楊 英，王 煒，馬芳芳

(新疆軍區(qū)總醫(yī)院北京路醫(yī)療區(qū)眼科三病區(qū)，烏魯木齊 830013)

斜視是眼科常見疾病之一，也是引發(fā)雙眼視覺功能障礙最常見原因，其發(fā)病率高，為3%～5%，嚴重影響患者生活與工作[1]。共同性斜視是斜視最常見類型，其斜視角度不因注視方向、注視眼別的改變而變化，其發(fā)病率約占斜視總發(fā)病率的80%[2]。共同性斜視臨床常用治療方法有保守治療與手術治療，而手術治療是其第一治療方案，可達到功能性治愈目的[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，斜視眼外肌中一些基因表達變化與肌纖維形態(tài)、數(shù)量等相關，肌球蛋白重鏈13基因(myosin heavy chain gene 13，MYH13)在眼外肌中表達，在眼外肌高速掃視收縮中發(fā)揮重要作用[4]。但關于MYH13在共同性外斜視患者眼外肌中表達的研究較少，因此，本研究初步探討MYH13與共同性外斜視患者眼外肌病理形態(tài)學及預后的關系，旨在為其治療及分子機制研究提供參考資料，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年5月至2018年10月本院眼科收治的86例行斜視矯正術治療的共同性外斜視患者作為研究對象(斜視組)，依據(jù)眼外肌(內(nèi)直肌)中MYH13 mRNA水平中位數(shù)分為MYH13高表達組和MYH13低表達組。納入標準：(1)符合共同性外斜視診斷標準[5]；(2)雙眼球各方向運動不受限；(3)第一、二斜視角相等；(4)年齡大于1歲；(5)患者及家屬知情，簽署知情同意書；(4)經(jīng)本院倫理委員會審核批準。排除標準：(1)智力發(fā)育障礙，無法配合檢查者；(2)有眼部手術史者；(3)伴眼部器質(zhì)性病變者；(4)高度近視、遠視、弱視、屈光參差大于2.00 D及散光者；(5)垂直斜視者；(6)合并神經(jīng)系統(tǒng)疾病者；(7)全身器質(zhì)性疾病者；(8)術后隨訪資料不完整者。共同性外斜視組男39例，女47例，年齡3～28歲，平均(11.89±3.42)歲；發(fā)病年齡1.3～7.8歲，平均(3.50±1.10)歲；病程3.2～11.6年，平均(5.46±1.13)年，外斜視度數(shù)45°～90°，平均(67.50±8.50)°。另選取28例因外傷所致需眼球摘除患者(無斜視)的眼外肌(內(nèi)直肌)作為對照組，其中男13例，女15例；年齡7～32歲，平均(13.18±3.13)歲；19例為眼球破裂，9例為眼球貫通傷。斜視組和對照組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1眼外肌MYH13 mRNA表達檢測

采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測MYH13 mRNA表達，MYH13引物序列：上游為5′-TGA CCG CAG CAT CTC TAG GAA GAC G-3′，下游為5′-TTC CGG AGG TAG GGA GCT GCT TC-3′，內(nèi)參基因GAPDH引物序列：上游為5′-CCC GCT TCG CTC TCT GCT CC-3′，下游為5′-ACC AG G CGC CCA ATA CGA CC-3′。Trizol(美國Invitrogen公司)法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TAKARA公司)合成cDNA，qRT-PCR試劑盒(日本TAKARA公司)配制反應體系，進行PCR擴增，采用2-ΔΔCT方法計算眼外肌MYH13 mRNA相對表達水平。

1.2.2眼外肌MYH13蛋白水平檢測

提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，取蛋白于10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，將目的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，加山羊抗MYH13(美國Santa Cruz公司)，兔抗GAPDH，分別加入辣根過氧化物酶標記的兔抗山羊、鼠抗兔二抗，ECL染色，膠片曝光，顯影，定影，計算MYH13蛋白表達水平。

1.2.3眼外肌病理形態(tài)學檢查

取眼外肌標本，常規(guī)脫水，石蠟包埋，制作厚度3 μm眼外肌縱向切片，切片進行二甲苯脫蠟，酒精脫水，蘇木精染色，鹽酸乙醇分化，伊紅染色，脫水、透明，封片；采用Olympusl X50倒置顯微鏡與PM304曝光控制系統(tǒng)觀察蘇木精-伊紅(HE)染色圖片及纖維照相，高倍鏡下隨機取5個視野，計算肌纖維數(shù)量，以平均數(shù)作為每例標本肌纖維含量；采用Motic Med6.0圖片分析系統(tǒng)測量肌細胞的橫截面積，每張切片隨機測量20個肌細胞，取平均數(shù)。

1.2.4術后視覺三級功能檢測

采用同視機和Titmus立體圖檢測患者視覺3級功能，Ⅰ級同時視：采用猴子和熊貓圖片檢測有無同時視；Ⅱ級融合功能：在Ⅰ級基礎上用貓捉蝴蝶圖片檢測有無融合功能和融合范圍；Ⅲ級立體視：采用Titmus立體圖檢測近距離立體視情況，患者配戴偏振光鏡片，觀察不同級別圓環(huán)圖，記錄患者能否分辨出凹凸層次感的最小視差，≤60″者記為立體視功能正常，>60″者即無正常立體視。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 斜視組和對照組眼外肌MYH13 mRNA表達水平比較

斜視組眼外肌MYH13 mRNA相對表達水平為0.21±0.06，對照組為0.79±0.20，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1、2。

