楊萬娟， 徐杰

昆明醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院牙周病科，云南 昆明（650106）

常見的牙周炎有慢性牙周炎（chronic periodon?titis，CP）和侵襲性牙周炎（aggressive periodontitis，AgP）等。當CP 發(fā)展至重度慢性牙周炎（severe chronic periodontitis，SCP）時，牙周支持組織破壞嚴重，并伴有多種并發(fā)癥；廣泛型侵襲性牙周炎（gen?eralized aggressive periodontitis，GAgP）患者由于病程進展快，就診時通常也存在嚴重的牙周支持組織破壞，伴多種并發(fā)癥；臨床表現(xiàn)的相似性使SCP和GAgP 在鑒別診斷方面存在一定的局限性。

牙周炎是感染性疾病，隨著牙周炎的進展，齦下菌群的多樣性也會增加［1?2］。因此菌斑生物膜中相關微生物的檢測是研究病因學的重要手段［3］。常見的牙周微生物檢測技術包括細菌培養(yǎng)法、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）及DNA 探針等技術。它們能對牙周致病菌進行定性及定量研究，但是能一次性同時檢測的細菌數(shù)量有限，在菌群研究方面存在局限性。

近年來，研究者將高通量測序（high?throughput sequencing，HTS）技術用于牙周炎相關微生物的研究，并取得了一定的進展。該技術能夠進行大規(guī)模并行測序，具有高通量、高效率和高準確度的優(yōu)勢，能夠對牙周微生物群落的組成、多樣性、菌群關系及群落功能等多方面信息展開研究［4］。因此本研究選擇以GAgP 與SCP 患者為研究對象，利用HTS 檢測上述兩種疾病齦下菌群的組成和多樣性等信息，并觀察基礎治療前后兩者齦下菌群的變化。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2018 年9 月至2019 年5 月在昆明醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院牙周病科就診的11 例GAgP 患者和14 例SCP 患者。其中GAgP 患者年齡21～32 歲，平均（26.16 ± 4.40）歲，男性4 例，女性7 例；SCP 患者年齡36～64 歲，平均（44.36 ± 8.51）歲，男性8例，女性6 例。診斷標準嚴格按照1999 年牙周病分類國際研討會所制定的標準。所有患者試驗前均簽署知情同意書。納入標準如下：①GAgP 患者年齡不超過35 歲，全口至少有6 顆取樣患牙，探診深度（probing depth，PD）≥ 6 mm，臨床附著喪失（clinical attachment loss，CAL）≥5 mm，X 線片顯示有鄰面牙槽骨吸收，無明顯的咬合關系異常，未接受正畸治療；②SCP 患者年齡35 歲以上，全口至少有6 顆取樣患牙，PD ≥6 mm，CAL ≥5 mm，牙槽骨吸收超過根長的1/2；③半年內未進行過任何牙周治療；④3 個月內未使用過抗生素或非甾體類抗炎藥；⑤至少有20 顆天然牙，且每個象限都余留有天然牙；⑥同意參加此項研究。排除標準如下：①妊娠及哺乳期婦女；②患有糖尿病、心血管疾病和血液性疾病等系統(tǒng)性疾病者；③吸煙者。

1.2 牙周檢查及治療

記錄納入病例PD、CAL 和探診出血等指標，進行牙周基礎治療，包括齦上潔治、齦下刮治、根面平整和口腔衛(wèi)生指導。牙周基礎治療的方法：使用瑞士EMS 牙周治療儀進行齦上潔治，齦下刮治、根面平整及拋光，同時進行口腔衛(wèi)生指導，1 周后復診再次清理殘余牙石。齦上潔治效果是肉眼看不到牙石和色素，齦下刮治及根面平整效果是探診根面光滑平整，無殘余牙石。

1.3 樣本采集及基因組DNA 提取

在基線及牙周基礎治療后第6 周分別采集齦下菌斑，兩次采集位點相同，共采集50 個樣本。GAgP 基線時樣本記為QA 組，牙周治療后第6 周樣本記為QB 組；SCP 基線時樣本記為MA 組，基礎治療后第6 周樣本記為MB 組。將患者口腔分為6 個區(qū)段，采集每個區(qū)段內PD 最深位點的齦下菌斑。去除齦上菌斑，Gracey 刮治器采集齦下菌斑，并將6 個位點的集合菌斑迅速置入1 個裝有750 μl 滅菌TE 緩沖液的1.5 ml EP 管，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用微量樣品基因組DNA 提取試劑盒（天根公司，中國）提取齦下菌斑樣本中的基因組DNA，并用超微量紫外分光光度計測定DNA 純度和濃度。

