鄧金祥，楊光柱，馬 鈞，鄭麗萍，李 帆，黃文靜*

（1.會澤縣紙廠鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，云南會澤654200；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所，云南昆明650205）

植物組織培養(yǎng)技術(shù)是20世紀(jì)30年代初期利用植物細(xì)胞全能性發(fā)展起來的一項生物技術(shù)，到目前為止，該技術(shù)已經(jīng)在植物生理學(xué)、植物病理學(xué)、作物遺傳育種、生物化學(xué)、植物脫毒苗培育、無性系快速繁殖、種質(zhì)資源低溫保存以及加快育種進程等各個研究領(lǐng)域發(fā)揮著重要的基礎(chǔ)作用，為珍稀瀕危植物的優(yōu)良品種快速繁育、脫病毒、突變篩選、次生代謝產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)、種質(zhì)資源庫建設(shè)和基因庫建立等方面開辟了新途徑，已經(jīng)成為現(xiàn)代生物技術(shù)中重要的基礎(chǔ)技術(shù)和研究手段之一[1-3]。但植物組培期間污染問題一直是國內(nèi)外研究和探討的主要問題之一。

目前植物組織培養(yǎng)過程中常用的消毒劑主要有漂白粉、過氧化氫、酒精、新潔爾滅、次氯酸鈉、升汞、吐溫，但這些消毒劑都具有對植物外植體的毒副作用，對環(huán)境也具有一定危害。本試驗采用不同消毒劑，在消毒時間、培養(yǎng)條件相同的情況下，研究不同消毒劑對蘋果幼嫩葉片的消毒效果的影響，進而誘導(dǎo)蘋果幼嫩葉片獲得高質(zhì)量愈傷組織，為進一步開展育種研究、建立快繁體系等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料取自云南省昆明市云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所實驗基地。選取秋季生長旺盛、健壯、無病蟲害的紅富士幼嫩葉片作為外植體進行消毒效果比較實驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的處理

將幼嫩葉片用洗潔精清洗干凈，流水沖洗5 min。

1.2.2 不同消毒劑及消毒濃度

配 制75%酒 精、10% NaClO2、吐 溫-80、0.1%HgCl2、50 mg·L-1納米銀植物外植體消毒劑備用。

1.2.3 不同消毒劑的處理

在超凈工作臺上，葉片統(tǒng)一用75%酒精消毒30 s，無菌水清洗3遍。試驗設(shè)置3個處理：處理1，10% NaClO2+1滴吐溫-80處理8 min；處理2，0.1%HgCl2處理8 min；處理3，50 mg·L-1納米銀組培專用消毒劑（重慶新位點生物科技有限公司）暗處理8 min[4]。滅菌時手工搖晃，以達到更好的滅菌效果。處理后，無菌水清洗4～5次，第1次清洗1 min。

1.3 培養(yǎng)條件

處理后的葉片用無菌紙吸干多余水分，切割成1 cm2左右小塊，接種于MS+2，4-D 2.5 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1+維生素C 2 g·L-1葉片誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基中，每瓶放置10片，每組10瓶，3次重復(fù)，放置于25℃，光照1000～1200 Lx，光照4 h·d-1。

從培養(yǎng)第2 d起，每隔5 d調(diào)查1次，總共調(diào)查8次。

1.4 統(tǒng)計與分析

采用Excel 2017統(tǒng)計污染率、褐化率、存活率、并按照下式計算：

污染率（%）=（污染數(shù)/接種總數(shù)）×100褐化率（%）=（褐化數(shù)/接種總數(shù)）×100

存活率（%）=[（接種總數(shù)-污染數(shù)-褐化數(shù)）/接種總數(shù)]×100

2 結(jié)果與分析

由表1可知，處理1從葉片培養(yǎng)的第12 d開始，污染率基本保持不變，褐化率、存活率在第22 d開始基本保持穩(wěn)定，葉片開始膨大，形成愈傷組織小細(xì)胞團。處理2污染率在第7 d達到12.5%，后續(xù)保持不變，但褐化率持續(xù)增高，存活率持續(xù)降低，最終只達到11.9%。處理3在葉片培養(yǎng)的第12 d，污染率、褐化率、存活率基本保持穩(wěn)定，葉片邊緣沒有出現(xiàn)愈傷組織小細(xì)胞團。

由表2可知，處理2消毒效果最好，但對幼葉傷害最嚴(yán)重，存活率最低，僅為11.9%；培養(yǎng)第37 d，存活的葉片膨大，周邊出現(xiàn)愈傷組織小細(xì)胞團。處理3消毒效果不理想，污染率為32.5%，褐化率中等，存活率中等，為22.3%；培養(yǎng)第37 d，葉片無膨大，沒有出現(xiàn)愈傷組織小細(xì)胞團。處理1污染率中等，對幼葉傷害最小，褐化率為20.5%，存活率最高達50.7%；培養(yǎng)第37 d，葉片膨大，出現(xiàn)愈傷組織小細(xì)胞團。綜合考慮，污染率、褐化率、存活率、有無愈傷組織細(xì)胞團形成，本實驗最適宜的消毒處理方法為10% NaClO2+1滴吐溫-80消毒8 min。

表1 不同消毒劑處理葉片生長情況

表2 不用消毒劑對蘋果嫩葉消毒效果

3 討論與結(jié)論

木本植物組織培養(yǎng)中較困難的是獲得無菌材料[4]，外植體消毒是否成功，不但關(guān)系到能否獲得無菌材料，也是蘋果組培快繁體系建立的關(guān)鍵之一。研究表明，不同消毒劑對外植體消毒效果不同，考慮到消毒劑對植物外植體的毒害程度、對環(huán)境的影響程度，本實驗采用了已在生物醫(yī)學(xué)方面應(yīng)用廣泛的納米銀消毒劑進行植物外植體消毒，與常用的10% NaClO2+1滴吐溫-80和0.1% HgCl2進行對比，在消毒時間、培養(yǎng)條件相同的情況下，對比了3種消毒劑的消毒效果及愈傷組織誘導(dǎo)情況，發(fā)現(xiàn)0.1% HgCl2消毒效果最好，對葉片損害最小。愈傷組織誘導(dǎo)效果最好的是10% NaClO2+1滴吐溫-80。50 mg·L-1納米銀消毒效果居中，且價格較高，消毒需要在暗環(huán)境下進行操作，且存活的葉片并未誘導(dǎo)出愈傷組織。所以，10%NaClO2+1滴吐溫-80消毒仍然是蘋果葉片誘導(dǎo)愈傷組織較理想的消毒劑。