張佳怡，徐倩南，劉希玲，李成濤，2

1.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 司法部司法鑒定重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200063；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030；3.南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510515；4.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 成都610041

近年來(lái)，通過(guò)研究信使RNA（messenger RNA，mRNA）、微RNA（microRNA，miRNA）和環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）等具有組織特異性和不同發(fā)育階段表達(dá)特異性的生物學(xué)遺傳標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)了RNA 在法醫(yī)物證學(xué)中獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值，如基于高通量測(cè)序技術(shù)和微陣列技術(shù)篩選具有特異性表達(dá)的基因，并結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，分析體液斑的生物成分，進(jìn)一步鑒定體液的組織來(lái)源[1]；也可應(yīng)用于年齡推斷[2]、死亡時(shí)間推斷[3]和損傷形成時(shí)間推斷[4]等方面。然而，RNA 相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果與樣本RNA 的質(zhì)量密切相關(guān)。

外周血是法醫(yī)物證學(xué)日常檢案及研究中較為常見的生物學(xué)檢材。盡管高質(zhì)量的RNA 可通過(guò)立即從新鮮外周血中抽提得到，但在實(shí)際檢案中，外周血樣本多不具備立即抽提的條件。因此，如何保存外周血樣本從而獲得高質(zhì)量的RNA 至關(guān)重要。目前常用的RNA 抽提前血樣保存的方法主要有低溫凍存、PAXgene 全血RNA 管保存、樣本中添加RNA 保存液等[5]。低溫凍存是目前較為普遍的一種血樣處理方法，使用乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝管采集并儲(chǔ)存外周血，過(guò)程簡(jiǎn)便、無(wú)須額外處理且可避免外源性因素的影響，但外周血中RNA 容易受內(nèi)源性因素［如大量存在的核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）[6]］的影響，在收集和儲(chǔ)存過(guò)程中RNA 易發(fā)生降解。有研究[7]證實(shí)，使用PAXgene全血RNA 管保存能夠顯著提高從血樣中分離出的RNA 質(zhì)量，但PAXgene 全血RNA 管過(guò)于昂貴，樣本的收集成本過(guò)高。在血樣中添加RNA 保存液的方法可在采樣地點(diǎn)即進(jìn)行簡(jiǎn)單處理，既減少了外源性因素的影響，使外周血中的RNA 得到保護(hù)，也降低了RNase對(duì)外周血中RNA 的影響。

目前，有關(guān)RNA 質(zhì)量影響因素的研究主要包括提取方法[8-9]、儲(chǔ)存溫度[10]、凍融次數(shù)[11]等方面。KIM等[8]對(duì)冷凍血液使用TRIzol法、PAXgene全血RNA 管法和NucleoSpin 法抽提RNA 并對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，使用TRIzol 法抽提得到的RNA 純度和完整性不能完全滿足RNA 測(cè)序等實(shí)驗(yàn)要求，而試劑盒抽提的RNA 質(zhì)量均能達(dá)到要求。何松哲等[10]對(duì)外周血樣本的保存方式及反復(fù)凍融對(duì)總RNA 的影響進(jìn)行了研究，將樣本置于37 ℃、25 ℃、4 ℃、-20 ℃及-80 ℃條件下，儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)設(shè)置為1、3、5 和7 d，凍融1～3 次，分別提取總RNA，結(jié)果表明，儲(chǔ)存溫度、儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)和凍融次數(shù)對(duì)總RNA 濃度及純度均有明顯影響。但目前有關(guān)樣本預(yù)處理方法和儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)的研究較少。因此，本研究選取8 種不同的外周血預(yù)處理方法和6 個(gè)儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)，采用試劑盒法從外周血中提取總RNA，分析不同預(yù)處理方法和樣本儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)對(duì)RNA 質(zhì)量的影響，篩選出能夠獲得足量高質(zhì)量RNA 的預(yù)處理方法和最佳儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

