叢 微,喻海茫,于晶晶,李迪強(qiáng),張于光,*

1 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所,國(guó)家林業(yè)和草原局生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100091

2 湖南省長(zhǎng)沙縣職業(yè)中專(zhuān)學(xué)校, 長(zhǎng)沙 410142

土壤中存在著最豐富多樣的微生物,其不同的生理特性與功能直接影響生態(tài)環(huán)境,驅(qū)動(dòng)生物地球化學(xué)物質(zhì)循環(huán)[1-4]。土壤微生物是地上植物群落和土壤養(yǎng)分循環(huán)聯(lián)系的關(guān)鍵紐帶[5-7],同時(shí),土壤微生物在構(gòu)建植物群落、維持植物多樣性和植物健康等方面也發(fā)揮著重要作用[8-9]。然而,土壤微生物多樣性的降低和群落結(jié)構(gòu)的變化會(huì)影響多種生態(tài)系統(tǒng)功能,如植物多樣性、有機(jī)質(zhì)降解和養(yǎng)分的循環(huán)與利用[10]。研究發(fā)現(xiàn),土地利用變化將引起土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化[11],從而導(dǎo)致微生物功能基因豐度和生態(tài)功能的變化[12]。

1 研究方法

1.1 土壤樣品采集

土壤樣品采集于黑龍江省雙寶山林場(chǎng),選取林地(RS0)、林地開(kāi)墾后種植人參3a(RS3)、種植人參4a(RS4)和已收獲人參(種植4a)的空地(AS4)。每種用地類(lèi)型設(shè)置3個(gè)重復(fù)樣地,樣地面積為10 m×10 m,樣地間隔超過(guò)20 m。采用多點(diǎn)采樣法采集0—10 cm土壤,每種用地類(lèi)型采集3份土壤樣品。土壤樣品分成兩部分放入標(biāo)記好的自封袋中,一部分常溫保存,用于土壤理化性質(zhì)分析；一部分冷凍(-20℃)保存,用于土壤DNA測(cè)定分析。

1.2 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

土壤理化性質(zhì)測(cè)定采用常規(guī)方法[20],包括土壤含水量、pH值、有機(jī)碳、全氮、全磷、全鉀、水解性氮、有效磷、速效鉀、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮的測(cè)定。

1.3 土壤細(xì)菌DNA提取及測(cè)序

使用PowerSoil試劑盒(QIAGEN,德國(guó))提取土壤樣品微生物DNA,通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性,并用NanoDrop2000檢測(cè)DNA溶液的濃度和純度。使用16S rRNA基因引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3)對(duì)細(xì)菌的V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增[21]。利用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司,美國(guó))切膠回收PCR產(chǎn)物,Tris_HCl洗脫,2%瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。通過(guò)MiSeq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序(美吉生物醫(yī)藥科技有限公司,上海)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

基于Trimmomatic、FLASH軟件平臺(tái)對(duì)測(cè)序得到的雙端序列數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接以及質(zhì)控過(guò)濾[22-23]；使用Usearch軟件按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列(不含單序列)進(jìn)行OTU聚類(lèi),在聚類(lèi)過(guò)程中去除嵌合體,得到OTU的代表序列并選出與OTU代表序列相似性在97%以上的序列,生成OTU數(shù)據(jù)表格[24]；采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析,并在各個(gè)水平統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的群落組成[25]。

土壤細(xì)菌α-多樣性由Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)倒數(shù)、Richness指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)表征。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)間的差異采用除趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析(Detrended correspondence analysis,DCA)表征,基于非線(xiàn)性模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行排序分析的方法。典范對(duì)應(yīng)分析(Canonical correspondence analysis, CCA)和Partial Mantel Test分析影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子,在進(jìn)行CCA分析時(shí),首先通過(guò)方差膨脹因子(Variance inflation factor, VIF)剔除共線(xiàn)性嚴(yán)重的環(huán)境因子,即保留VIF值小于20的環(huán)境因子,再進(jìn)行CCA分析。利用Tax4Fun工具對(duì)群落功能進(jìn)行預(yù)測(cè),Tax4Fun是基于SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)與KEGG數(shù)據(jù)中原核分類(lèi)間的線(xiàn)性關(guān)系將16S的OTU信息進(jìn)行功能預(yù)測(cè)的軟件[26]。