1.4 樣本前處理及高通量測序

使 用 引 物515f 和806r 擴 增16s rDNA 的V4 高變 區(qū)。第 一 輪PCR 反 應 體 系：2 × High?Fidelity Master Mix 12.5 μL、PE1?515f（10 μM）0.25 μL、PE2?806r（10 μM）0.25 μL、Template DNA 3 μL、ddH2O 25 μL；循環(huán)條件：94 ℃預變性3 min；15 個循環(huán)（94 ℃，45 s；50 ℃，30 s；72 ℃，30 s）；72 ℃延伸5 min。第 二 輪PCR 反 應 體 系：PE1.0?L（100 μM）0.15 μL、index primer（10 μM）1.5 μL；循環(huán)條件：98 ℃預變性1 min；15 個循環(huán)（98 ℃，10 s；56 ℃，20 s；72℃，20 s）；72 ℃延伸5 min 。PCR 產(chǎn)物進行1%瓊脂糖電泳，150 V、100 mA 電泳觀察20 min，切割目的條帶并純化，BioTek 酶標儀定量，Illumina MiSeq 平臺進行高通量測序。

1.5 生物信息學分析

利 用QIIME（quantitative insights in microbial ecology）、Mothur 以及SPSS（26.0 版本）等軟件對原始數(shù)據(jù)去雜得到優(yōu)化序列，根據(jù)97%相似度對優(yōu)化序列進行可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類，選擇每個OTU 中豐度最高的序列作為OTU 的代表序列，將OTU 代表序列與物種分類數(shù)據(jù)庫作比對，注釋樣品中的物種信息，繪制相對豐度柱狀圖和熱圖；計算菌群豐度指數(shù)以及菌群多樣性指數(shù)（Shahnon、Simpson 指數(shù)），繪制稀釋曲線，通過t檢驗、non?parametric factorial Kruskal?Wallis sum?rank 檢驗及皮爾遜系數(shù)函數(shù)對群落進行α 多樣性分析與β 多樣性分析，繪制主坐標分析（principal coordinates analysis，PCoA）圖；進行LEfSe差異分析（linear discriminant analysis effect size）、Network 網(wǎng)絡分析以及使用KEGG PATHWAY 數(shù)據(jù)庫（https：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html）對群落功能進行預測。檢驗水平為雙側α＝0.05。

2 結 果

2.1 齦下菌斑菌群相對豐度

本次測序50 個樣本共獲得19 580 817 條原始序列，經(jīng)過濾最終獲得19 302 060 條高質量序列，按97%相似度進行聚類得到2 364 個OTU，與數(shù)據(jù)庫比對注釋到19 門，38 綱，64 目，112 科，209 屬，125 種。門、屬和種三個水平的優(yōu)勢菌在各組中的相對豐度見圖1。屬水平的相對豐度熱圖見圖2，其中卟啉單胞菌屬和密螺旋體屬等主要分布于GAgP 和SCP 基線樣本中，放線菌屬和羅氏菌屬等主要分布在GAgP 和SCP 治療后第6 周的樣本中。

2.2 α 多樣性分析

基線時GAgP 和SCP 的Shannon 指數(shù)和Simpson指數(shù)無統(tǒng)計學差異（P＞0.05，表1）；治療后第6 周，兩者的Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)均降低，其中SCP 的Shannon 指數(shù)降低有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表2）。隨著測序深度增加，當序列數(shù)超過50 000 時，說明此次測序量已經(jīng)足夠覆蓋所有菌種（圖3）。

2.3 β 多樣性分析

如圖4 所示，QA 組和MA 組距離近，說明基線時GAgP 和SCP 齦下菌群相似；QB 組和MB 組距離接近，但與QA 組和MA 組分開，說明治療后第6 周GAgP 和SCP 齦下菌群相似，但與基線不同。與QA組和MA 組內各樣本間距離相比，QB 組和MB 組內各樣本間距離稍分散，說明治療后第6 周齦下菌群變化因個體差異稍有不同。