Centrifuge 5430 小型高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），MX-F 固定式混勻儀（美國(guó)Scilogex 公司），QubitTM2.0 熒光計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），Epoch 微孔板分光光度計(jì)（美國(guó)BioTek 公司），2100 生物分析儀（美國(guó)Agilent 公司）。EDTA 抗凝管（河北鑫樂(lè)醫(yī)療器械科技股份有限公司），PAXgene全血RNA 管（美國(guó)BD 公司），無(wú)核酸酶離心管和槍頭（美國(guó)Axygen 公司）。

Quick-RNATMMiniprep Plus 試劑盒和DNA/RNA ShieldTM樣本保存液（美國(guó)Zymo Research 公司），RNA 6000 Nano 試劑盒（美國(guó)Agilent 公司），QubitTMRNA HS Assay 試劑盒、TRIzolTM試劑、RNAlaterTM穩(wěn)定保存液（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），異丙醇、無(wú)水乙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 樣本采集

選擇3 名健康無(wú)關(guān)個(gè)體，年齡為24～26 歲。每個(gè)個(gè)體使用靜脈采血針與5 mL EDTA 抗凝管抽取外周血共25 mL，使用靜脈采血針與10 mL PAXgene 全血RNA 管抽取外周血2.5 mL，所有采血管均顛倒10 次充分混勻。

本研究已獲得司法鑒定科學(xué)研究院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)為2019-08-01）。樣本采集均遵循知情同意原則并簽署知情同意書。

PAXgene RNA 采血管室溫下放置6 h，-20 ℃冰箱中放置24 h 后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存，使用時(shí)取出室溫下靜置，直至完全融化后顛倒混勻。

將EDTA 抗凝管內(nèi)的外周血取1 mL 于1.5 mL 無(wú)核酸酶離心管中，用不同的預(yù)處理方法進(jìn)行處理，每份樣本每種方法重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，室溫平衡20 min 后置于-80 ℃冰箱中保存。

以上操作均為無(wú)菌操作，所用物品均進(jìn)行無(wú)RNase 處理。

1.3 樣本預(yù)處理

1.3.1 外周血加DNA/RNA ShieldTM法

每份樣本取0.8 mL 均分裝在2 個(gè)1.5 mL 無(wú)核酸酶離心管中（每管0.4 mL 外周血），按外周血與DNA/RNA ShieldTM（1×）保存液1∶1.5 的體積比，每管加入0.6 mL DNA/RNA ShieldTM（1×）保存液，輕輕振蕩混勻后短暫離心，室溫孵育20 min 后放入-80 ℃冰箱保存1 d。

1.3.2 外周血加TRIzolTM法

每份樣本取1 mL 均分裝在4 個(gè)1.5 mL 無(wú)核酸酶離心管中（每管250 μL 外周血），按外周血與TRIzolTM試劑1∶3 的體積比，每管加入750 μL TRIzolTM試劑，輕輕振蕩混勻后短暫離心，室溫孵育20 min 后放入-80 ℃冰箱保存1 d。

1.3.3 外周血加RNAlaterTM法

每份樣本取1 mL 分裝在4 個(gè)1.5 mL 無(wú)核酸酶離心管中（每管250 μL 外周血），按外周血與RNAlaterTM保存液1∶3 的體積比，每管加入750 μL RNAlaterTM保存液，輕輕振蕩混勻后短暫離心，室溫孵育20 min 后放入-80 ℃冰箱保存1 d。

1.3.4 血細(xì)胞加DNA/RNA ShieldTM法

每份樣本取0.8 mL 置于1.5 mL 無(wú)核酸酶離心管中，4 000×g離心10 min，棄去上清液。按沉淀（血細(xì)胞）與DNA/RNA ShieldTM（1×）保存液1∶1.5 的體積比加入DNA/RNA ShieldTM（1×）保存液，輕輕振蕩混勻后短暫離心，室溫孵育20 min 后放入-80 ℃冰箱保存1 d。

