PHAM HUNG HAI,鄒航,吳德東,曾健勇,張國(guó)財(cái),張杰

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱150040)

黃褐天幕毛蟲(Malacosoma neustria testacea)，屬鱗翅目(Lepidoptera)、枯葉蛾科(Lasiocampidae)，取食果樹和闊葉樹的葉片，大發(fā)生時(shí)可損害全部樹木葉片，導(dǎo)致次年林木生長(zhǎng)情況嚴(yán)重受損，降低果實(shí)產(chǎn)量，影響林業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，為此人們對(duì)該害蟲進(jìn)行防治研究。經(jīng)前人研究得出，白屈菜和走馬芹20倍液對(duì)黃褐天幕毛蟲的毒殺作用不明顯，但高滲苯氧威1500倍液的作用下，校正死亡率可達(dá)100%[1]。通過野外林地實(shí)驗(yàn)可知，使用20%殺鈴脲懸浮劑48 h后，幼蟲取食量降低，施藥72 h后25%的天幕毛蟲不再進(jìn)食，且蟲體縮小，最終死亡[2]。在滅幼脲Ⅲ號(hào)膠懸劑對(duì)幼蟲和卵進(jìn)行殺蟲實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)2齡幼蟲取食用50～100μg滅幼脲Ⅲ號(hào)處理過的食物后，平均校正死亡率可達(dá)到100%[3]。

近年來，具有對(duì)環(huán)境污染小、殺蟲效果顯著等特點(diǎn)的植物性殺蟲劑得到廣泛應(yīng)用，成為害蟲防治重要手段。使用除蟲菊素處理72 h后，異遲眼蕈蚊(BradysiadifformisFrey)的校正死亡率可達(dá)到90%，說明除蟲菊素對(duì)異遲眼蕈蚊有一定的殺蟲效[4]。在0.5～3.0 mL/孔的使用劑量下，辣根素可有效地防治天牛(Cerambycidae)[5]。除蟲菊素、魚藤酮、印楝素和苦瓜葉提取物對(duì)螺旋粉虱(Aleurodicusdisperses)均具有較強(qiáng)的毒殺效果，并且在很大程度上降低了昆蟲產(chǎn)生抗藥性的能力[6]。小菜蛾(Plutellaxylostella)在蒙古扁桃葉片乙醇提取物的脅迫下，蟲體出現(xiàn)不規(guī)則生長(zhǎng)現(xiàn)象[7]。對(duì)米象(Sitophilusoryzae)的防治實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，香樟精油對(duì)米象有較高的驅(qū)避作用，而丁香精油對(duì)其觸殺作用最強(qiáng)，丁香和肉桂皮精油具有最高的熏蒸致死率[8]。韭菜揮發(fā)油對(duì)小菜蛾觸殺毒性的LC50為0.56μL/mL，而韭菜提取物對(duì)小菜蛾觸殺毒性的LC50為3001.88 mg/L[9]。當(dāng)龍葵根和澤漆根的提取物濃度為200 mg/mL時(shí)具有較強(qiáng)的殺螨(Tetranychusurticae)活性，殺蟲活性分別為95.5%和49.4%[10]。

因此，研究菊芋提取物對(duì)黃褐天幕毛蟲營(yíng)養(yǎng)狀況和酶活的影響，為今后對(duì)其更深入的研究提供了理論依據(jù)，對(duì)黃褐天幕毛蟲的防治工作提供了研究基礎(chǔ)，具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物與昆蟲：黃褐天幕毛蟲采自東北林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)楊樹上，使用一次性養(yǎng)蟲盒進(jìn)行飼養(yǎng)，溫度25 ℃，相對(duì)濕度為40%～60%，光暗條件為16/8 h，選取3齡幼蟲進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。黑心菊花、波斯菊花、菊芋花采自東北林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)。用烘箱將3種菊花烘干，磨成粉末狀，將菊花粉末保存于廣口瓶中。