2 結(jié)果

2.1 土壤養(yǎng)分和理化性質(zhì)的變化

種植人參后,土壤pH值隨種植人參時(shí)間的增加而降低,土壤出現(xiàn)酸化的趨勢(shì)。土壤的水分、有機(jī)碳、全氮、速效鉀含量顯著降低,而全鉀、硝態(tài)氮含量顯著升高(表1)。

表1 土壤理化性質(zhì)

2.2 土壤細(xì)菌的物種組成

對(duì)土壤樣品16S rRNA測(cè)序及物種注釋,共得到10416個(gè)OTU,屬于36個(gè)門(mén)類(lèi)和550個(gè)屬類(lèi)。在門(mén)水平上,相對(duì)豐度大于1%的門(mén)類(lèi)共有9個(gè),其中變形菌門(mén)(Proteobacteria, 26.18%)、放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria, 21.64%)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria, 18.86%)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia, 7.62%)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi, 5.97%)是主要門(mén)類(lèi),共占群落組成的80.26%。以林地RS0為對(duì)照,對(duì)不同種植時(shí)間的人參土壤細(xì)菌群落組成分析可知(表2),變形菌門(mén)相對(duì)豐度在RS0樣地中最高,種植人參后變形菌門(mén)的相對(duì)豐度表現(xiàn)出降低的趨勢(shì),其中AS4的變形菌相對(duì)豐度顯著小于RS0。放線(xiàn)菌門(mén)相對(duì)豐度在種植人參后顯著增加,在RS3樣地中相對(duì)豐度達(dá)到最高,隨著種植時(shí)間的增加相對(duì)豐度表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。酸桿菌門(mén)栽參后其相對(duì)豐度顯著降低,而疣微菌門(mén)和綠彎菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著增加。在屬水平上,相對(duì)豐度大于1%的屬共有20個(gè)(表3),隨著種植時(shí)間的增加,屬Sphingomonas相對(duì)豐度先增加后降低；屬Kofleria、Gp6和Gp4相對(duì)豐度顯著降低；屬Ktedonobacter相對(duì)豐度顯著增加。

表2 土壤細(xì)菌門(mén)水平的相對(duì)豐度/%

表3 四個(gè)樣地中相對(duì)豐度大于1%的屬

2.3 土壤細(xì)菌群落的多樣性

對(duì)土壤細(xì)菌α-多樣性分析結(jié)果表明(表4),林地開(kāi)墾種植人參后,土壤細(xì)菌的多樣性顯著降低,隨種植時(shí)間的增加其多樣性變化無(wú)顯著差異。DCA探究人參土壤細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)分布,從圖1可以看出不同種植時(shí)間的人參樣地群落結(jié)構(gòu)有著明顯的區(qū)分,特別地栽參地(RS3, RS4, AS4)與對(duì)照樣地(RS0)的細(xì)菌群落差異顯著,主成分一解釋度為30.8%,主成分二解釋度為12.9%。

表4 土壤細(xì)菌α-多樣性

圖1 土壤細(xì)菌群落除趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析

2.4 土壤細(xì)菌群落與環(huán)境的關(guān)系

利用CCA分析影響人參土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的環(huán)境因子,根據(jù)方差膨脹因子選入7個(gè)環(huán)境因子。由CCA排序圖可知(圖2),CCA第一軸與速效鉀和pH具有正相關(guān)關(guān)系,與全鉀呈負(fù)相關(guān),表明土壤pH、速效鉀和全鉀是影響土壤微生物的重要因素。由Partial Mantel Test(表5)分析可知,速效鉀和全鉀對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有最顯著的影響(r=0.669,P<0.001和r=0.579,P<0.001),土壤pH次之(r=0.478,P=0.012)。因此,速效鉀、全鉀和土壤pH可能是影響土壤微生物的重要環(huán)境因素。