M：Marker；a：對照組；b：斜視組。

圖2 qRT-PCR擴增曲線圖

2.2 斜視組和對照組眼外肌MYH13蛋白水平比較

斜視組眼外肌MYH13蛋白水平為0.19±0.05，對照組為0.71±0.15，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 斜視組和對照組眼外肌MYH13蛋白表達

2.3 MYH13水平與共同性外斜視患者內(nèi)直肌病理形態(tài)的關系

MYH13高表達組內(nèi)直肌肌纖維平均橫截面積、肌纖維含量高于MYH13低表達組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1、圖4。

表1 斜視組內(nèi)直肌病理形態(tài)學比較

A：MYH13高表達組；B：MYH13低表達組；箭頭：肌纖維。

2.4 眼外肌MYH13水平與共同性外斜視患者術后斜視度數(shù)比較

術后6個月，MYH13高表達組斜視度數(shù)明顯低于MYH13低表達組[4(2，5)°vs.9(5，12)°],差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.5 眼外肌MYH13水平與共同性外斜視患者術后視覺三級功能的關系

術后6個月，MYH13高表達組同時視、融合范圍、立體視高于MYH13低表達組(P<0.05)，兩組融合功能比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 斜視組術后視覺三級功能比較

3 討 論

共同性斜視以雙眼視覺不穩(wěn)定或未鞏固完善的兒童多見，6歲前多發(fā)，3歲內(nèi)為發(fā)病最集中年齡段，發(fā)病率為0.43%～1.70%，而12歲后發(fā)病率明顯降低[6]。在兒童時期，斜視可導致出現(xiàn)弱視、雙眼障礙等不可逆性的視覺中樞缺陷，成人期發(fā)病，則可導致復視發(fā)生[7]。斜視不僅導致患者雙眼視覺功能障礙，還影響患者面部美感，同時給患者造成嚴重心理創(chuàng)傷。因此，尋找該病發(fā)病機制及有效治療方法成為醫(yī)學研究的熱點。

眼外肌是控制眼球運動的肌肉，由4條直肌與2條斜肌組成，有較強的收縮性與抗疲勞性，眼外肌的橫紋肌的低張力、高速度的收縮特性和眼外肌型肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MHC)的表達密切相關，而眼外肌型MHC主要由MYH13編碼[8-9]。MYH13是人類17號染色體快速/發(fā)育MYH基因簇的重要成員之一，也是祖先骨骼肌與心肌肌球蛋白分化后在快速/發(fā)育簇中出現(xiàn)的第1個特異性肌球蛋白，具有物種間高度保守性，對眼外肌收縮特性有重要調(diào)控作用[10]。CHENG等[11]對黑暗飼養(yǎng)大鼠和單眼剝奪的猴子模型進行研究發(fā)現(xiàn)，眼外肌轉(zhuǎn)錄組發(fā)生改變，在斜視、弱視及先天性白內(nèi)障模型中MYH13表達受到抑制，導致視覺運動發(fā)育不良。田亮等[12]研究發(fā)現(xiàn)，共同性內(nèi)斜視患者眼外肌MYH13表達缺失，在其發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究結果顯示，共同性外斜視組眼外肌MYH13 mRNA水平與蛋白水平表達均低于對照組，與上述結果相似，提示共同性外斜視患者眼外肌MYH13低表達。研究發(fā)現(xiàn)，共同性外斜視患者內(nèi)直肌肌纖維橫截面積明顯減小，肌纖維數(shù)量減少，排列紊亂及膠原纖維增生等病理性改變[13]。本研究結果顯示，MYH13高表達組內(nèi)直肌肌纖維平均橫截面積、肌纖維含量高于MYH13低表達組，提示MYH13高表達共同性外斜視患者內(nèi)直肌病變程度較輕，推測MYH13高表達可能有利于內(nèi)直肌中肌球蛋白維持在較高水平，有利于內(nèi)直肌結構及功能維持[10]。

斜視是造成雙眼視覺功能異常最主要疾病之一，斜視和雙眼視覺功能之間的關系一直是醫(yī)學研究的熱點[14]。雙眼視覺是最完善的高級視覺功能，主要分為同時視、融合功能及立體視三級[15-16]。斜視不僅能對兒童時期雙眼視覺造成影響，同時也可破壞發(fā)育成熟的雙眼視覺，雙眼視覺功能的恢復及重建是斜視治療的首要目的，也是術后預后評定的重要指標之一[17-18]。本研究結果顯示，術后6個月，MYH13高表達組共同性外斜視患者斜視度數(shù)低于MYH13低表達組，同時視、融合范圍、立體視均優(yōu)于MYH13低表達組，提示MYH13高表達共同性外斜視患者術后斜視矯正效果較優(yōu)，雙眼視覺功能恢復較好，推測MYH13高表達可能有助于共同性外斜視患者眼外肌結構恢復，從而有利于其視覺功能恢復。

綜上所述，共同性外斜視患者眼外肌MYH13 mRNA與蛋白水平均低表達，MYH13高表達患者內(nèi)直肌肌纖維平均橫截面積較大、肌纖維含量較高，有利于術后斜視度數(shù)矯正和雙眼視覺功能恢復。然而本研究樣本量較少，為單中心研究，且未對不同年齡段患者進行區(qū)分研究，可能會造成一定結果偏差，后續(xù)研究將擴大樣本量、豐富類型進一步驗證。