1.3.5 白細(xì)胞加TRIzolTM法

每份樣本取1 mL 置于1.5 mL 無(wú)核酸酶離心管中，新鮮抗凝血以4 000×g離心10 min，棄去上清液，并將沉淀全部轉(zhuǎn)移到1.5 mL 無(wú)核酸酶離心管中，按沉淀與紅細(xì)胞裂解液1∶3 的體積比將兩者混勻，冰上靜置10 min。4 000×g離心5 min，棄去上清液，按沉淀與紅細(xì)胞裂解液1∶2 的體積比將兩者混勻，冰上靜置5 min，4 000×g離心5 min，棄去上清液。加入1mL TRIzolTM試劑，混勻后移液到1.5 mL 無(wú)核酸酶離心管中，室溫孵育20 min 后放入-80 ℃冰箱保存1 d。

1.3.6 白細(xì)胞加RNAlaterTM法

每份樣本取1 mL 置于1.5 mL 無(wú)核酸酶離心管中，新鮮抗凝血以4 000×g離心10 min，棄去上清液，并將沉淀全部轉(zhuǎn)移到1.5 mL 無(wú)核酸酶離心管中，按沉淀與紅細(xì)胞裂解液1∶3 的體積比將兩者混勻，冰上靜置10 min。4 000×g離心5 min，棄去上清液，按沉淀與紅細(xì)胞裂解液1∶2的體積比將兩者混勻，冰上靜置5 min，4 000×g離心5 min，棄去上清液。加入1 mL RNAlaterTM保存液，混勻后移液到1.5 mL 無(wú)核酸酶離心管中，室溫孵育20 min 后放入-80 ℃冰箱保存1 d。

1.3.7 直接凍存法

每份樣本取0.8 mL 置于1.5 mL 無(wú)核酸酶離心管中，輕輕振蕩混勻后短暫離心，室溫孵育20 min 后放入-80 ℃冰箱保存1 d。此方法的樣本未經(jīng)任何處理，作為空白對(duì)照組。

1.3.8 PAXgene 全血RNA 管法

采集完外周血后，將PAXgene 全血RNA 管在室溫下放置6 h，-20 ℃冰箱中放置24 h 后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存。

1.3.1～1.3.7 節(jié)的預(yù)處理法采用EDTA 抗凝管收集血液，1.3.8 節(jié)預(yù)處理法采用PAXgene 全血RNA 管收集血液。

1.4 樣本儲(chǔ)存

選取外周血加DNA/RNA ShieldTM對(duì)3 名健康志愿者的外周血進(jìn)行預(yù)處理。外周血起始量均為1 mL，經(jīng)預(yù)處理后在-80 ℃條件下分別保存0、5、10、15、30和60 d。

1.5 總RNA 提取

先將樣本從-80 ℃冰箱中取出，室溫下融化。按照Quick-RNATMMiniprep Plus 試劑盒操作說(shuō)明書對(duì)經(jīng)過(guò)不同方法預(yù)處理的樣本進(jìn)行總RNA 抽提，得到洗脫體積為50 μL 的RNA 提取物。具體步驟如下。

1.5.1 外周血加DNA/RNA ShieldTM法

①每1 mL 樣本混合液中加入20 μL PK 充分混勻，室溫孵育30 min；

②孵育后加入等體積的異丙醇混勻；

③混勻后的液體依次加入過(guò)濾柱，10 000×g離心1 min，棄掉濾液；

④過(guò)濾柱中加入0.4 mL RNA漂洗緩沖液，10 000×g離心1 min，棄掉濾液；

⑤按照每份樣本5 μL DNaseⅠ和75 μL DNA 裂解液的比例加入無(wú)核酸酶離心管混勻，向過(guò)濾柱加入80 μL DNaseⅠ混合液，室溫孵育15 min；