表5 土壤細(xì)菌全部OTUs與環(huán)境因子之間的Partial Mantel分析

圖2 土壤細(xì)菌群落與環(huán)境因子之間的典范對(duì)應(yīng)分析

2.5 細(xì)菌Tax4Fun功能預(yù)測(cè)分析

基于SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù),通過(guò)Tax4Fun工具對(duì)16S的OTU信息進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。結(jié)果共獲得41種二級(jí)(Level 2)功能分組和279種三級(jí)(Level 3)功能分組,其中有6種三級(jí)功能組相對(duì)豐度大于2%,包括ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(8.00%)、雙組分系統(tǒng)(7.50%)、嘌呤代謝(3.01%)、氨酰生物合成(2.59%)、嘧啶代謝(2.07%)、氮代謝(2.01%)。RS3、RS4、AS4與RS0各組間存在顯著差異的KEGG代謝途徑第二層分類(lèi)以及在各組的比例如圖3所示,人參種植3a后,氨基酸代謝相對(duì)豐度最高且顯著增加,萜類(lèi)化合物和聚酮類(lèi)化合物代謝功能、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的相對(duì)豐度顯著降低。人參種植4a后,核酸代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能和碳水化合物代謝的相對(duì)豐度增加,萜類(lèi)化合物和聚酮類(lèi)化合物代謝相對(duì)豐度顯著降低。收獲后的4a生人參樣地中,核酸代謝和碳水化合物代謝功能的相對(duì)豐度顯著增加,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的相對(duì)豐度顯著降低(圖3)。

圖3 基于Tax4Fun預(yù)測(cè)的細(xì)菌功能分組差異表達(dá)(二級(jí)功能分組)

3 討論

人參種植對(duì)土壤養(yǎng)分和理化性質(zhì)產(chǎn)生了直接影響,可能直接產(chǎn)生連作障礙[15-16,27]。人參適于在土壤pH值為5.5—6.5范圍內(nèi)生長(zhǎng),土壤酸化是人參連作障礙的原因之一,酸性土壤可能顯著增加人參根系病害的發(fā)生,許多土傳病害受土壤pH值的影響,例如,由Cylindrocarpondestructans引起的人參根腐病在酸性土壤中的發(fā)病率更高[28]。本研究發(fā)現(xiàn)林地開(kāi)墾栽參后,土壤有機(jī)碳、全氮、速效鉀等養(yǎng)分和土壤pH顯著降低,表明人參種植后對(duì)土壤養(yǎng)分的吸收利用,導(dǎo)致有機(jī)碳含量下降,氮磷鉀等營(yíng)養(yǎng)元素失衡,致使土壤出現(xiàn)酸化趨勢(shì),從而可能導(dǎo)致人參連作障礙。土壤酸化由多種原因?qū)е?相關(guān)研究表明,人參根系過(guò)量攝取陽(yáng)離子以及硝化過(guò)程釋放大量離子導(dǎo)致土壤pH降低[15]；由于土壤微生物的代謝活動(dòng)和人參根系產(chǎn)生大量有機(jī)酸導(dǎo)致[29]；人參生長(zhǎng)發(fā)育早期,氮和鉀元素的缺失導(dǎo)致有機(jī)酸和酚酸的分泌致使土壤pH降低[30]；隨人參栽培年限的增加,營(yíng)養(yǎng)元素供應(yīng)不平衡以及土壤吸收性能變差導(dǎo)致土壤趨于酸化[16]。謝忠凱等[31]認(rèn)為硝態(tài)氮含量與氮肥施用量、土壤硝化作用強(qiáng)弱以及硝態(tài)氮具有較強(qiáng)的隨水移動(dòng)性有關(guān)。本研究中,種植人參后土壤硝態(tài)氮含量顯著增加,而土壤含水量表現(xiàn)出下降的趨勢(shì),可能由于硝態(tài)氮隨水移動(dòng)性減弱,空間上的限制導(dǎo)致人參根系吸收硝態(tài)氮受阻,從而在土壤中大量積累增加人參根系銹病發(fā)生率[32],影響人參生長(zhǎng)。