試劑及儀器：電子分析天平(型號(hào)為Adventure AR2130)，F(xiàn)S30C昆明小型超微粉碎機(jī)，雷邁中藥材超微粉碎機(jī)，SHB-III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司),SK20G超聲清洗器，R-1001VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，分析純AR無(wú)水乙醇，低溫離心機(jī)。試劑及儀器：分析純AR無(wú)水乙醇，酶活試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。Adventure AR2130型電子分析天平，雷邁超微粉碎機(jī)，SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵，SK20G型超聲清洗器，R-1001VN型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，D3024R型號(hào)低溫離心機(jī)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 提取物的制備。分別稱取50 g黑心菊、波斯菊及菊芋3種植物干粉末，使用乙醇提取，在料液比為1∶50(g:mL)、采用超聲波提取法對(duì)以上3種植物活性物質(zhì)進(jìn)行提取，條件60 min、溫度50 ℃、各植物提取物均制成20 mg/mL的供試藥劑4 ℃保存。

1.2.2 試蟲處理。采用胃毒的方法對(duì)3齡黃褐天幕毛蟲進(jìn)行處理，濃度為20 mg/mL，將三種菊提取物噴灑在樹葉上，取饑餓24 h的3齡幼蟲進(jìn)行飼喂，15頭一組，3個(gè)重復(fù)處理，幼蟲取食樹葉后，在12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h記錄幼蟲死亡數(shù)。

選擇殺蟲效果最好的提取物進(jìn)行下一步試驗(yàn)，選3齡黃褐天幕毛蟲，每組15頭，設(shè)3個(gè)重復(fù)，在12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h分別取樣，使用液氮冷凍后放入-80℃保存。隨后進(jìn)行保護(hù)酶(SOD、CAT、POD、PPO)、解毒酶(GST)活性測(cè)定，以及蛋白質(zhì)、碳水化合物、海藻糖含量的測(cè)定。

1.2.3 解毒酶和保護(hù)酶活力測(cè)定。酶液的制備：取0.1 g蟲體組織，用液氮進(jìn)行研磨，加入適量提取液或生理鹽水，渦旋2 min后在12000 rpm 4 ℃離心10 min，取上清待測(cè)。測(cè)定解毒酶GST和保護(hù)酶SOD、POD、CAT、PPO的活性。

1.2.4 蛋白質(zhì)、碳水化合物、海藻糖含量測(cè)定。蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250法進(jìn)行測(cè)定，碳水化合物含量和海藻糖含量采用石疆紅等人的方法并進(jìn)行改進(jìn)[11]，取整頭蟲進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0軟件及Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用One-Way ANOVA LSD Duncan分析差異顯著性，柱形圖均采用SigmaPlot 10.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 毒力測(cè)定

挑取蟲齡大小一致、健康的黃褐天幕毛蟲進(jìn)行毒力測(cè)定，從表1可知，在20 mg/mL濃度下，菊芋提取物對(duì)黃褐天幕毛蟲的致死率高達(dá)97.52%，濃度為20 mg/mL的黑心菊的提取物處理下黃褐天幕毛蟲的死亡率為82.7%，而相同濃度下波斯菊提取物處理下的死亡率僅為3.71%，因此選擇菊芋進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 三種菊花提取物對(duì)黃褐天幕毛蟲幼蟲的毒力測(cè)定

2.2 解毒酶和保護(hù)酶活力影響

解毒酶和保護(hù)酶是昆蟲體內(nèi)重要的兩種酶，在昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育過程中起到維持昆蟲正常生長(zhǎng)的作用，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)從而了解菊芋提取物對(duì)黃褐天幕毛蟲體內(nèi)不同酶活力的影響情況。

由圖1可知：菊芋花提取物對(duì)黃褐天幕毛蟲SOD酶活性有顯著影響。在處理后12 h SOD酶活性被抑制，與對(duì)照相比，酶活力下降了0.07倍。處理后24 h SOD酶活性表現(xiàn)為被激活，處理酶活力為對(duì)照組的1.35倍。處理后48 h對(duì)照組的SOD酶活力為41.34 U/mg，處理組的酶活力為26.11 U/mg，同比下降了0.37倍。在處理后72 h，SOD酶活力變化極顯著，處理組為對(duì)照組的0.67倍。

