邢海燕 劉玉萍 蔣祥亮 陳 彥

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇南京 210028；2.江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥組分與微生態(tài)研究中心，江蘇南京 210028；3.江蘇省中醫(yī)藥研究院腫瘤科，江蘇南京 210028）

以表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）為靶點(diǎn)的抗腫瘤分子靶向治療藥物即EGFR抑制劑（EGFRI），如吉非替尼、厄洛替尼等，已被廣泛應(yīng)用于肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的治療[1]。然而，由于EGFR在體內(nèi)的分布特點(diǎn)，該類藥物對皮膚及其附屬器官具有特殊的不良反應(yīng)，其中以皮膚毒性最為常見也最難以耐受，一般于用藥后1周左右出現(xiàn)，發(fā)生率高達(dá)79%～88%。臨床大數(shù)據(jù)顯示，44%～100%服用EGFRI的患者會出現(xiàn)丘疹膿皰型皮疹，21%的患者會出現(xiàn)毛發(fā)再生異常尤其表現(xiàn)在頭發(fā)和眼瞼處，12%～16%的患者會出現(xiàn)皮膚干燥發(fā)癢，還有12%～16%的患者則會出現(xiàn)甲周炎癥和牙痛感等[2-4]。臨床常采用局部使用抗生素、類固醇或口服抗生素、免疫調(diào)節(jié)劑及中藥進(jìn)行治療[5]。中醫(yī)認(rèn)為，這種藥物性皮疹屬“藥毒疹”“中藥毒”的范疇，主要由于患者素體稟賦不足，血熱內(nèi)蘊(yùn)，復(fù)感藥物特殊之毒，致風(fēng)、濕、熱毒等邪毒外達(dá)肌膚，多主張采用清熱解毒、清熱涼血、益氣養(yǎng)陰等治則治法進(jìn)行防治[6-7]。“消疹方”為江蘇省國醫(yī)名師徐荷芬主任團(tuán)隊(duì)常用的腫瘤輔助治療臨床驗(yàn)方，臨床對EGFRI所致皮疹具有較好的療效[8]。本研究我們建立了EGFRI致皮膚毒性小鼠模型，考察消疹方的療效，并對其作用機(jī)制進(jìn)行初步分析，為進(jìn)一步研發(fā)和臨床使用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 BALB/c小鼠（體質(zhì)量20 g左右，雌性），購自南通大學(xué)，合格證號：201702736，飼養(yǎng)于江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心。本動物實(shí)驗(yàn)符合國家及江蘇省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動物中心規(guī)定的倫理學(xué)要求。

1.2 藥物與試劑 鹽酸厄洛替尼（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，CAS號：183319-69-9）；消疹方中所有組成藥物飲片均購自江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房；脫毛膏（Nair公司）；克林霉素磷酸酯凝膠（湖北康正藥業(yè)有限公司）；干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-2、IL-6、IL-10及IL-12A炎癥因子Elisa試劑盒（凱基生物有限公司）。

1.3 主要儀器 酶標(biāo)儀（Thermo scientific，MULTISKAN GO）；倒置顯微鏡（奧林巴斯，IX73）；超低溫冰箱（TCL，BCD-118KA9）；超凈工作臺（ESCO公司，ESCOAC2）；純水儀（Millipore公司，TANKPE 060）；分析電子天平（上海良平儀器儀表有限公司，F(xiàn)A2104）；臺式高速離心機(jī)（長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司，TG16W）；調(diào)溫電熱套（江蘇省通州市張芝山鎮(zhèn)決心化工電器廠，DW-2型）；剃毛器（Codos公司CP-5000）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物制備 鹽酸厄洛替尼用去離子水配制成10 mg/mL的混懸液。消疹方水提液制備：取6倍處方量藥材（金銀花、紫草、土茯苓、連翹、浮萍、夏枯草、牡丹皮）共計(jì)840 g，加8.5 L水，煎煮1.5 h，提取2次，合并濾液，濃縮成4.50 g生藥量/mL的浸膏。

2.2 分組、造模與給藥 實(shí)驗(yàn)小鼠共35只，飼養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境后按照體重隨機(jī)分為空白對照組、模型組、消疹方低劑量組、消疹方高劑量組和陽性藥物組。除空白對照組外其余4組參考文獻(xiàn)[9]的方法造模，前期按每日150 mg/kg灌胃鹽酸厄洛替尼，約2周后皮膚毒性反應(yīng)開始出現(xiàn)，50 d左右達(dá)到高峰。50 d時通過肉眼觀察，各造模小鼠都出現(xiàn)了不同程度的四肢紅腫、毛發(fā)再生障礙及皰疹、皮疹，表明造模成功。造模第50日開始，在鹽酸厄洛替尼灌胃基礎(chǔ)上，消疹方低、高劑量組每日加用18 g/kg和45 g/kg消疹方水提液灌胃，并對小鼠患處進(jìn)行擦洗，陽性藥物組每日加用克林霉素磷酸酯凝膠涂抹患處，空白對照組和模型組灌胃等劑量生理鹽水。各組給藥或生理鹽水均每日1次，持續(xù)15 d，給藥期間同時白熾燈光照10 h/d。