Figure 2 Relative abundance heatmap in genus level in GAgP group and SCP group before and after treatment圖2 GAgP 組與SCP 組治療前后屬水平相對豐度熱圖

表1 GAgP 和SCP 基線時α 多樣性指數(shù)Table 1 The α diversity index of GAgP and SCP at baseline

表2 GAgP 和SCP 基礎治療前后α 多樣性指數(shù)Table 2 The α diversity index of GAgP and SCP before and after initial therapy

2.4 LEfSe 差異分析

LEfSe 分析用于尋找各組間具有統(tǒng)計學差異的生物標志物，如圖5，在門、綱和目水平，放線菌在GAgP 治療后第6 周增加，且線性判別分析分值（LDA score）大于5，說明放線菌是GAgP 治療后顯著增加的細菌。

2.5 Network 網(wǎng)絡分析

網(wǎng)絡圖可以研究細菌與細菌之間的關系，網(wǎng)絡中兩個圖標距離越近，說明它們越相關。如圖6，本實驗共發(fā)現(xiàn)10 個緊密聯(lián)系的細菌關系網(wǎng)絡，小桿菌屬、產(chǎn)線菌屬及密螺旋體屬等33 個菌屬構成最大的關系網(wǎng)絡，二氧化碳噬纖維菌屬、鏈球菌屬及金氏菌屬等19 個菌屬構成第二大關系網(wǎng)絡，這兩大關系網(wǎng)絡均有鏈球菌屬參與。

2.6 群落功能預測

Figure 3 Rarefaction curve圖3 稀釋曲線

本次測序通過KEGG PATHWAY 數(shù)據(jù)庫（https：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html）對群落功能進行預測，未發(fā)現(xiàn)GAgP 和SCP 齦下菌群間存在顯著差異的群落功能，差異主要體現(xiàn)在GAgP 和SCP治療前后，GAgP 預測到62 種功能在治療后第6 周發(fā)生改變（P＜0.05），SCP 預測到38 種群落功能在治療后第6 周發(fā)生改變（P＜0.05）；其中與氨基酸代謝、甲烷代謝和肽酶等相關的功能降低（群落功能預測圖見本文OSID 碼）。

3 討 論

3.1 齦下菌群的組成和結構分析

基線時，GAgP 和SCP 的優(yōu)勢菌在門、屬和種水平均無明顯差異。優(yōu)勢菌門和優(yōu)勢菌屬與Han等［5］和Tsai 等［6］的研究一致，包括擬桿菌門、梭桿菌門和卟啉單胞菌屬等。優(yōu)勢菌種包括牙髓卟啉單胞菌、直腸彎曲菌和索氏密螺旋體等，未檢出牙齦卟啉單胞菌和齒垢密螺旋體等常見的代表菌種，此結果與Szafranski 等［7］的研究結果不完全相同，分析這一現(xiàn)象與測序選擇擴增的16s rDNA 高變區(qū)不同有關。Szafranski 等［7］擴增的是V1?V2 和V5?V6 高變區(qū)，結果可檢測到牙齦卟啉單胞菌和齒垢密螺旋體等常見的牙周致病菌，本實驗擴增的是V4 高變區(qū)，故檢出的是大量的牙髓卟啉單胞菌。該結果說明齦下菌群組成結構復雜多樣，除了常見的牙周致病菌外，還有許多其他細菌發(fā)揮著重要作用，而HTS 有助于發(fā)現(xiàn)更多的菌群。16s rDNA 高變區(qū)的選擇還與測序平臺有關，本實驗使用的Illumina MiSeq 平臺測序成本相對較低，測序深度也較深［8］，V3～V4 區(qū)是該平臺經(jīng)常選擇的區(qū)域，故產(chǎn)生上述差異。治療后第6 周，GAgP 和SCP齦下菌群變化趨勢相似，擬桿菌門和卟啉單胞菌屬等相對豐度降低，放線菌門和鏈球菌屬等相對豐度增加，與之前的研究結果相同。