⑥加入0.4 mL RNA 預(yù)洗緩沖液，10 000×g離心1 min，棄掉濾液；

⑦加入0.7 mL RNA 漂洗緩沖液，10 000×g離心1 min，棄掉濾液；

⑧加入0.4 mL RNA 漂洗緩沖液，10 000×g離心2 min，棄掉濾液；

⑨加入50 μL 無(wú)核酸酶水，將RNA 從過(guò)濾柱中洗脫出來(lái)。

1.5.2 外周血加TRIzolTM法

①將樣本混合液與乙醇（95%～100%）按1∶1 的體積比混勻；

后續(xù)步驟同1.5.1 節(jié)③～⑨。

1.5.3 外周血加RNAlaterTM法

①將樣本混合液與無(wú)核酸酶水按1∶1 的體積比混勻；

②將混合液與RNA 裂解液按1∶4 的體積比混勻，混勻后加入過(guò)濾柱，4 000×g離心1 min，留過(guò)濾液；

③加入等體積的乙醇（95%～100%）混勻，混勻后加入過(guò)濾柱，10 000×g離心1 min，棄掉濾液；

后續(xù)步驟同1.5.1 節(jié)④～⑨。

1.5.4 血細(xì)胞加DNA/RNA ShieldTM法

①每1 mL 樣本混合液中加入20 μL PK 充分混勻，室溫孵育30 min；

②孵育后加入等體積的異丙醇混勻；

后續(xù)步驟同1.5.1 節(jié)③～⑨。

1.5.5 白細(xì)胞加TRIzolTM法

①將混合液與乙醇（95%～100%）按2∶1 的體積比混勻；

后續(xù)步驟同1.5.1 節(jié)③～⑨。

1.5.6 白細(xì)胞加RNAlaterTM法

①將樣本混合液與無(wú)核酸酶水按1∶1 的體積比混勻；

②將混合液與RNA 裂解液按1∶4 的體積比混勻，混勻后加入過(guò)濾柱，4 000×g離心1 min，留過(guò)濾液；

③加入等體積的乙醇（95%～100%）混勻；

后續(xù)步驟同1.5.1 節(jié)③～⑨。

1.5.7 直接凍存法

①將樣本混合液與DNA/RNA ShieldTM（2×）保存液按1∶1 的體積比混勻；

②每0.1 mL 樣本混合液中加入2 μL PK 充分混勻，室溫孵育30 min；

③將混合液與異丙醇按1∶2 的體積比混勻；

后續(xù)步驟同1.5.1 節(jié)③～⑨。

1.5.8 PAXgene 全血RNA 管法

①3 000×g～5 000×g離心10 min，棄去上清液；

②加入4 mL 無(wú)核酸酶水，渦旋混勻后3 000×g～5 000×g離心10 min，棄去上清液；

③加入DNA/RNA ShieldTM（1×）保存液使沉淀全部浸沒(méi)，每0.3 mL 樣本加入30 μL DNA 裂解液和15 μL PK，混勻后55 ℃孵育30 min；

④混勻后以最大速度離心2 min，將上清液轉(zhuǎn)移至試管內(nèi)；

⑤加入等體積的RNA 裂解液并混勻，加入過(guò)濾柱后離心，留過(guò)濾液；

⑥加入等體積的乙醇（95%～100%）混勻；

后續(xù)步驟同1.5.1 節(jié)③～⑨。

1.6 RNA 濃度、純度和完整性分析測(cè)定

在QubitTM2.0 熒光計(jì)上使用QubitTMRNA HS Assay試劑盒測(cè)定提取所得RNA的濃度，使用Epoch微孔板分光光度計(jì)測(cè)定提取所得RNA 的純度（D260/D280），濃度和純度均重復(fù)測(cè)量3 次，取平均值。使用2100 生物分析儀測(cè)定提取所得RNA 的完整性（RNA integrity number，RIN）。

