陳錦杭，馮城婷，林秋鳳，義志忠，鄭耀林，張樹(shù)權(quán)，區(qū)碩俊，曾廣豐

(1.東莞市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 東莞523808；2.廣州檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)有限公司 國(guó)家加工食品質(zhì)量檢驗(yàn)中心，廣州511447；3.廣州海關(guān)技術(shù)中心 廣東省動(dòng)植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510623)

0 引言

有機(jī)磷農(nóng)藥是一種殺蟲(chóng)劑，具有殺毒效果高、廣譜性強(qiáng)等特點(diǎn)，在蔬菜和水果種植中受到了廣泛的應(yīng)用[1-4]。其中在水果和蔬菜中均有廣泛的應(yīng)用[5-7]。長(zhǎng)期低劑量的暴露可能引發(fā)神經(jīng)毒性、遺傳毒性、生殖發(fā)育毒性等多種不良影響[8-9]。有機(jī)磷殘留物也可能會(huì)通過(guò)牛羊等牲畜的飼料進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，從而在動(dòng)物源性的食品中殘留，進(jìn)一步被人體攝入[10]。

目前，對(duì)有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥的測(cè)定方法主要有氣相色譜法[11-12]、氣相色譜-質(zhì)譜法[13-14]，液相色譜[15]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[16-19]，還有酶聯(lián)免疫法[20]。本文基于QuEChERS和固相萃?。⊿PE）技術(shù)建立了測(cè)定牛奶中的11種有機(jī)磷農(nóng)藥的GC-Q-TOF/MS法，該方法操作簡(jiǎn)便、快速高效且回收率高、重現(xiàn)性好，適用于實(shí)驗(yàn)室的日常分析測(cè)定，為相關(guān)檢測(cè)方法的研究提供了參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

氣相色譜-四級(jí)桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜（安捷倫7200B），配有電子轟擊離子源（Electron ionization,EI）及Qualitative Analysis B.07.00,Q-TOF Quantitative Analysis數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)安捷倫科技(中國(guó))有限公司；超純水系統(tǒng)（Milli-Q Advantage A10），法國(guó)Merck Millipore公司；搖床（Promax 2020），德國(guó)Heidolph Brinkman公司；高速離心機(jī)（TGL-16M），湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；渦旋振蕩器（Heidolph Multi Reax），德國(guó)Heidolph公司。

乙腈、乙酸乙酯（色譜純），賽默飛世爾公司；檸檬酸鈉，無(wú)水硫酸鎂，氯化鈉，檸檬酸氫二鈉（分析純），安譜公司。

速滅磷、甲拌磷、二嗪磷、甲基對(duì)硫磷、殺螟硫磷、水胺硫磷、溴硫磷、殺撲磷、p,p'-DDE、三唑磷、p,p'-DDT（固體標(biāo)樣，純度≥98.5%）標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自上海安譜科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱(chēng)取11種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.0100 g，甲醇定容至10 mL容量瓶，分別配制成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別準(zhǔn)確移取100μL質(zhì)量濃度1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：分別取上述混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液10，20，50，100，200，500μL于10 mL容量瓶中，用空白基質(zhì)液稀釋至刻度，所得混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線質(zhì)量濃度分別為10，20，50，100，200，500μg/L。

1.3 樣品前處理

提取：稱(chēng)取牛奶樣品10.0 g，依次加入10 mL乙腈，1.0 g檸檬酸鈉，4.0 g無(wú)水硫酸鎂，1.0 g氯化鈉，0.4 g檸檬酸氫二鈉，置于搖床震蕩15 min，然后以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心5 min。吸取上清液5 mL到氮吹管，40℃氮吹至近干，加入2 mL乙酸乙酯，渦旋混勻，繼續(xù)氮吹至近干，再加入1 mL乙酸乙酯，渦旋，氮吹至0.5 mL。

凈化：用4 mL的乙酸乙酯活化GCB固相萃取小柱（3 mL，250 mg），把濃縮的樣液加到GCB柱，用3 mL的乙酸乙酯分3次洗脫，收集洗脫液，40℃氮吹至近干，用乙酸乙酯定容至1 mL，過(guò)0.22μm有機(jī)相濾膜，供儀器測(cè)定。

