郭婷婷，欒媛媛，范夢珠，王娟，肖珊珊，陳承余，張少輝,

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海200240；2.浙江輝肽生命健康科技有限公司,浙江溫州325800）

0 引言

近年來，生物活性肽已經(jīng)成為人們耳熟能詳?shù)囊粋€詞語。因其具有很多潛在的生物功能，所以引起人們越來越多的關(guān)注，成為科學(xué)研究的熱點之一[1]。目前很多生物活性肽的有益效果也已經(jīng)得到了很好的證明，如抗癌[2]、降血壓[3-4]、抗菌[5]、降膽固醇[6]、抗糖尿病[7]等等特性。當(dāng)前最權(quán)威的生物活性肽數(shù)據(jù)庫BIOPEP-UMW中已報告了3 000多個不同的生物活性肽。

目前對于生物活性肽的研究多集中于食物衍生多肽，對非食物衍生多肽研究和報道較少。且已經(jīng)有研究結(jié)果證實，與食物衍生的生物活性肽相比，非食物衍生的生物活性肽具有更高的親和力并能有效發(fā)揮其生物活性功能[8]。淋巴細胞是免疫系統(tǒng)的中央調(diào)節(jié)細胞，其大部分功能是由一組被稱為淋巴因子的小分子多肽介導(dǎo)的。這些小分子多肽的表達和分泌均是由于抗原刺激的細胞激活而誘導(dǎo)[9]。所以淋巴細胞是動物機體內(nèi)產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)肽的主要來源。

本文以小鼠脾淋巴細胞為研究對象，從淋巴細胞中分離和鑒定多肽組分，并建立一個“小鼠淋巴細胞多肽數(shù)據(jù)庫”，為后續(xù)淋巴細胞的多肽組學(xué)研究提供參考，為開發(fā)具有免疫調(diào)節(jié)功能的生物活性肽產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：Balb/c小鼠（SPF級，雄性8周齡），上海捷斯捷實驗動物公司；10k超濾管，賽多利斯(上海)貿(mào)易有限公司；尼龍網(wǎng)(100目、200目），深圳達科為生物技術(shù)有限公司；35 mm細胞培養(yǎng)皿，美國Corning公司；6孔細胞培養(yǎng)板，美國Corning公司；血球計數(shù)板，上海康德萊股份有限公司；C18多肽脫鹽柱，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

試劑：小鼠淋巴細胞分離液，深圳達科為生物技術(shù)有限公司；RPMI-1640完全培養(yǎng)液，江蘇凱基生物科技有限公司；RPMI-1640不完全培養(yǎng)液，江蘇凱基生物科技有限公司；臺盼藍染色試劑盒，江蘇凱基生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS），碧云天生物技術(shù)研究所；Hank’s溶液，碧云天生物技術(shù)研究所；小鼠抗體(CD3-FITC、CD19-PE)，美國BD公司；脂多糖（LPS），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；二硫蘇糖醇（DTT），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；碘乙酰胺（IAA），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；乙腈，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；甲酸，上海安普實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BJ-2CD超凈工作臺，上海屹明凈化設(shè)備有限公司；離心機，中國上海醫(yī)療器械股份有限公司；GI36T高壓滅菌鍋，廈門致微儀器科技有限公司；Froma 700低溫冰箱，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；BD FACS Calibur流式細胞儀，美國BD公司；超聲波破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；細胞培養(yǎng)箱，德國MEMMERT公司；離心濃縮干燥儀，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；納升液相-Q Exactive四極桿超高分辨軌道阱質(zhì)譜儀(Nano LC-Q Exactive Plus)，美國Thermofisher公司；三孔電熱恒溫水浴鍋，上海一恒儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠飼養(yǎng)

從上海交通大學(xué)動物實驗中心訂購實驗小鼠，在SPF級動物房內(nèi)適應(yīng)性飼喂一周。小鼠飼養(yǎng)條件為：溫度18～22℃，相對濕度50%～80%，每日光照和黑暗環(huán)境各12 h。每只鼠籠內(nèi)小鼠數(shù)量不得多于3只，喂養(yǎng)期間應(yīng)及時更換墊料，并保證水和飼料的供給充足。適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，實驗小鼠各項體征指標(biāo)良好，適宜開展后續(xù)實驗。

