(dāng)父親、母親和孩子之間不符合孟德爾遺傳定律的STR 基因座集中在單條或兩條染色體上時(shí)，應(yīng)謹(jǐn)慎解釋親子關(guān)系檢驗(yàn)結(jié)果。