2.3 指標(biāo)觀察

2.3.1 小鼠皮膚毒性的外觀和組織病理學(xué)觀察 干預(yù)期間觀察小鼠背部毛發(fā)再生狀況，四肢、嘴唇等裸露在外的皮膚變化。干預(yù)結(jié)束后，取小鼠背部皮膚做HE染色病理切片，觀察皮膚炎癥情況及表皮厚度。

2.3.2 免疫組化法檢測皮膚組織炎性蛋白表達(dá) 干預(yù)結(jié)束后，取小鼠皮膚組織于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，切成5 μm厚度的切片；0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH=6）修復(fù)抗原后，將切片用PBS洗滌3次，并用3%BSA封閉；將切片分別與信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（STAT3）、非受體酪氨酸激酶janus激酶1（JAK1）一抗進(jìn)行4 ℃孵育過夜，洗滌后，與二抗室溫孵育，PBS洗滌，DAB顯色試劑盒顯色。每個切片隨機(jī)選擇5個中等放大倍率顯微鏡場（×200），每組3張用ImageJ軟件計(jì)算陽性率并比較各組之間的差異。

2.3.3 Elisa法檢測血清炎癥因子 干預(yù)結(jié)束后，各組小鼠摘眼球取血，離心取血清，-80 ℃保存，根據(jù)試劑盒說明書采用Elisa法檢測各組小鼠血清IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-12A、IL-10及TNF-α含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用Graphpad prism 7.0軟件作圖，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩樣本間比較采用One-Way ANOVA檢驗(yàn)，多組間采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組小鼠皮膚毒性的外觀和組織病理學(xué)比較 藥物干預(yù)期間模型組小鼠毛發(fā)停止生長，頸部、肩部、眼周脫毛癥狀繼續(xù)加重，嘴周和四肢皰疹、皮疹等癥狀加重，活動狀態(tài)較差。給藥15 d后，與模型組比較，消疹方低、高劑量組和陽性藥物組小鼠毛發(fā)再生長，胡須、眼周部分脫毛癥狀減輕，四肢紅腫程度顯著改善。見圖1。組織病理學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)：與空白對照組比較，模型組可見表皮明顯增厚（P＜0.0001），角質(zhì)層細(xì)胞增厚，嗜中性粒細(xì)胞在毛囊管外集群致毛囊炎癥；各給藥組小鼠表皮厚度明顯小于模型組（P＜0.05，P＜0.01），炎癥細(xì)胞聚集程度也較模型組明顯減輕；消疹方各劑量組與陽性藥物組比較未見顯著性差異（P＞0.05），作用相當(dāng)。見圖2、圖3。

3.2 各組小鼠血清炎癥因子及皮膚組織STAT3、JAK1蛋白表達(dá)比較 結(jié)果見表1、圖4。與空白對照組比較，模型組小鼠血清IL-10、IL-12A、IL-2、TNF-α、IL-6、IFN-γ的表達(dá)均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，消疹方高劑量組與陽性藥物組IL-2、TNF-α、IL-6、IFN-γ表達(dá)顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），并接近空白對照組。表明消疹方防治厄洛替尼誘導(dǎo)的皮膚毒性可能與其下調(diào)炎癥因子有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，EGFRI可通過增加JAK/STAT3的表達(dá)來誘導(dǎo)基底角質(zhì)形成細(xì)胞生長的停止、早熟，中性粒細(xì)胞分化和炎性因子釋放。免疫組化結(jié)果證實(shí)鹽酸厄洛替尼顯著增加了模型組STAT3，JAK1的表達(dá)（P＜0.001，P＜0.0001），而消疹方水提液和陽性藥物可顯著減少這種異常高表達(dá)的炎癥蛋白（P＜0.05，P＜0.001，P＜0.0001），其中消疹方高劑量組與陽性藥物組作用相當(dāng)（P＞0.05），見圖5。上述結(jié)果提示消疹方通過減輕因EGFRI引起的皮膚炎癥起到皮膚保護(hù)的作用。