1.7 RNA 質(zhì)量評(píng)估

RNA 質(zhì)量主要從產(chǎn)量、純度和RIN 值3 個(gè)方面進(jìn)行評(píng)判。其中RNA 產(chǎn)量需根據(jù)RNA 洗脫體積與RNA濃度來(lái)計(jì)算。由于本研究各組外周血起始量略有差異，因此，將不同外周血起始量所得RNA 濃度與洗脫體積之積統(tǒng)一換算成每毫升外周血起始量所得RNA產(chǎn)量。RNA 純度在1.8～2.0 范圍表明樣本的純度較高，D260/D280值＜1.8 表明有蛋白質(zhì)或酚污染，而D260/D280值＞2.0 表明有異硫氰酸胍等物質(zhì)污染。RIN 值能夠反映樣本RNA 的降解程度，RIN 值一般在0（完全降解）至10（完整未降解）之間[12]，樣本RNA 的RIN 值大于7 時(shí)可認(rèn)為完整性較好。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 不同預(yù)處理方法對(duì)血液樣本RNA 質(zhì)量的影響

對(duì)不同預(yù)處理方法處理的血樣抽提RNA 后，測(cè)量RNA 純度、RIN 值、RNA 濃度和RNA 產(chǎn)量見表1。各預(yù)處理組使用2100 生物分析儀得到凝膠電泳圖譜（圖1）。

圖1 外周血樣本8 種預(yù)處理方法的電泳圖譜Fig.1 Electrophoretogram of peripheral blood samples from 8 pretreatment methods

對(duì)各組樣本所得的RNA 純度進(jìn)行分析，首先根據(jù)預(yù)處理方法將樣本分為8 組進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，部分預(yù)處理方法之間RNA 純度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。白細(xì)胞加RNAlaterTM法和直接凍存法的RNA純度低于1.8，PAXgene 全血RNA 管法的RNA 純度略高于2.0，其余5 組純度較好且組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

對(duì)各組RIN 值進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，部分預(yù)處理方法之間RIN 值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示，除直接凍存法外，其余預(yù)處理方法RIN 值均大于7，可滿足高通量測(cè)序等實(shí)驗(yàn)對(duì)樣本的要求，僅外周血加DNA/RNA ShieldTM法和血細(xì)胞加DNA/RNA ShieldTM法與PAXgene 全血RNA 管法相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義，其余方法與PAXgene 全血RNA 管法相比，RIN 值均較差且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

對(duì)不同預(yù)處理方法所得的RNA 產(chǎn)量進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，部分預(yù)處理方法之間RNA 產(chǎn)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示，外周血加TRIzolTM法、白細(xì)胞加RNAlaterTM法和直接凍存法與其余5 組相比產(chǎn)量較低，其中直接凍存法的產(chǎn)量與其余5 組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），白細(xì)胞加RNAlaterTM法產(chǎn)量明顯低于白細(xì)胞加TRIzolTM法（P＜0.05）。

對(duì)于每一種預(yù)處理方法而言，同一預(yù)處理方法的不同樣本在RNA 純度、RIN 值以及RNA 產(chǎn)量之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果不受樣本因素影響。

2.2 儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)對(duì)血液樣本RNA 質(zhì)量的影響

不同儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)下RNA 純度、RIN 值、RNA 濃度和RNA 產(chǎn)量見表2。

表2 外周血樣本不同儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)提取總RNA 純度、完整性、質(zhì)量濃度和產(chǎn)量的比較Tab.2 Comparison of purity，integrity，mass concentration and yield of total RNA of peripheral blood samples extracted at different storage times

對(duì)不同儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)樣本所得RNA 的純度進(jìn)行分析，單因素方差分析結(jié)果顯示，RNA 純度不受儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)的影響（P＞0.05）。各組純度均在1.8～2.0 范圍內(nèi)，可認(rèn)為樣本RNA 純度較好。

對(duì)不同儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)樣本所得RIN 值進(jìn)行分析，單因素方差分析結(jié)果顯示，RIN 值受儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)的影響（P＜0.05）。與直接進(jìn)行RNA 抽提的樣本（儲(chǔ)存0 d）相比，儲(chǔ)存10 d 及以上的樣本RIN 值均有明顯降低且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