連作影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和組成,抑制有益微生物的生長(zhǎng),加快病原菌的繁殖,進(jìn)而影響植物健康[33]。本研究中,林地開(kāi)墾種植人參后,土壤中酸桿菌門(mén)相對(duì)豐度降低,可能受栽參后土壤碳、氮含量變化的影響[34-35]。已有研究表明,酸桿菌門(mén)具有利用不同碳底物和降解木聚糖、半纖維素等復(fù)雜底物的能力,在土壤中硝酸鹽、亞硝酸鹽、一氧化碳還原和鐵氧化還原等方面具有重要作用[19],而土壤中金屬元素的積累和較高硝酸鹽濃度可增加人參根系銹病發(fā)生率[27,32],因此,酸桿菌門(mén)相對(duì)豐度的減少可能導(dǎo)致土壤中硝酸鹽、亞硝酸鹽和鐵等金屬含量的增加,不利于人參的生長(zhǎng)。Dong等人[18]對(duì)人參根際微生物群落研究發(fā)現(xiàn),人參根際微生態(tài)的變化與人參的種植時(shí)間和發(fā)育階段有關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn),在屬水平,隨著種植時(shí)間的增加,屬Sphingomonas相對(duì)豐度先增加后降低,屬Kofleria、Gp6和Gp4相對(duì)豐度顯著降低,屬Ktedonobacter相對(duì)豐度顯著增加。

土壤微生物群落和代謝功能的變化是影響植物連作的主要因素[36],不同生長(zhǎng)年限的人參由于其根系類(lèi)型差異和根系分泌物促進(jìn)了人參微生物群落的變化[18]。萜類(lèi)化合物是植物次生代謝產(chǎn)物,大多數(shù)萜類(lèi)化合物對(duì)植物的抗病性、抗逆性和各種生物相互作用有關(guān)[37]。研究發(fā)現(xiàn),免疫變化與信號(hào)的改變有關(guān)[38-39]。本研究通過(guò)Tax4Fun功能預(yù)測(cè),對(duì)不同生長(zhǎng)年限的人參在代謝水平分析發(fā)現(xiàn),人參種植后,萜類(lèi)化合物和聚酮類(lèi)化合物代謝與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的相對(duì)豐度顯著降低,這種代謝水平上的變化可能是導(dǎo)致人參連作障礙的主要因素。在RS4和AS4中,膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能的相對(duì)豐度高于RS0,與Wu[40]研究一致,發(fā)現(xiàn)在患根腐病三七的根際土壤具有較高的膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能,這加快了細(xì)菌的移動(dòng)和侵染根系的速度。此外,本研究發(fā)現(xiàn)與人參生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的代謝途徑主要有碳水化合物代謝、氨基酸代謝和核酸代謝,其相對(duì)豐度的增加可能會(huì)抑制土壤中病害的傳播,但這也是一個(gè)消耗能量的過(guò)程[40]。

4 結(jié)論

本研究表明,林地開(kāi)墾種植人參后,土壤酸化明顯,土壤養(yǎng)分、土壤微生物多樣性和微生物群落結(jié)構(gòu)等都發(fā)生了明顯變化。CCA和Partial Mantel Test確定了影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的環(huán)境因子是土壤速效鉀、全鉀和土壤pH,土壤pH可能通過(guò)調(diào)節(jié)土壤營(yíng)養(yǎng)而影響細(xì)菌群落,表明土壤養(yǎng)分變化可能是土壤微生物群落變化的重要因素。功能預(yù)測(cè)表明萜類(lèi)化合物和聚酮類(lèi)化合物代謝與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的相對(duì)豐度顯著降低,而膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能的相對(duì)豐度增加。研究間接證明了林地栽參后土壤微生態(tài)失衡和根系酸化可能是人參連作障礙的部分原因。因而,通過(guò)提高土壤肥力和調(diào)節(jié)微生態(tài)平衡,有利于減輕人參連作障礙,進(jìn)而提高人參的產(chǎn)量和質(zhì)量。