方 濤 閆 京 張 明 趙加力 潘 偉 王新宏 周 全

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬淮安醫(yī)院骨科，江蘇省淮安市 223002，電子郵箱：wuque197928@163.com)

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號(hào)通路在惡性腫瘤中被激活，可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和化療耐藥[1]。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)mTOR信號(hào)通路在人骨肉瘤組織中被激活，且該通路患者的生存期、骨肉瘤對術(shù)前化療藥物的反應(yīng)等密切相關(guān)[2]。近年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)mTOR在腫瘤干細(xì)胞的干性維持中發(fā)揮作用[3]，但其在骨肉瘤干細(xì)胞的干性維持中的具體作用尚不清楚。雷帕霉素是mTOR信號(hào)通路的特異性抑制劑，本研究旨在探討mTOR在骨肉瘤干細(xì)胞中的表達(dá)，以及雷帕霉素對骨肉瘤干細(xì)胞增殖和干性維持的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及主要試劑、儀器 人骨肉瘤U2OS細(xì)胞購自上海佰曄生物科技公司；雷帕霉素膠囊購自華北制藥股份有限公司(批號(hào)：181001；規(guī)格：1 mg/粒)；兔抗人CD133多克隆抗體(批號(hào)：10180423)、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(octamer-binding transcription factor 4,Oct4)抗體(批號(hào)：0920108)和SRY盒轉(zhuǎn)錄因子2(SRY-box transcription factor 2，Sox2)抗體(批號(hào)：1804227)均購自美國Santa Cruz公司；RIPA裂解液購自武漢博士德公司(批號(hào)：180101)；FC型酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher公司；Isolex 300i細(xì)胞分選儀購自Nexell公司；LabWorksTM凝膠成像及分析系統(tǒng)購自美國UVP公司。四甲基偶氮唑藍(lán)比色法試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：1603211)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)：將U2OS細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基放置于37℃、5 % CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2 d更換培養(yǎng)基一次。當(dāng)細(xì)胞生長到覆蓋瓶底壁80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，傳代后繼續(xù)放置于培養(yǎng)箱中。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 免疫磁珠法分離CD133+U2OS細(xì)胞：取對數(shù)生長期的U2OS骨肉瘤細(xì)胞，4℃下1 200 r/min離心4 min，棄去上清液，以3 mL含2%胎牛血清的磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)重懸細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)1×108個(gè)細(xì)胞，加入FcR阻斷試劑(Miltenyi公司，批號(hào)：130090482)和CD133磁珠試劑(Miltenyi公司，批號(hào)：130090482)，4℃孵育30 min，MACS(Miltenyi公司，批號(hào)：130042201)磁性分選柱分離CD133+細(xì)胞和CD133-細(xì)胞。

1.2.3 四甲基偶氮唑藍(lán)比色法檢測CD133+U2OS細(xì)胞的增殖抑制情況：按照文獻(xiàn)[4]中的方法，取對數(shù)生長期的CD133+U2OS細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/mL，接種于96孔板，每孔100 μL，分為預(yù)對照組、低劑量雷帕霉素組和高劑量雷帕霉素組，分別加入含0 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL雷帕霉素的杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)2.5 mL于37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加四甲基偶氮唑藍(lán)溶液(5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，加入150 μL二甲基亞砜,震蕩10 min，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測490 nm波長下的吸光度值。計(jì)算CD133+U2OS細(xì)胞的增殖抑制率(%)=(對照組吸光度值-實(shí)驗(yàn)組吸光度值)/對照組吸光度值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.4 蛋白免疫印跡法檢測mTOR、p-mTOR和干性標(biāo)志蛋白的表達(dá)：取對數(shù)生長期的CD133+U2OS細(xì)胞，分為對照組和雷帕霉素組。對照組使用不含雷帕霉素的杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)20 mL，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，雷帕霉素組使用含適宜劑量雷帕霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，將細(xì)胞用4℃的PBS洗滌2次，置于冰上，加入中等強(qiáng)度的RIPA裂解液裂解細(xì)胞，4℃、13 000 r/min離心5 min，取上清。采用二喹啉甲酸法(試劑購自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：1804062)進(jìn)行細(xì)胞總蛋白濃度測定，制備電泳凝膠，上樣后進(jìn)行電泳分離蛋白。電泳完畢后轉(zhuǎn)膜1 h，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入按1 ∶400稀釋的mTOR(Santa Cruz，批號(hào)：1311426)、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mTOR，p-mTOR;Santa Cruz，批號(hào)：1602443)、Sox2、Oct4一抗及甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體(以GAPDH作為內(nèi)參；Santa Cruz，批號(hào)：1501226)，37℃孵育2 h，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(江蘇凱基生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：1810215；1 ∶300)，37℃孵育1 h。通過化學(xué)發(fā)光試劑盒 (江蘇凱基生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：1903114)顯影，采用凝膠成像系統(tǒng)對膠片進(jìn)行掃描與數(shù)據(jù)采集，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，重復(fù)測量資料的比較采用重復(fù)測量方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 雷帕霉素對CD133+U2OS細(xì)胞的增殖抑制作用 預(yù)對照組CD133+U2OS細(xì)胞的增殖抑制率均為0。低劑量雷帕霉素組和高劑量雷帕霉素組CD133+U2OS細(xì)胞的增殖抑制率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=42.761，P組間<0.001)，兩組細(xì)胞的增殖抑制率均有隨時(shí)間變化的趨勢(F時(shí)間=4 988.486，P時(shí)間<0.001)，分組與時(shí)間有交互效應(yīng)(F交互=13.684，P交互=0.004)。其中，兩組干預(yù)48 h后的細(xì)胞增殖抑制率均較干預(yù)24 h增高(均P<0.05)，而干預(yù)72 h后與干預(yù)48 h后的增殖抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；高劑量雷帕霉素組干預(yù)24 h、48 h和72 h后的增殖抑制率均高于低劑量雷帕霉素組。見表1。因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中我們選擇了采用高劑量的雷帕霉素干預(yù)48 h(雷帕霉素組)。