對(duì)不同儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)樣本所得RNA 產(chǎn)量進(jìn)行分析，單因素方差分析結(jié)果顯示，RNA 產(chǎn)量受儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)的影響（P＜0.05）。隨著儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)的增加，樣本RNA 的產(chǎn)量逐漸減少，與儲(chǔ)存0 d 樣本相比，儲(chǔ)存5 d 起樣本RNA 產(chǎn)量下降明顯且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

此外，樣本之間在相同的儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)下RNA 純度、RIN 值以及RNA 產(chǎn)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果不受樣本因素影響。

3 討論

外周血樣本不僅是法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中常見的一種檢材，也是科學(xué)研究中常用的樣本類型。一般情況下，因研究條件的限制，需要在外地或偏遠(yuǎn)地區(qū)采集外周血，采集現(xiàn)場(chǎng)條件各不相同且多數(shù)無(wú)法達(dá)到實(shí)驗(yàn)室條件，后續(xù)運(yùn)輸條件等不穩(wěn)定因素都會(huì)對(duì)外周血中RNA的質(zhì)量造成影響。離體后的外周血隨時(shí)間的推移，血中的各種成分受到血細(xì)胞代謝、廣泛存在的內(nèi)源性RNase 等諸多因素影響，RNA 易發(fā)生降解，提取到的RNA 數(shù)量和質(zhì)量較差，難以滿足諸如高通量測(cè)序等后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求[13]，使得從外周血中提取高質(zhì)量RNA成為一個(gè)很大的挑戰(zhàn)。

本研究選取8 種外周血樣本預(yù)處理方法及6 個(gè)儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)，統(tǒng)一儲(chǔ)存在-80 ℃條件下，采用試劑盒抽提的方法對(duì)樣本進(jìn)行抽提，對(duì)總RNA 進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)（濃度、純度和完整性）并比較分析，從而選出最優(yōu)的處理方法和適宜的儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)范圍。

3.1 預(yù)處理方法

在非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下采集樣本后，直接凍存外周血是目前最普遍的樣本處理方法，由于該方法沒(méi)有使用任何具有穩(wěn)定成分的添加劑，可作為對(duì)照組排除儲(chǔ)存期間穩(wěn)定劑的毒性或可能干擾實(shí)驗(yàn)的其他因素。LIU等[5]對(duì)血液樣本采取6 種預(yù)處理方法，并使用TRIzol法和PAXgene 試劑盒提取法進(jìn)行抽提，結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)處理的樣本完整性好于未經(jīng)處理的樣本。因此，本研究選取了8 種樣本預(yù)處理方法，以確定何種方法能達(dá)到提高樣本中RNA 質(zhì)量的效果。

通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)樣本在凍存前進(jìn)行預(yù)處理可有效提高RNA 質(zhì)量。除白細(xì)胞加RNAlaterTM法和直接凍存法的RNA 純度較低，PAXgene 全血RNA 管法RNA 純度均值略高于2.0 外，其余5 組RNA 純度較好，均在1.8～2.0。PAXgene 全血RNA 管法RIN 值最高，樣本RNA 片段幾乎未發(fā)生降解；直接凍存法RIN 值最低且低于7.0，樣本RNA 發(fā)生了部分降解；其余各組RIN 值均高于8.0。血細(xì)胞加DNA/RNA ShieldTM法RNA 產(chǎn)量最高，其次為外周血加DNA/RNA ShieldTM法。在對(duì)整體結(jié)果進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞添加TRIzolTM和RNAlaterTM保存液的RNA 質(zhì)量要優(yōu)于外周血添加TRIzolTM和RNAlaterTM保存液。白細(xì)胞添加TRIzolTM保存液的樣本在RNA純度、RIN 值和產(chǎn)量3 個(gè)方面均優(yōu)于白細(xì)胞添加RNAlaterTM保存液的樣本，且在RNA 產(chǎn)量上差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與LIU 等[5]對(duì)外周血預(yù)處理方法研究中部分相同方法所得結(jié)果一致。經(jīng)過(guò)上述比較分析，外周血加DNA/RNA ShieldTM、血細(xì)胞加DNA/RNA ShieldTM、白細(xì)胞加TRIzolTM和PAXgene 全血RNA 管4 種方法在純度、RIN 值和產(chǎn)量方面均較好。相比其余3 種方法，PAXgene 全血RNA 管的成本較高，不適用于大規(guī)模的樣本采集，同時(shí)在采集后需至少2 d 時(shí)間才能夠低溫運(yùn)輸，其余3種方法中，外周血加DNA/RNA ShieldTM法相對(duì)操作步驟最少，能最大限度減少外源性污染，由于抽提試劑盒內(nèi)含有DNA/RNA ShieldTM，無(wú)須單獨(dú)購(gòu)買，添加DNA/RNA ShieldTM保存的樣本抽提出DNA 的RIN 值均高于其余兩種方法。