1.3.2 小鼠脾臟組織單細胞懸液的制備

按照國家《實驗動物管理條例》有關(guān)要求對實驗小鼠實施斷頸處死，置于75%酒精中浸泡5 min，隨后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺內(nèi)。將老鼠四肢用大頭計固定在泡沫板上，使小鼠腹部朝上，用消毒后的鑷子輕輕夾起小鼠腹部皮毛，用手術(shù)剪小心剪開使其內(nèi)臟暴露，挑出脾臟。用PBS緩沖溶液洗滌脾臟后用已消毒的眼科剪將脾臟剪碎，置于35 mm培養(yǎng)皿中，加入5 mL小鼠淋巴細胞分離液，用注射器活塞研磨（研磨操作如圖1）。用巴斯德吸管吸取組織研磨液，過100目尼龍網(wǎng)，1 500 rpm，離心3 min，再用Hank’s溶液清洗3次，500 rpm短時低速離心，以200目細胞篩過濾，制得脾臟組織單細胞懸液備用。

圖1 脾臟研磨方法

1.3.3 小鼠淋巴細胞的提取與培養(yǎng)

在離心管中加入6 mL淋巴細胞提取液（取用前恢復(fù)至室溫并搖勻），再沿管壁緩慢加入5 mL脾臟組織單細胞懸液，覆蓋400μL的RPMI 1640完全培養(yǎng)液，室溫條件下，2 000 rpm離心30 min。離心后可見明顯分層（如圖2）。棄上層細胞培養(yǎng)液，吸出中間白色淋巴細胞層，加入10 mL RPMI 1640完全培養(yǎng)基，顛倒洗滌細胞，使其充分混勻，室溫條件下，700 rpm離心10 min，傾倒上清，重復(fù)洗滌3次后，用5 mL RPMI 1640不完全培養(yǎng)液重懸細胞，并計數(shù)細胞。取10μL細胞懸液，以臺盼藍染色確定細胞存活率，存活率大于90%說明細胞培養(yǎng)成功，可進行下一步實驗。

圖2 細胞分層示意

調(diào)整細胞濃度為1×106cells/mL接種于6孔板中，每孔板加入2 mL細胞懸液，在37℃、95%、5% CO2條件下培養(yǎng)6 h，培養(yǎng)期間每隔2 h微微晃動6孔板，使細胞均勻分布懸浮于培養(yǎng)液中。

1.3.4 流式檢測細胞純度

收集6孔板中的細胞于15 mL離心管中，棄去舊培養(yǎng)基，加入5 mL PBS洗滌細胞，室溫、1 000 rpm離心5 min，棄上清液，加入5 mL RPMI 1640完全培養(yǎng)液重懸細胞，用無菌吸管反復(fù)吹散細胞，制備成單細胞懸液，并用血球計數(shù)板計數(shù)。

取2 mL單細胞懸液于15 mL離心管內(nèi)，室溫、1 000 rpm離心5 min，棄上清，加入適量體積的PBS緩沖液調(diào)整細胞密度為1×106cells/mL，吹打混勻細胞，1 000 rpm離心5 min，棄上清后洗滌2次，加入適量PBS緩沖液重懸細胞。分別吸取100μL細胞懸液于4個5 mL流式染色管中（實驗管和空白對照管）。按照抗體說明書和表1向流式染色管中加入適量熒光標(biāo)記的小鼠抗體CD3-FITC和CD19-PE，室溫避光孵育20 min，用流式細胞儀檢測。

表1 流式染色管布局

1.3.5 炎癥細胞的構(gòu)建

完成流式檢測后回收細胞，培養(yǎng)48 h，更換新鮮培養(yǎng)液，在實驗組細胞中加入質(zhì)量濃度為10μg/mL的LPS溶液，對照組加等量的PBS溶液，最終濃度為500 ng/mL。繼續(xù)培養(yǎng)8 h后于低倍鏡下觀察細胞生長狀態(tài)趨于穩(wěn)定，計數(shù)并收集細胞。