LEfSe 分析強調統(tǒng)計學意義和生物相關性，能夠在組與組之間尋找具有統(tǒng)計學差異的生物標志物［9］。Szafranski 等［7］通過LEfSe 分析發(fā)現(xiàn)牙周炎患者與牙周健康者的生物標志物不同。本實驗未發(fā)現(xiàn)GAgP 和SCP 間存在差異性生物標志物，而在GAgP 患者治療后第6 周的齦下菌群中發(fā)現(xiàn)，放線菌在門、綱、目水平顯著增加。放線菌是牙周健康者富集的細菌［6］，本次結果提示可將其作為判斷GAgP 患者預后的潛在微生物標志物。AgP 常與伴放線聚集桿菌（Actinobacillus actinomycetemcomi?tans，Aa）存在高度相關。本實驗未發(fā)現(xiàn)Aa，與Schulz 等［2］的結果一致，分析原因如下：①不同的地區(qū)人種會影響Aa的檢出率，非洲及中東等地區(qū)的AgP 患者中Aa檢出率較亞洲等地高［10］，Aa中毒性較高的JP2 基因型也多分布在非洲等地［11］，本實驗的研究對象均為亞洲人，故未檢測到Aa；②Aa的定植常發(fā)生在青少年時期，且多導致典型的局限型侵襲性牙周炎［10］，本實驗的研究對象是平均年齡（26.18 ± 4.40）歲的GAgP 患者，多處于晚期重度，也可能影響Aa的檢出。

3.2 群落多樣性分析

本實驗中，GAgP 與SCP 基線時α 多樣性指數(shù)無統(tǒng)計學差異，基礎治療后第6 周，Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)降低，說明基礎治療可以降低齦下菌群的多樣性，Campisciano 等［12］的研究也說明非手術治療后齦下菌群的α 多樣性降低。本實驗β 多樣性分析顯示基線時GAgP 和SCP 齦下菌群的組成結構相似，但治療后第6 周菌群變化存在個體差異，與Schwarzberg 等［13］的結果相似?；A治療后牙周袋變淺，此時的齦下菌群更易受口腔衛(wèi)生和飲食等個體因素的影響；Chen 等［14］通過評估口腔微生物群落遷移的生態(tài)過程發(fā)現(xiàn)，個體內微生物群落的均質化擴散作用比個體間明顯，這一作用導致個體內不同位點的菌群更加相似，而個體間的菌群存在差異。群落多樣性分析提示齦下菌斑控制的重要性，齦下菌斑生物膜是有序排列的建筑式樣結構，多樣性高在一定程度上意味著齦下菌群間聯(lián)系緊密，豐富度越高，微生態(tài)系統(tǒng)更穩(wěn)定。因此充分去除生物膜有利于牙周健康，尤其對于牙周炎患者來說，預防齦上菌斑的堆積可以延緩齦下菌斑生物膜的重新定植［15］，這也是牙周維護治療的重要意義。

Figure 5 LEfSe analysis of the changes of subgingival microbiota in GAgP group before and after treatment圖5 GAgP 組治療前后菌群變化的LEfSe 差異分析

3.3 齦下菌群相關性分析

本實驗通過Network 網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)10 個相互聯(lián)系的細菌網(wǎng)絡，其中最大的關系網(wǎng)絡包括小桿菌屬、產(chǎn)線菌屬及密螺旋體屬等33 種菌屬，它們大多是與牙周炎相關的菌屬，與Chen 等［14］的研究結果相同；第二大關系網(wǎng)絡包括二氧化碳噬纖維菌屬、鏈球菌屬及金氏菌屬等19 種菌屬，它們大多是與牙周健康相關的菌屬。在上述兩大關系網(wǎng)絡中，鏈球菌屬均有參與，提示鏈球菌屬在齦下菌群由健康向失調轉變的過程中可能發(fā)揮著重要作用。