圖1 黃褐天幕毛蟲SOD活力

由圖2可知：菊芋花提取物對(duì)黃褐天幕毛蟲POD酶活性有顯著激活作用。POD與SOD酶活性表現(xiàn)相同，在處理后12 h酶活性被顯著抑制，與對(duì)照相比，酶活力下降了0.4倍。處理后 12 h、48 h、72 h POD酶活性表現(xiàn)均為激活，在處理后24 h最為顯著，為對(duì)照組的1.6倍。48 h和72 h的對(duì)照組POD酶活力分別為22.85 U/mg和21.06 U/mg，處理組POD酶活力分別為25.92 U/mg，24.03 U/mg，均呈激活作用。

圖2 黃褐天幕毛蟲POD活力

由圖3可知：在菊芋花提取物的處理下，黃褐天幕毛蟲PPO酶活性在處理后12 h、24 h、48 h均被抑制，在72 h PPO酶活性表現(xiàn)為激活作用。在處理后12 h PPO酶活性為4.8 U/mg，與對(duì)照組酶活性10.98 U/mg相比，處理組酶活力下降了0.56倍。處理后24 h處理組PPO酶活性為7.69 U/mg，對(duì)照組為6.31 U/mg，相比對(duì)照組酶活力下降了0.18倍。處理后48 h處理組酶活相比對(duì)照組下降了0.05倍，酶活力分別為8.7 U/mg和8.26 U/mg。處理后72 h處理組酶活力相比對(duì)照組呈上升趨勢(shì)，由7.35 U/mg上升到9.35 U/mg。

圖3 黃褐天幕毛蟲PPO活力

由圖4可知：菊芋花提取物對(duì)黃褐天幕毛蟲保護(hù)酶CAT酶活性在處理后12 h、48 h、72 h均呈激活作用，在12 h和48 h激活作用最明顯。處理后12 h處理組的CAT酶活性相比對(duì)照組的75.72 U/mg上升了0.88倍，而處理后24 h處理組的CAT酶活性為113.01 U/mg，對(duì)照組酶活力為100.61 U/mg。處理后48 h處理組的CAT酶活力為141.78 U/mg，對(duì)照組為86.32 U/mg，相比酶活力提高了0.64倍。處理后72 h處理組酶活力同樣被激活，但相比于對(duì)照組差異較小，酶活力分別為84.98 U/mg和93.58 U/mg。

圖4 黃褐天幕毛蟲CAT活力

由圖5可知：菊芋花提取物對(duì)黃褐天幕毛蟲解毒酶GST酶活性有顯著抑制作用。處理12 h處理組GST酶活力為59.52 U/mg相比于對(duì)照組的95.97 U/mg，酶活力上升了0.61倍。在處理24 h處理組酶活力相比對(duì)照組的酶活力明顯下降，由94.02 U/mg下降到69.52 U/mg降低了0.26倍。在處理后48 h與處理后12 h呈現(xiàn)同樣的趨勢(shì)，酶活力下降了0.33倍。在處理后72 h酶活仍處于下降趨勢(shì)，但僅下降了0.06倍。

圖5 黃褐天幕毛蟲GST活力

2.3 蛋白質(zhì)、碳水化合物、海藻糖含量的影響

蛋白質(zhì)、碳水化合物、海藻糖是昆蟲體內(nèi)與能量代謝密切相關(guān)的物質(zhì)，通過測(cè)定三種含量觀察菊芋提取物影響黃褐天幕毛蟲體內(nèi)能量變化的情況。

由圖6可知：在菊芋提取物的處理下，黃褐天幕毛蟲蛋白質(zhì)含量呈上升趨勢(shì)，在處理48 h略有下降。在處理后12 h對(duì)照組的蛋白質(zhì)含量為17.13 mg/g，處理組的蛋白質(zhì)含量為33.9 mg/g，相比較對(duì)照組增加了0.97倍。處理后24 h蛋白質(zhì)含量由33.2 mg/g增長(zhǎng)到38.77 mg/g，增長(zhǎng)了0.2倍。在處理后48 h蛋白質(zhì)含量由上升趨勢(shì)變?yōu)橄陆第厔?shì)，下降了0.23倍。處理72 h后蛋白質(zhì)含量顯著上升，對(duì)照組蛋白質(zhì)含量為44.36 mg/g，處理組蛋白質(zhì)含量為66.20 mg/g，相比對(duì)照組來說上升了0.49倍。