1.3.6 淋巴細胞內(nèi)多肽的獲取

將收集的細胞用PBS溶液洗滌，室溫、4 000 rpm離心5 min，離心后棄上清，重復(fù)兩次。加PBS重懸細胞沉淀，超聲破碎，破碎時間50 min，超聲時間5 s，間隔5 s。將破碎后的混合液加入2.5倍體積的100%乙腈，振蕩15～30 min，4℃、12 000 rpm離心20 min，取上清，用離心濃縮儀干燥。干燥的沉淀用50 mmol/L NH4HCO3重溶后，加入1 mol/L二硫蘇糖醇溶液（DTT），在60℃水浴鍋溫育60 min。再加1 mol/L的碘乙酰胺溶液(IAA)，室溫避光反應(yīng)40 min。將上述溶液12 000 rpm離心10 min，取上清加至10 ku超濾管，12 000 rpm離 心40 min，再 加 入50μL 50 mmol/L NH4HCO3，12 000 rpm離心20 min，收集濾液。濾液用離心濃縮儀進行干燥，干燥后的樣品取一半用C18脫鹽柱脫鹽處理，上機測試。

1.3.7 淋巴細胞內(nèi)多肽的分析

使用納升液相-Q Exactive四極桿超高分辨軌道阱質(zhì)譜儀(Nano LC-Q Exactive Plus)分析淋巴細胞內(nèi)多肽。分析柱為C18反相分析柱(75μm×50 cm，1.9μm)；流動相A為99.9%水和0.1%甲酸混合液，流動相B為80%乙腈和0.1%甲酸混合液。液相梯度為：0～1 min，2%～6% B；1～38 min，6%～22% B；38～46 min，22%～32% B；46～48 min，32%～100% B；48～60 min，100% B。流動相流速為300 nL/min。ESI+模式，采用數(shù)據(jù)依賴性掃描模式，在分辨率為70 000(AGC 3e6)的軌道阱中進行全掃描采集(m/z 350～1800)。將分離出的前20個肽信號(電荷態(tài)≥+2)母離子通過高能碰撞(HCD)破碎，標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能（NCE）為28.0。毛細管的溫度是275℃，噴霧電壓是1 800 V。子離子在分辨率為17 500(AGC 1e5)的軌道上測量。全掃描和MS-MS掃描的最大填充時間分別設(shè)置為50 ms和45 ms，動態(tài)排除時間設(shè)置為30 s。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

利用PEAKS X軟件對樣品進行搜庫分析。小鼠蛋白數(shù)據(jù)庫下載自UniProt網(wǎng)站（16992條）。分析參數(shù)為：母離子質(zhì)量容差：1×10-5，二級譜圖質(zhì)量容差：0.020 u，固定修飾為Carbamidomethyl（C），可變修飾為Deamidation（NQ），Oxidation(M)，非酶切方式。通過搜庫分析，得到樣品中多肽及蛋白定性信息。

2 結(jié)果分析與討論

2.1 流式檢測細胞純度

從小鼠脾臟提取淋巴細胞后，計數(shù)細胞并用流式細胞儀檢測淋巴細胞的純度。結(jié)果顯示CD3和CD19陽性，小鼠淋巴細胞數(shù)量6×106cells/只，純度達到98.3%（見圖3），一般認為當(dāng)細胞純度達到95%及以上，該細胞純度較好，因此從小鼠脾臟中提取的淋巴細胞滿足下一步實驗要求，適宜開展胞內(nèi)多肽分析實驗。

圖3 流式檢測小鼠脾淋巴細胞純度

2.2 納升液相-Q Exactive四極桿超高分辨軌道阱質(zhì)譜儀分析結(jié)果

從UniProt網(wǎng)站下載小鼠蛋白數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫共包含16882條鼠源多肽的詳細數(shù)據(jù)，也是目前數(shù)量最多、信息最全的蛋白數(shù)據(jù)庫，故選此數(shù)據(jù)庫作為本研究的多肽檢索數(shù)據(jù)庫。通過Nano LC-Q Exactive Plus(納升液相-Q Exactive四極桿超高分辨軌道阱質(zhì)譜儀)鑒定多肽，使用PEAKS X軟件對樣品進行搜庫分析，質(zhì)譜結(jié)果如圖4所示。同時結(jié)合使用Target-decoy過濾方法，在給定錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR=1%）下篩去部分假陽性結(jié)果的多肽序列，鑒定出多肽的數(shù)量。在確定多肽的母體蛋白時，要求肽段覆蓋率達到50%以上，且分數(shù)達到40分以上可認為該蛋白來源具有較高可信度。對質(zhì)譜結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計表明，本研究從小鼠脾淋巴細胞中共鑒定得到385條多肽，其中實驗組鑒定得到多肽309條，來源于116條前體蛋白；對照組鑒定得到多肽149條，來源于51條前體蛋白（見圖5）。且有73條多肽在實驗組和對照組中同時存在。以上結(jié)果說明小鼠脾淋巴細胞在在受到外源性不良刺激后胞內(nèi)的多肽種類和數(shù)量發(fā)生了非常大的變化。

