叢 微,喻海茫,于晶晶,李迪強,張于光,*

1 中國林業(yè)科學研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所,國家林業(yè)和草原局生物多樣性保護重點實驗室, 北京 100091

2 湖南省長沙縣職業(yè)中專學校, 長沙 410142

土壤中存在著最豐富多樣的微生物,其不同的生理特性與功能直接影響生態(tài)環(huán)境,驅動生物地球化學物質循環(huán)[1-4]。土壤微生物是地上植物群落和土壤養(yǎng)分循環(huán)聯(lián)系的關鍵紐帶[5-7],同時,土壤微生物在構建植物群落、維持植物多樣性和植物健康等方面也發(fā)揮著重要作用[8-9]。然而,土壤微生物多樣性的降低和群落結構的變化會影響多種生態(tài)系統(tǒng)功能,如植物多樣性、有機質降解和養(yǎng)分的循環(huán)與利用[10]。研究發(fā)現(xiàn),土地利用變化將引起土壤微生物群落結構的變化[11],從而導致微生物功能基因豐度和生態(tài)功能的變化[12]。

1 研究方法

1.1 土壤樣品采集

土壤樣品采集于黑龍江省雙寶山林場,選取林地(RS0)、林地開墾后種植人參3a(RS3)、種植人參4a(RS4)和已收獲人參(種植4a)的空地(AS4)。每種用地類型設置3個重復樣地,樣地面積為10 m×10 m,樣地間隔超過20 m。采用多點采樣法采集0—10 cm土壤,每種用地類型采集3份土壤樣品。土壤樣品分成兩部分放入標記好的自封袋中,一部分常溫保存,用于土壤理化性質分析；一部分冷凍(-20℃)保存,用于土壤DNA測定分析。

1.2 土壤理化性質測定

土壤理化性質測定采用常規(guī)方法[20],包括土壤含水量、pH值、有機碳、全氮、全磷、全鉀、水解性氮、有效磷、速效鉀、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮的測定。

1.3 土壤細菌DNA提取及測序

使用PowerSoil試劑盒(QIAGEN,德國)提取土壤樣品微生物DNA,通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性,并用NanoDrop2000檢測DNA溶液的濃度和純度。使用16S rRNA基因引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3)對細菌的V3-V4區(qū)進行擴增[21]。利用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司,美國)切膠回收PCR產物,Tris_HCl洗脫,2%瓊脂糖電泳檢測PCR產物。通過MiSeq PE300平臺進行測序(美吉生物醫(yī)藥科技有限公司,上海)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

基于Trimmomatic、FLASH軟件平臺對測序得到的雙端序列數(shù)據(jù)進行拼接以及質控過濾[22-23]；使用Usearch軟件按照97%相似性對非重復序列(不含單序列)進行OTU聚類,在聚類過程中去除嵌合體,得到OTU的代表序列并選出與OTU代表序列相似性在97%以上的序列,生成OTU數(shù)據(jù)表格[24]；采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析,并在各個水平統(tǒng)計每個樣品的群落組成[25]。

土壤細菌α-多樣性由Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)倒數(shù)、Richness指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)表征。細菌群落結構間的差異采用除趨勢對應分析(Detrended correspondence analysis,DCA)表征,基于非線性模型對數(shù)據(jù)進行排序分析的方法。典范對應分析(Canonical correspondence analysis, CCA)和Partial Mantel Test分析影響細菌群落結構的主要環(huán)境因子,在進行CCA分析時,首先通過方差膨脹因子(Variance inflation factor, VIF)剔除共線性嚴重的環(huán)境因子,即保留VIF值小于20的環(huán)境因子,再進行CCA分析。利用Tax4Fun工具對群落功能進行預測,Tax4Fun是基于SILVA數(shù)據(jù)庫與KEGG數(shù)據(jù)中原核分類間的線性關系將16S的OTU信息進行功能預測的軟件[26]。

2 結果

2.1 土壤養(yǎng)分和理化性質的變化

種植人參后,土壤pH值隨種植人參時間的增加而降低,土壤出現(xiàn)酸化的趨勢。土壤的水分、有機碳、全氮、速效鉀含量顯著降低,而全鉀、硝態(tài)氮含量顯著升高(表1)。