圖6 黃褐天幕毛蟲的蛋白質(zhì)含量

由圖7可知：經(jīng)菊芋花提取物處理過后的黃褐天幕毛蟲體內(nèi)的碳水化合物含量在處理后12 h、24 h、48 h均呈降低趨勢(shì)，在72 h為激活作用。在處理后12 h碳水化合物的含量下降了0.14倍，對(duì)照組為7.83 mg/g，處理組碳水化合物含量為6.71 mg/g。在24 h對(duì)照組和處理組較12 h相比碳水化合物呈上升趨勢(shì)，但處理組的碳水化合物含量仍低于對(duì)照組，分別為16.85 mg/g和11.36 mg/g。處理后48 h的碳水化合物含量的變化趨勢(shì)與24 h相似。處理后72 h處理組的碳水化合物含量呈現(xiàn)顯著的上升，上升了0.1倍。通過觀察四個(gè)處理時(shí)間可以看出，經(jīng)菊芋花提取物處理后的黃褐天幕毛蟲體內(nèi)的碳水化合物含量整體呈上升的趨勢(shì)。

圖7 黃褐天幕毛蟲的碳水化合物含量

由圖8可知：處理組和對(duì)照組的黃褐天幕毛蟲體內(nèi)海藻糖含量均呈下降趨勢(shì)，在菊芋花提取物的處理下，處理組的海藻糖含量相比對(duì)照組略有降低，而在處理后12 h海藻糖含量下降幅度最大，下降了0.41倍。處理后24 h的對(duì)照組和處理組相差較小，分別為0.29 mg/g和0.30 mg/g。處理后48 h對(duì)照組為0.33 mg/g，處理組為0.25 mg/g，降低了0.26倍。處理后72 h的海藻糖含量變化趨勢(shì)與處理后48 h相似，對(duì)照組為0.22 mg/g，處理組為0.15 mg/g，下降了0.32倍。

圖8 黃褐天幕毛蟲的海藻糖含量

3 結(jié)論與討論

在昆蟲體內(nèi)，存在兩類重要的酶，即解毒酶和保護(hù)酶。解毒酶主要與昆蟲對(duì)食物及殺蟲劑的解毒有關(guān)，可幫助昆蟲將有毒物質(zhì)排出體外，以保證正常的生理生長(zhǎng)，當(dāng)昆蟲受到外界影響時(shí)，解毒酶會(huì)發(fā)生作用。使用亞致死濃度為10的氧化樂果處理黃褐天幕毛蟲，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性呈先上升后下降的趨勢(shì)[12]。同樣在對(duì)人參莖葉皂苷對(duì)桃蚜(Myzuspersicae)的研究中發(fā)現(xiàn)，在處理48 h后對(duì)桃蚜體內(nèi)的GST有明顯的抑制作[13]。在本研究中，我們測(cè)得在20 mg/mL濃度的菊芋提取物處理下，黃褐天幕毛蟲體內(nèi)的GST活性與前任研究呈相同趨勢(shì)，在處理12 h后，GST活性上升，說明解毒酶發(fā)揮作用，將不利于昆蟲生長(zhǎng)的外源有毒物質(zhì)進(jìn)行解毒。在處理24 h后GST活性下降，到72 h與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化。在昆蟲體內(nèi)存在三種重要的防御氧化損傷的保護(hù)酶，分別是過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)。當(dāng)前對(duì)這三種保護(hù)酶做了大量的研究，高效百樹菊酯、功夫菊酯及殺蟲脲對(duì)分月扇舟蛾(Closteraanastomosis)幼蟲體內(nèi)的SOD活性均有一定的抑制作用[14]。本研究中發(fā)現(xiàn)，濃度為20 mg/mL的菊芋提取物在處理12 h后抑制了SOD的活性，24 h后對(duì)SOD有一定的激活作用，從48 h到72 h的處理過程中，同樣是先抑制后激活的趨勢(shì)，說明菊芋提取物對(duì)黃褐天幕毛蟲體內(nèi)SOD活性有一定的影響。通過對(duì)分月扇舟蛾體內(nèi)CAT活性的研究可知，高效百樹菊酯對(duì)其3齡幼蟲體內(nèi)的CAT活性有一定激活效應(yīng)[14]。同樣，高效氯氰菊酯對(duì)天幕毛蟲的CAT活性也起到了激活的作用[15]。在本研究中，我們得到了除24 h CAT活性被抑制，在處理12 h、36 h、72 h CAT的活性均顯著激活。昆蟲體內(nèi)的超氧化物歧化酶和過氧化氫酶是維持昆蟲體內(nèi)自由基平衡的主要酶，說明菊芋提取物對(duì)黃褐天幕毛蟲體內(nèi)自由基平衡造成了一定程度的破壞。大量研究表明外源殺蟲劑對(duì)昆蟲體內(nèi)POD的活性有激活作用，如多殺菌素處理黃褐天幕毛蟲時(shí)，幼蟲體內(nèi)的POD活性明顯增強(qiáng)[16]。在0.8 mg/mL棉酚和0.08 mg/mL蕓香苷的處理下，綠盲蝽(Lyguslucorum)體內(nèi)POD活性顯著高于對(duì)照[17]。我們的研究結(jié)果顯示在處理12 h POD活性被抑制，但從24 h到72 h，黃褐天幕毛蟲體內(nèi)的POD活性均顯著增加。除以上幾種酶，昆蟲體內(nèi)還有另一種重要的保護(hù)酶即多酚氧化酶(PPO)，多殺菌素和曲酸對(duì)甜菜夜蛾體內(nèi)PPO活力均有顯著的抑制作用[18]。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出在菊芋提取物處理黃褐天幕毛蟲前48 h，PPO活性始終被抑制，在處理72 h PPO被激活，說明菊芋提取物對(duì)黃褐天幕毛蟲體內(nèi)的PPO活性有一定的抑制效應(yīng)。以上結(jié)果說明菊芋提取物能夠有效干擾昆蟲的解毒酶和保護(hù)酶系統(tǒng)，對(duì)黃褐天幕毛蟲的防治有一定的效果。