圖1 干預(yù)后各組小鼠背部、四肢、眼瞼及唇周皮膚情況比較

圖2 干預(yù)后各組小鼠皮膚組織病理學(xué)比較（×200）

圖3 干預(yù)后各組小鼠表皮厚度比較（n=3）

表1 干預(yù)后各組小鼠炎性細(xì)胞因子含量比較（） 單位：pg/mL

表1 干預(yù)后各組小鼠炎性細(xì)胞因子含量比較（） 單位：pg/mL

注：與空白對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

圖4 各組小鼠皮膚組織炎癥蛋白表達(dá)比較（×200）

圖5 各組小鼠皮膚組織炎癥蛋白表達(dá)比較

4 討論

厄洛替尼是一種分子靶向抗腫瘤藥物，在抗癌過程中可特異性地通過抑制人體細(xì)胞內(nèi)表皮生長因子上的一種特定酶的活性，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的形成、生長或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，達(dá)到抗腫瘤的目的。目前厄洛替尼被證實(shí)對晚期非小細(xì)胞肺癌具有可靠療效，能有效提高病人的帶瘤生存率。但在臨床使用的過程中，很多患者出現(xiàn)了不同程度的皮膚相關(guān)不良反應(yīng)，出現(xiàn)皮疹、干燥、瘙癢等，這種皮膚毒性往往被認(rèn)為是小分子靶向抗癌藥物起效的象征，然而卻影響了患者的生活質(zhì)量，嚴(yán)重的皮膚毒性甚至?xí)?dǎo)致腫瘤治療的中斷及抗腫瘤治療的失敗。因此，對于EGFRI所致的皮膚毒性的治療越來越受到重視，尋找相關(guān)的治療手段和藥物十分必要。

在動物模型建立方面，我們選用鹽酸厄洛替尼作為皮疹模型的誘導(dǎo)劑，并在給藥的過程中使用光照進(jìn)一步促進(jìn)皮膚不良反應(yīng)的產(chǎn)生。我們根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道選擇克林霉素磷酸酯凝膠作為陽性對照，克林霉素磷酸酯凝膠在臨床上常用于治療EGFR抑制劑所致腫瘤患者皮疹，具有較好的療效?？肆置顾亓姿狨ツz屬于抗生素類藥物[10]，長期使用會產(chǎn)生耐藥性，降低其療效，且EGFRI導(dǎo)致的皮膚毒性往往是全身性的，局部涂抹療效有限。消疹方具有清熱解毒、祛濕散結(jié)、涼血透疹的功效。方中金銀花、紫草為君，清熱解毒、涼血透疹；土茯苓、連翹、浮萍為臣，能夠加強(qiáng)疏風(fēng)、透疹、清熱、祛濕的作用；夏枯草、牡丹皮為佐，清熱、活血、散結(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)消疹方高劑量口服、擦洗給藥可達(dá)到與克林霉素磷酸酯凝膠類似的治療結(jié)果。

此外，在皮膚毒性的發(fā)生發(fā)展過程中，炎癥是其關(guān)鍵因素。有研究發(fā)現(xiàn)，血清中TNF-α、IL-6等炎癥因子的水平與皮膚毒性分級顯著相關(guān)[11]。TNF-α水平升高可刺激釋放并增加細(xì)胞因子（例如IL-2）的數(shù)量，導(dǎo)致細(xì)胞因子之間的平衡被打破；IL-6可以由很多細(xì)胞產(chǎn)生，如活化的T細(xì)胞和B細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞等，有炎癥產(chǎn)生時會促進(jìn)IL-6的表達(dá)[12-13]。本研究結(jié)果證實(shí)，鹽酸厄洛替尼可以誘導(dǎo)大多數(shù)促炎因子的釋放，例如IL-10、IL-2、IL-6、TNF-α和IL-12A，而消疹方水提液可以將它們降至正常水平。JAK-STAT信號通路功能廣泛，參與很多重要的生物過程，其中炎癥性疾病主要有銀屑病、特應(yīng)性皮炎、犬皮炎等[13]，在炎癥的過程中表達(dá)增多。本研究結(jié)果表明，消疹方水提液可以抑制鹽酸厄洛替尼誘導(dǎo)炎癥的產(chǎn)生從而產(chǎn)生皮膚保護(hù)作用。

綜上，消疹方水提液可以緩解鹽酸厄洛替尼所致皮膚毒性，改善生活質(zhì)量，其機(jī)制可能與其抗炎作用有關(guān)。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，我們將進(jìn)一步明確消疹方通過哪些具體的抗炎相關(guān)信號通路產(chǎn)生皮膚保護(hù)作用，也將繼續(xù)觀察消疹方水提液對鹽酸厄洛替尼抗腫瘤效果的影響，還將優(yōu)化消疹方水提液的提取方案，盡可能多保留其揮發(fā)性成分。