3.2 儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)

外地采集的外周血樣本經(jīng)過(guò)處理并低溫運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理的過(guò)程中，無(wú)法確定樣本的儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)。目前有關(guān)保存時(shí)間的研究[11，14]儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)設(shè)為0 d（立即抽提）至10 d，結(jié)果表明，隨著儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)的增加，RNA 逐漸發(fā)生降解且與立即抽提得到的RNA 相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，本研究選取了6 個(gè)儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)（0、5、10、15、30 和60 d）從產(chǎn)量、純度和RIN 值3 個(gè)方面對(duì)樣本儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)對(duì)RNA 質(zhì)量的影響進(jìn)行了評(píng)估。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)對(duì)RNA 純度無(wú)明顯影響，純度保持在1.815～1.952。隨著儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)的增加，RNA 濃度、產(chǎn)量及RIN 值均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中RNA 產(chǎn)量除在10 d 與15 d、30 d 與60 d的比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，儲(chǔ)存60 d 樣本的RNA 產(chǎn)量已無(wú)法滿足RNA 測(cè)序等實(shí)驗(yàn)要求。而RIN 值在10 d 起出現(xiàn)下降，除30 d 與60 d 比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，在儲(chǔ)存10 d及以上的各組間RIN 值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，到儲(chǔ)存60 d 時(shí)RIN 值已降至RNA 測(cè)序等實(shí)驗(yàn)要求的最低值[12]。本研究部分結(jié)果與何松哲等[10]、洪恩宇等[11]關(guān)于儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)對(duì)RNA 質(zhì)量影響的結(jié)果基本一致。

本研究對(duì)RNA 純度是否受儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)的影響與何松哲等[10]研究結(jié)果不同，考慮可能是隨著儲(chǔ)存時(shí)長(zhǎng)的增加，紅細(xì)胞裂解以及血中大量?jī)?nèi)源性RNase 的釋放，外周血中蛋白大量增加，從而改變了RNA 純度。而本研究對(duì)外周血樣本中添加了DNA/RNA ShieldTM保存液，對(duì)外周血中的RNA 起到了保護(hù)作用，減小了RNA 質(zhì)量的降低。因此，本研究?jī)?chǔ)存10 d 的樣本在RNA 濃度和RIN 值上要明顯優(yōu)于其他研究[11]儲(chǔ)存7 d的樣本RNA 質(zhì)量。

3.3 結(jié)論

對(duì)外地采集或無(wú)法立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的外周血樣本進(jìn)行冷凍前預(yù)處理，可確保能夠獲得大量高質(zhì)量RNA，從而保證轉(zhuǎn)錄組分析等檢測(cè)技術(shù)的成功。本研究結(jié)果顯示，外周血加DNA/RNA ShieldTM保存液的方法是樣本最佳預(yù)處理方法，經(jīng)過(guò)該方法預(yù)處理的樣本在低溫條件下最多可存放60 d，其質(zhì)量也可滿足高通量測(cè)序等下游實(shí)驗(yàn)的要求?？偠灾?，對(duì)需要一定時(shí)間保存的樣本進(jìn)行預(yù)處理是一種能有效保障RNA質(zhì)量的方法，可應(yīng)用于RNA 抽提前的外周血樣本保存。