1.4 色譜及質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：安捷倫DB-5ms石英毛細(xì)柱(30 m×0.25 mm，0.25μm，購(gòu)于安捷倫上海公司)；升溫程序：80℃保持1 min，以5℃/min升至180℃，保持7 min，以10℃/min升至260℃保持2 min，以20℃/min升至300℃保持9 min；載氣(He)流速1.5 mL/min，接口溫度為295℃，進(jìn)樣量1μL；不分流。

1.4.2 質(zhì)譜條件

電子轟擊(EI)離子源；電子能量70 eV；四極桿溫度150℃；離子源溫度280℃；溶劑延遲為5 min；工作模式：全掃描；質(zhì)量掃描范圍：m/z 60～550 amu；掃描速率：5 spectra/s，高分辨模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

由于分析化合物較多，盡管高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜定性能力較強(qiáng)，但對(duì)于某些化合物，如同分異構(gòu)體2,4-DDT和4,4-DDT，有可能產(chǎn)生相同的碎片離子，從而影響定量的準(zhǔn)確性，所以有必要對(duì)化合物進(jìn)行分離，同時(shí)也是為了降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量結(jié)果的影響。本實(shí)驗(yàn)比 較了DB-5ms、HB-5ms以及PH-5ms色譜柱，使用HB-5ms和PH-5ms的色譜柱難以分離水胺硫磷和溴硫磷，而且峰型較差，難以滿足分析的要求。本實(shí)驗(yàn)最后發(fā)現(xiàn)DB-5ms色譜柱分離效果最好，9種有機(jī)磷能同時(shí)分離，且具有良好的分離度，滿足檢測(cè)的要求，因此本實(shí)驗(yàn)選用DB-5ms。由于水胺硫磷、殺螟硫磷和殺撲磷比較難分離，本研究調(diào)整了升溫程序，使用2個(gè)升溫梯度，成功對(duì)9種有機(jī)磷同時(shí)進(jìn)行分離，并成功獲得良好的分離效果，11種有機(jī)磷提取色譜如圖1所示。

圖1 11種有機(jī)磷目標(biāo)物酯的提取離子流色譜

2.2 GC-Q-TOF/MS分析方法的建立

本實(shí)驗(yàn)先通過(guò)全掃描模式，對(duì)11種目標(biāo)有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行采集，得到全掃描質(zhì)譜圖，建立了TOF全掃描精確質(zhì)量數(shù)的數(shù)據(jù)庫(kù)。同時(shí)確定每種化合物的保留時(shí)間，兩者結(jié)合進(jìn)行準(zhǔn)確的定性分析。再根據(jù)目標(biāo)農(nóng)藥碎片離子的豐度確定定量離子，同時(shí)選擇特征離子組合（見(jiàn)表1）進(jìn)行SIM模式掃描。根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和待測(cè)樣品的SIM離子流圖中的峰面積，最后通過(guò)外標(biāo)法定量分析。

表1 11種有機(jī)磷農(nóng)藥的質(zhì)譜峰碎片參數(shù)

2.3 固相萃取柱類(lèi)型的選擇

牛奶樣品中含有較多的糖、蛋白質(zhì)、氨基酸和干擾性雜質(zhì)，對(duì)11種有機(jī)磷目標(biāo)物產(chǎn)生較大的基質(zhì)效應(yīng)，從而干擾實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。本研究采用GCB、PSA和C18固相吸附劑對(duì)處理后的溶液進(jìn)行凈化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，11種有機(jī)磷目標(biāo)物中，有一部分具有胺基結(jié)構(gòu)，因此PSA對(duì)其具有較明顯的吸附作用，導(dǎo)致回收率降低，其次是C18，對(duì)11種有機(jī)磷也有一定的吸附作用。而GCB對(duì)目標(biāo)物的吸附較少，并且能較好地去除基質(zhì)對(duì)分析結(jié)果的影響，基質(zhì)效應(yīng)也較弱。本實(shí)驗(yàn)最終選取GCB進(jìn)行凈化，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同固相萃取柱對(duì)回收率的影響(n=6)