表1 土壤理化性質

2.2 土壤細菌的物種組成

對土壤樣品16S rRNA測序及物種注釋,共得到10416個OTU,屬于36個門類和550個屬類。在門水平上,相對豐度大于1%的門類共有9個,其中變形菌門(Proteobacteria, 26.18%)、放線菌門(Actinobacteria, 21.64%)、酸桿菌門(Acidobacteria, 18.86%)、疣微菌門(Verrucomicrobia, 7.62%)、綠彎菌門(Chloroflexi, 5.97%)是主要門類,共占群落組成的80.26%。以林地RS0為對照,對不同種植時間的人參土壤細菌群落組成分析可知(表2),變形菌門相對豐度在RS0樣地中最高,種植人參后變形菌門的相對豐度表現(xiàn)出降低的趨勢,其中AS4的變形菌相對豐度顯著小于RS0。放線菌門相對豐度在種植人參后顯著增加,在RS3樣地中相對豐度達到最高,隨著種植時間的增加相對豐度表現(xiàn)出下降的趨勢。酸桿菌門栽參后其相對豐度顯著降低,而疣微菌門和綠彎菌門的相對豐度顯著增加。在屬水平上,相對豐度大于1%的屬共有20個(表3),隨著種植時間的增加,屬Sphingomonas相對豐度先增加后降低；屬Kofleria、Gp6和Gp4相對豐度顯著降低；屬Ktedonobacter相對豐度顯著增加。

表2 土壤細菌門水平的相對豐度/%

表3 四個樣地中相對豐度大于1%的屬

2.3 土壤細菌群落的多樣性

對土壤細菌α-多樣性分析結果表明(表4),林地開墾種植人參后,土壤細菌的多樣性顯著降低,隨種植時間的增加其多樣性變化無顯著差異。DCA探究人參土壤細菌群落的結構分布,從圖1可以看出不同種植時間的人參樣地群落結構有著明顯的區(qū)分,特別地栽參地(RS3, RS4, AS4)與對照樣地(RS0)的細菌群落差異顯著,主成分一解釋度為30.8%,主成分二解釋度為12.9%。

表4 土壤細菌α-多樣性

圖1 土壤細菌群落除趨勢對應分析

2.4 土壤細菌群落與環(huán)境的關系

利用CCA分析影響人參土壤細菌群落結構的環(huán)境因子,根據(jù)方差膨脹因子選入7個環(huán)境因子。由CCA排序圖可知(圖2),CCA第一軸與速效鉀和pH具有正相關關系,與全鉀呈負相關,表明土壤pH、速效鉀和全鉀是影響土壤微生物的重要因素。由Partial Mantel Test(表5)分析可知,速效鉀和全鉀對土壤細菌群落結構具有最顯著的影響(r=0.669,P<0.001和r=0.579,P<0.001),土壤pH次之(r=0.478,P=0.012)。因此,速效鉀、全鉀和土壤pH可能是影響土壤微生物的重要環(huán)境因素。

表5 土壤細菌全部OTUs與環(huán)境因子之間的Partial Mantel分析

圖2 土壤細菌群落與環(huán)境因子之間的典范對應分析

2.5 細菌Tax4Fun功能預測分析

基于SILVA數(shù)據(jù)庫與KEGG數(shù)據(jù)庫,通過Tax4Fun工具對16S的OTU信息進行功能預測。結果共獲得41種二級(Level 2)功能分組和279種三級(Level 3)功能分組,其中有6種三級功能組相對豐度大于2%,包括ABC轉運蛋白(8.00%)、雙組分系統(tǒng)(7.50%)、嘌呤代謝(3.01%)、氨酰生物合成(2.59%)、嘧啶代謝(2.07%)、氮代謝(2.01%)。RS3、RS4、AS4與RS0各組間存在顯著差異的KEGG代謝途徑第二層分類以及在各組的比例如圖3所示,人參種植3a后,氨基酸代謝相對豐度最高且顯著增加,萜類化合物和聚酮類化合物代謝功能、信號轉導功能的相對豐度顯著降低。人參種植4a后,核酸代謝、膜轉運功能和碳水化合物代謝的相對豐度增加,萜類化合物和聚酮類化合物代謝相對豐度顯著降低。收獲后的4a生人參樣地中,核酸代謝和碳水化合物代謝功能的相對豐度顯著增加,信號轉導功能的相對豐度顯著降低(圖3)。

圖3 基于Tax4Fun預測的細菌功能分組差異表達(二級功能分組)