多肽的來源可以分為外源性多肽和內(nèi)源性多肽兩大類，目前多肽的研究主要集中于外源性多肽，一般直接或間接來源于動植物蛋白質(zhì)。比如Dallas和Pisanu等人通過NANO-LC-QTOF法對牛乳和羊乳進行肽譜分析，分別鑒定出159和187種肽[10-11]。Zhang等人在通過凝膠過濾色譜法和反相HPLC純化后，在酶促大豆水解物檢測到104種肽[12]。內(nèi)源性多肽主要來源于活體生物器官、組織、細胞和體液等等。之前有研究通過超濾分離糖尿病患者尿液中的天然肽，并通過LC-MS/MS進行分析。在UniProt人類蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中搜索MS/MS數(shù)據(jù)以進行肽和蛋白質(zhì)鑒定，共鑒定出1080種肽，對應(yīng)于總共100種蛋白質(zhì)[13]。還有研究人員對3種不同的人細胞系（SH-SY5Y、MCF7和HEK293）進行了多肽組學(xué)分析，鑒定發(fā)現(xiàn)272條多肽，并且部分多肽同時存在于不同細胞系中[14]。所以，從生物體自身組織和細胞中可以獲得大量的多肽組分，本研究結(jié)果與這些報道基本一致。

圖4 淋巴細胞受到LPS刺激前后胞內(nèi)多肽質(zhì)譜圖

圖5 淋巴細胞受到LPS刺激前后胞內(nèi)多肽數(shù)目的對比

從實驗結(jié)果還可以看出，淋巴細胞經(jīng)LPS刺激后，多肽數(shù)量和種類明顯多于對照組，分析原因可能是淋巴細胞被LPS刺激后激活，分泌出多種細胞因子。在免疫反應(yīng)過程中，免疫細胞正是通過細胞因子作用于靶細胞來完成免疫應(yīng)答反應(yīng)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。而這些細胞因子的本質(zhì)就是多肽。所以，淋巴細胞受LPS刺激后新產(chǎn)生很多可能具有免疫調(diào)節(jié)活性的多肽。

多數(shù)多肽是蛋白水解或泛素-蛋白酶體降解得到的產(chǎn)物。多肽一般位于母體蛋白的功能區(qū)（蛋白結(jié)合區(qū)或活性區(qū)）中，所以位于這兩個區(qū)域的多肽片段能夠保留母體蛋白一定的功能，甚至可以發(fā)揮相似的作用。因此，可以基于母體蛋白的功能預(yù)測多肽片段的潛在的功能特性[15]。本研究鑒定所得多肽主要來自于兩大類蛋白質(zhì)：組蛋白(Histone H2A、Histone H2B)和核糖體蛋白(40S ribosomal protein、60S ribosomal protein)。組蛋白是帶正電的核蛋白，有助于將DNA包裝成所有真核細胞共有的核小體。在細胞損傷或細胞信號傳遞過程中，組蛋白通過細胞壞死被動釋放，或作為細胞外的一部分從免疫細胞主動釋放。細胞外組蛋白的功能是殺菌蛋白，通過促進血管內(nèi)血栓形成來限制感染的擴散或隔離損傷區(qū)域，以允許免疫細胞浸潤，清除感染，啟動組織再生和修復(fù)[16-17]。因此，根據(jù)組蛋白的相關(guān)免疫機制，可以為針對急性炎癥性疾病的組蛋白靶向治療提供新的治療策略[18]。核糖體蛋白是核糖體的主要組成物質(zhì)，也是其發(fā)揮細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成作用的關(guān)鍵物質(zhì)。它主要通過4個rRNA和80個核糖體蛋白進行加工和組裝，分別成為大（60S）和小（40S）核糖體亞基，每個亞基都具有將mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的特定功能。研究表明，核糖體蛋白除了核糖體的結(jié)構(gòu)作用和mRNA翻譯作用之外，還具有組織特異性的功能作用[19]。有研究人員從40S/60S核糖體中分離純化出一種多肽物質(zhì)RPS3，這種物質(zhì)可以參與細胞凋亡信號通路的調(diào)控和基因表達的控制，對免疫系統(tǒng)具有非常好的作用[20]。它可以誘導(dǎo)樹突狀細胞的成熟和激活，在先天免疫系統(tǒng)中充當(dāng)TLR4的新配體，并在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中存在腫瘤特異性抗原的情況下顯著增加CD8+T細胞的產(chǎn)生。因此，RPS3是用于研發(fā)治療和預(yù)防癌癥疫苗的新型潛在的重要物質(zhì)[21,22]。可以發(fā)現(xiàn)，這兩大類蛋白可以均在免疫系統(tǒng)中承擔(dān)重要角色，因此來源于這兩種蛋白的多肽片段很有可能具備較高的免疫調(diào)節(jié)活性。