2.4 乙腈用量對(duì)回收率的影響

實(shí)驗(yàn)前期優(yōu)化時(shí)發(fā)現(xiàn)，搖床振搖15 min以上基本完成提取，因此不對(duì)提取時(shí)間作詳細(xì)探究。在以純水用量為5 mL的條件下，對(duì)乙腈用量對(duì)回收率的影響進(jìn)行了探究，并以11種有機(jī)磷的平均回收率為考察依據(jù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙腈用量為10 mL時(shí)，11種有機(jī)磷的回收率基本滿足測(cè)定要求，而用量繼續(xù)增加，回收率沒(méi)有明顯變化。雖然乙腈用量越多，稀釋倍數(shù)越大，因此基質(zhì)效應(yīng)也會(huì)相對(duì)較弱，但同樣方法檢出限也會(huì)越高，氮吹時(shí)間，檢測(cè)成本等也會(huì)消耗較大。因此，綜合考慮，選取10 mL為乙腈提取用量。結(jié)果如圖3所示。

圖3 乙腈用量對(duì)回收率的影響(n=6)

2.5 基質(zhì)效應(yīng)的討論

由于牛奶中含有大量的糖和氨基酸，還有其他雜質(zhì)，在提取過(guò)程中，會(huì)被提取到乙腈層，同時(shí)也難以在凈化過(guò)程中完全除去，因此會(huì)在質(zhì)譜分析的過(guò)程中，與目標(biāo)物進(jìn)行離子化競(jìng)爭(zhēng)，從而有可能影響目標(biāo)物的離子化程度而產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。本文以空白基質(zhì)曲線的斜率與純?nèi)軇┣€的斜率比值K為參考依據(jù)，以討論方法的基質(zhì)效應(yīng)程度，當(dāng)K值在0.9～1.1之間時(shí)，說(shuō)明基質(zhì)效應(yīng)不明顯；K值小于0.9時(shí)，基質(zhì)負(fù)效應(yīng)明顯；K值大于1.1時(shí)，基質(zhì)正效應(yīng)明顯；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，12種有機(jī)磷的K值在0.56～0.81之間，說(shuō)明基質(zhì)負(fù)效應(yīng)較明顯，因此，最終選擇采用基質(zhì)曲線進(jìn)行定量。

2.6 線性關(guān)系

本研究使用外標(biāo)法，對(duì)11種目標(biāo)物進(jìn)行定量分析。以空白基質(zhì)溶液來(lái)配制標(biāo)準(zhǔn)系列曲線，在經(jīng)優(yōu)化后的儀器條件下進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得結(jié)果以濃度為橫坐標(biāo)(X)和定量離子對(duì)的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所有目標(biāo)物在10～500μ/L范圍內(nèi)呈良好線性，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.9984。其中，方法檢測(cè)限LOD（S/N=3）為1.56～7.85μg/kg，定量限LOQ（S/N=10）為5.51～26.89μg/kg。結(jié)果如表2所示。

表2 11種有機(jī)磷農(nóng)藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)（R2）和檢出限

2.7 回收率及精密度結(jié)果分析

選用空白樣品，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)10，20，50μg/kg，進(jìn)行3個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平分別日內(nèi)進(jìn)行6次平行測(cè)定。平均回收率范圍在73.6%～95.4%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在2.48%～6.30%之間。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明該11種有機(jī)磷的回收率良好，日內(nèi)重復(fù)性好，能滿足分析測(cè)定要求，結(jié)果如表3所示。

表3 11種有機(jī)磷農(nóng)藥的回收率和精密度

3 結(jié)論

本研究基于QuEChERS技術(shù)進(jìn)行提取，結(jié)合SPE固相萃取柱進(jìn)行凈化，使用GC-Q-TOF/MS建立了快速測(cè)定牛奶中11種有機(jī)磷農(nóng)藥的測(cè)定方法。利用GCB對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化，有效地降低了基質(zhì)效應(yīng)對(duì)回收率的影響，提高了方法的靈敏度；在優(yōu)化的氣相色譜條件下，11種有機(jī)磷農(nóng)藥在35 min內(nèi)全部出峰，且完全分離，峰型良好；結(jié)合GC-Q-TOF/MS，準(zhǔn)確測(cè)定了11種有機(jī)磷定性定量離子對(duì)的精確分子量，極大程度的降低了假陽(yáng)性的可能；相關(guān)方法學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法簡(jiǎn)單便捷，回收率好且精密度高，為有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)方法研究提供了重要參考數(shù)據(jù)。