Figure 6 Network analysis of genus level correlation圖6 屬水平物種相關性網(wǎng)絡分析

在健康人口腔中，鏈球菌是正常菌群，它與多種菌群密切聯(lián)系并維持口腔菌群的穩(wěn)定［16］。在菌斑生物膜形成的過程中，鏈球菌是早期定植者，它可以通過黏附素?受體作用機制直接黏附定植到獲得性薄膜上，為其他細菌提供新的結合位點［17］，從而介導其他口腔細菌的定植，最終形成復雜穩(wěn)定的生物膜群落。在細菌定植的過程中，齦下菌群經(jīng)歷了三個階段的演變：健康菌群階段、健康菌群和牙周炎相關菌群組成的多樣化菌群階段、以牙周致病菌為主的菌群階段，這一演變過程提示及時阻斷由早期定植者介導的菌群演變的重要性。然而口腔是一個有菌環(huán)境，鏈球菌作為口腔正常菌群的一員，在維護口腔健康方面發(fā)揮著重要作用，正確的治療理念是維持菌群平衡，因此對患者進行口腔衛(wèi)生指導顯得尤為重要。每日進行有效的菌斑控制，能夠在菌斑生物膜形成早期將其清除，避免菌群演變導致菌群失調而引發(fā)牙周炎，對牙周炎的預防和療效維護有重要意義。

除了上述最大的兩個關系網(wǎng)絡外，本實驗還發(fā)現(xiàn)了分別以出芽菌屬、沙雷氏菌屬、微桿菌屬、Anaerococcus、Nicoletella、甲烷短桿菌、巴拿馬草屬及Dermacoccus為代表的8 個關系網(wǎng)絡，其中與牙周炎相關的致病菌聚集桿菌屬和巴氏桿菌屬、Ni?coletella及Bibersteinia相互聯(lián)系，但關于這些菌屬之間的具體關系以及它們與牙周炎的關系暫未有相關研究報道，有待進一步的研究?；诰鷮匍g相關性的網(wǎng)絡分析可以在復雜的齦下菌群中盡可能發(fā)現(xiàn)更多相互聯(lián)系的菌屬，雖然不能明確具體的關系是協(xié)同或者拮抗，但能為今后驗證細菌之間具體的相互作用提供方向。

3.4 群落功能預測

HTS 不僅能分析菌群的組成和結構，還可以進行群落功能預測，了解群落中細菌的代謝功能有助于理解菌群的致病機制［18］。本實驗未發(fā)現(xiàn)基線時GAgP 和SCP 的齦下菌群間存在顯著差異的群落功能，但牙周基礎治療后第6 周，GAgP 的齦下菌群中預測到62 種功能發(fā)生改變，SCP 的齦下菌群中預測到38 種功能發(fā)生改變，其中與氨基酸代謝、甲烷代謝和肽酶等相關的功能降低，表明此時齦下菌群中的代謝活動受到影響，這可能與牙周基礎治療后齦下菌群的豐富度和多樣性降低有關。牙周基礎治療可以擾亂齦下微生態(tài)系統(tǒng)，齦下菌群的新陳代謝活動會受到干擾。Kirst 等［19］通過測序發(fā)現(xiàn)CP 患者的齦下菌群中與能量代謝、甲烷代謝和肽酶等相關的功能比牙周健康者更為豐富，而本實驗發(fā)現(xiàn)牙周基礎治療后上述功能降低，間接說明能量代謝、甲烷代謝和肽酶等細菌代謝功能與牙周炎有關。雖然具體作用機制不明確，但HTS可以同時對齦下菌群中的多種代謝功能進行預測，在此基礎上篩選出關鍵功能，對今后的針對性研究具有一定的意義。

4 小 結

綜上所述，本研究通過HTS 分析了GAgP 和SCP 患者齦下菌群的組成、多樣性、菌群關系及群落功能等信息，并觀察了牙周基礎治療前后的菌群變化，結果顯示GAgP 和SCP 的齦下菌群相似，牙周基礎治療可以改變齦下菌群組成和結構，降低群落多樣性，降低氨基酸代謝、甲烷代謝和肽酶等群落功能。鏈球菌屬在齦下菌群由健康向失調轉變的過程中可能發(fā)揮著重要作用。不足之處：本實驗只觀察了牙周基礎治療后第6 周齦下菌群的變化，未進行遠期效果的觀察，今后應延長追蹤時間，觀察遠期效果；在進行高通量測序時，本實驗只選擇了16s rDNA 的一個高變區(qū)進行擴增，在細菌種水平上的鑒定不夠完善，在今后的實驗中應在測序平臺讀長允許的條件下選擇多個高變區(qū)組合進行測序。

【Author contributions】Yang WJ performed the experiments, ana?lyzed the data and wrote the article. Xu J designed the study. All au?thors read and approved the final manuscript as submitted.