本研究通過Geogle搜索（http://www.google.cn/）、國內(nèi)專利檢索（http://pss-system.cnipa.gov.cn/s ipopublicsearch/portal/uiIndex.shtml）、國 外 專 利檢索（https://www.wipo.int/pct/en/、https://www.epo.org/）等多個網(wǎng)站對本研究鑒定得到的多肽序列進行搜索比對，確定是否已被報道，未被報道的多肽確定是新發(fā)現(xiàn)多肽，檢索結(jié)果見表2～3。結(jié)果表明在實驗組中新發(fā)現(xiàn)112條多肽，在對照組中新發(fā)現(xiàn)51條多肽，其中有24條多肽同時存在于實驗組和對照組中。

表2 實驗組新發(fā)現(xiàn)多肽

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

表3 對照組新發(fā)現(xiàn)多肽

多肽是由肽鍵連接的氨基酸形成的有機化合物。在特定的溫度和酸堿度下，蛋白質(zhì)會被酶降解或微生物水解，使多肽片段從母體蛋白中釋放出來[23]。多肽的體外分離過程包括蛋白質(zhì)選擇、水解、分離和純化，最后一步是確定肽序列、肽結(jié)構(gòu)和相應(yīng)的功能特性[24]。研究表明，氨基酸序列在很大程度上決定了多肽的功能活性[25]。目前已經(jīng)證實具有生物活性的多肽具有相似的結(jié)構(gòu)特征，它們的肽鏈長度約在2～30個氨基酸之間，在氨基酸組成上，除了精氨酸、賴氨酸或脯氨酸殘基之外還存在疏水性氨基酸[26]。在本研究中共有139條新發(fā)現(xiàn)的多肽，肽鏈長度在8～30個氨基酸之間，大多數(shù)多肽也具有上述特征。所以對從淋巴細胞中分離鑒定的多肽組分可能具有的生物活性，后續(xù)可以從母體蛋白及其氨基酸序列方面進行深入探究。

3 結(jié)論

本文以小鼠脾淋巴細胞為研究對象，對其受到不良刺激前后胞內(nèi)多肽進行分離和鑒定。實驗分別用LPS和PBS刺激細胞，結(jié)合Q Exactive Nano LC-MS/MS(Q Exactive納升液相-四極桿超高分辨軌道阱質(zhì)譜儀)、數(shù)據(jù)庫和同源性搜索對細胞中的肽進行鑒定和對比分析，并通過多個網(wǎng)站搜索比對氨基酸序列，確定其是否被公開報道過，為報道過的多肽即為新發(fā)現(xiàn)多肽。

根據(jù)實驗結(jié)果建立了一個“小鼠淋巴細胞多肽數(shù)據(jù)庫”，該數(shù)據(jù)庫包含385種多肽，肽鏈長度在8～30個氨基酸之間，其中還包含了139種新發(fā)現(xiàn)的多肽。實驗還確定了每條多肽來源的母體蛋白質(zhì)。所以后續(xù)研究可以根據(jù)多肽的母體蛋白和氨基酸序列，對其潛在的生物活性進行探究，同時為開發(fā)生物活性多肽保健品和特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品奠定了科學(xué)的基礎(chǔ)。