表1 兩組CD133+U2OS細(xì)胞的增殖抑制率的比較(x±s，%)

2.2 雷帕霉素對CD133+U2OS細(xì)胞mTOR的表達(dá)及其磷酸化的影響 雷帕霉素組CD133+U2OS細(xì)胞中mTOR和p-mTOR蛋白相對表達(dá)量均低于對照組(均P<0.05)。見圖1和表2。

圖1 兩組CD133+U2OS細(xì)胞中mTOR及p-mTOR的表達(dá)情況

表2 兩組CD133+U2OS細(xì)胞中mTOR和p-mTOR相對表達(dá)量的比較(x±s)

2.3 雷帕霉素對CD133+U2OS細(xì)胞干性標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比，雷帕霉素組細(xì)胞Sox2和Oct4蛋白相對表達(dá)量均下降(均P<0.05)。見圖2和表3。

圖2 兩組CD133+U2OS細(xì)胞中Sox2及Oct4的表達(dá)情況

表3 兩組CD133+U2OS細(xì)胞中干性標(biāo)志蛋白相對表達(dá)量的比較(x±s)

3 討 論

有多項(xiàng)研究顯示腫瘤細(xì)胞的干性維持在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展、化療耐藥等方面具有重要作用[5-7]。腫瘤干細(xì)胞是近年來研究的熱點(diǎn)之一，它具有干細(xì)胞的特點(diǎn)，即自我更新、無限增殖及分化潛能，在啟動(dòng)腫瘤形成和生長中起決定性的作用；同時(shí)，其還具有增強(qiáng)DNA修復(fù)能力、上調(diào)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)水平等作用[8]。以上作用導(dǎo)致骨肉瘤干細(xì)胞在化療中可能通過自我更新、無限增殖等特性逃避化療的毒性作用，引起化療多藥耐藥，導(dǎo)致復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[8]。作為一種能夠無限自我更新且具有一定分化潛能的細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞維持自我更新和多項(xiàng)分化潛能(即干性維持)的機(jī)制非常復(fù)雜，其確切機(jī)制目前仍不清楚。

CD133是多種實(shí)體腫瘤干細(xì)胞共同的表面標(biāo)志物，CD133+腫瘤細(xì)胞較CD133-腫瘤細(xì)胞具有更高的自我更新能力和體內(nèi)成瘤能力[9]。我們在前期的研究中也已發(fā)現(xiàn)CD133+骨肉瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的自我更新、多向分化及體內(nèi)成瘤能力，且其干性標(biāo)志蛋白的表達(dá)更高，具有腫瘤干細(xì)胞的特點(diǎn)[10]。因此，我們分離出CD133+U2OS細(xì)胞進(jìn)行干性維持研究。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)雷帕霉素干預(yù)后，CD133+U2OS細(xì)胞的增殖受到了抑制，同時(shí)細(xì)胞中的干性標(biāo)志蛋白Sox2和Oct4的表達(dá)也下降，提示雷帕霉素不僅可時(shí)間-劑量依賴性地抑制CD133+U2OS細(xì)胞的增殖，還可抑制細(xì)胞的干性維持。

mTOR屬于磷脂酰肌醇3-激酶蛋白激酶類家族成員，能調(diào)控細(xì)胞內(nèi)mRNA的翻譯、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和降解，在細(xì)胞生長和代謝、腫瘤化療耐藥中起重要的作用，阻斷mTOR通路可以起到包括抗骨肉瘤在內(nèi)的廣泛抗腫瘤作用[1]。我們的前期研究的結(jié)果顯示，mTOR/p70S6K信號(hào)通路高表達(dá)的骨肉瘤患者的預(yù)后顯著差于低表達(dá)的骨肉瘤患者，且該信號(hào)通路的高表達(dá)與骨肉瘤的化療耐藥、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等相關(guān)[2]。此外，mTOR信號(hào)通路在骨肉瘤干細(xì)胞中被激活，并調(diào)控骨肉瘤干細(xì)胞的化療耐藥[11]。近年來有研究顯示mTOR通路參與了腫瘤干細(xì)胞的干性維持[3]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)雷帕霉素干預(yù)48 h后，CD133+U2OS細(xì)胞的mTOR和p-mTOR的相對表達(dá)水平較對照組下降，提示雷帕霉素可以有效地抑制CD133+U2OS細(xì)胞中的mTOR信號(hào)通路。由此推測，mTOR可能在CD133+U2OS的干性維持中發(fā)揮重要作用，且這種作用可以通過雷帕霉素進(jìn)行抑制。

綜上所述，雷帕霉素能夠抑制人骨肉瘤CD133+U2OS細(xì)胞的增殖和干性維持，這可能與其下降低mTOR信號(hào)通路活性有關(guān)。