碳水化合物是昆蟲維持生存的重要能量來源。在重金屬的脅迫下，舞毒蛾(Lymantriadispar)幼蟲體內(nèi)的碳水化合物含量下降[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究一致，用20 mg/mL菊芋提取物處理后，在處理的前36 h黃褐天幕毛蟲體內(nèi)的碳水化合物含量呈下降趨勢(shì)，說明菊芋提取物抑制了幼蟲體內(nèi)碳水化合物的轉(zhuǎn)化，對(duì)其生命狀態(tài)有一定的影響。蛋白質(zhì)是昆蟲體內(nèi)重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其變化體現(xiàn)了昆蟲蛋白質(zhì)的合成情況。在酸堿脅迫下，舞毒蛾幼蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)含量顯著下降[11]。但在本研究中，除處理36 h，其他時(shí)間點(diǎn)的蛋白質(zhì)含量均高于對(duì)照組，說明黃褐天幕毛蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)在菊芋提取物的作用下，形成了明顯的應(yīng)激反應(yīng)，說明菊芋提取物對(duì)黃褐天幕毛蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)合成有一定的誘導(dǎo)作用。海藻糖是昆蟲體內(nèi)重要的糖類之一，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黃褐天幕毛蟲體內(nèi)的海藻糖含量顯著下降，說明菊芋提取物促使黃褐天幕毛蟲體內(nèi)的海藻糖分解為葡萄糖，以維持正常生理需要。

綜上，濃度為20 mg/mL的菊芋提取物對(duì)黃褐天幕毛蟲體內(nèi)解毒酶和保護(hù)酶系統(tǒng)有一定的干擾。在處理初期，四種保護(hù)酶均呈下降趨勢(shì)，而解毒酶GST的活性則表現(xiàn)為別激活，在處理末期，四種保護(hù)酶活性被顯著激活，而解毒酶GST明顯被抑制。除此之外，菊芋提取物對(duì)黃褐天幕毛蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成也起到了誘導(dǎo)的作用，除處理48 h，其他時(shí)間點(diǎn)蛋白質(zhì)含量均有所升高。由研究結(jié)果可知，菊芋提取物還抑制了黃褐天幕毛蟲體內(nèi)碳水化合物的轉(zhuǎn)化，在處理過程中，提高了其體內(nèi)碳水化合物的消耗，對(duì)其生命活動(dòng)造成影響，且幼蟲體內(nèi)的海藻糖在菊芋提取物的作用下，被轉(zhuǎn)化為葡萄糖，為昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)。