3 討論

人參種植對土壤養(yǎng)分和理化性質產生了直接影響,可能直接產生連作障礙[15-16,27]。人參適于在土壤pH值為5.5—6.5范圍內生長,土壤酸化是人參連作障礙的原因之一,酸性土壤可能顯著增加人參根系病害的發(fā)生,許多土傳病害受土壤pH值的影響,例如,由Cylindrocarpondestructans引起的人參根腐病在酸性土壤中的發(fā)病率更高[28]。本研究發(fā)現(xiàn)林地開墾栽參后,土壤有機碳、全氮、速效鉀等養(yǎng)分和土壤pH顯著降低,表明人參種植后對土壤養(yǎng)分的吸收利用,導致有機碳含量下降,氮磷鉀等營養(yǎng)元素失衡,致使土壤出現(xiàn)酸化趨勢,從而可能導致人參連作障礙。土壤酸化由多種原因導致,相關研究表明,人參根系過量攝取陽離子以及硝化過程釋放大量離子導致土壤pH降低[15]；由于土壤微生物的代謝活動和人參根系產生大量有機酸導致[29]；人參生長發(fā)育早期,氮和鉀元素的缺失導致有機酸和酚酸的分泌致使土壤pH降低[30]；隨人參栽培年限的增加,營養(yǎng)元素供應不平衡以及土壤吸收性能變差導致土壤趨于酸化[16]。謝忠凱等[31]認為硝態(tài)氮含量與氮肥施用量、土壤硝化作用強弱以及硝態(tài)氮具有較強的隨水移動性有關。本研究中,種植人參后土壤硝態(tài)氮含量顯著增加,而土壤含水量表現(xiàn)出下降的趨勢,可能由于硝態(tài)氮隨水移動性減弱,空間上的限制導致人參根系吸收硝態(tài)氮受阻,從而在土壤中大量積累增加人參根系銹病發(fā)生率[32],影響人參生長。

連作影響土壤微生物群落結構和組成,抑制有益微生物的生長,加快病原菌的繁殖,進而影響植物健康[33]。本研究中,林地開墾種植人參后,土壤中酸桿菌門相對豐度降低,可能受栽參后土壤碳、氮含量變化的影響[34-35]。已有研究表明,酸桿菌門具有利用不同碳底物和降解木聚糖、半纖維素等復雜底物的能力,在土壤中硝酸鹽、亞硝酸鹽、一氧化碳還原和鐵氧化還原等方面具有重要作用[19],而土壤中金屬元素的積累和較高硝酸鹽濃度可增加人參根系銹病發(fā)生率[27,32],因此,酸桿菌門相對豐度的減少可能導致土壤中硝酸鹽、亞硝酸鹽和鐵等金屬含量的增加,不利于人參的生長。Dong等人[18]對人參根際微生物群落研究發(fā)現(xiàn),人參根際微生態(tài)的變化與人參的種植時間和發(fā)育階段有關。本研究也發(fā)現(xiàn),在屬水平,隨著種植時間的增加,屬Sphingomonas相對豐度先增加后降低,屬Kofleria、Gp6和Gp4相對豐度顯著降低,屬Ktedonobacter相對豐度顯著增加。

土壤微生物群落和代謝功能的變化是影響植物連作的主要因素[36],不同生長年限的人參由于其根系類型差異和根系分泌物促進了人參微生物群落的變化[18]。萜類化合物是植物次生代謝產物,大多數(shù)萜類化合物對植物的抗病性、抗逆性和各種生物相互作用有關[37]。研究發(fā)現(xiàn),免疫變化與信號的改變有關[38-39]。本研究通過Tax4Fun功能預測,對不同生長年限的人參在代謝水平分析發(fā)現(xiàn),人參種植后,萜類化合物和聚酮類化合物代謝與信號轉導功能的相對豐度顯著降低,這種代謝水平上的變化可能是導致人參連作障礙的主要因素。在RS4和AS4中,膜轉運功能的相對豐度高于RS0,與Wu[40]研究一致,發(fā)現(xiàn)在患根腐病三七的根際土壤具有較高的膜轉運功能,這加快了細菌的移動和侵染根系的速度。此外,本研究發(fā)現(xiàn)與人參生長發(fā)育相關的代謝途徑主要有碳水化合物代謝、氨基酸代謝和核酸代謝,其相對豐度的增加可能會抑制土壤中病害的傳播,但這也是一個消耗能量的過程[40]。

4 結論

本研究表明,林地開墾種植人參后,土壤酸化明顯,土壤養(yǎng)分、土壤微生物多樣性和微生物群落結構等都發(fā)生了明顯變化。CCA和Partial Mantel Test確定了影響土壤細菌群落結構的環(huán)境因子是土壤速效鉀、全鉀和土壤pH,土壤pH可能通過調節(jié)土壤營養(yǎng)而影響細菌群落,表明土壤養(yǎng)分變化可能是土壤微生物群落變化的重要因素。功能預測表明萜類化合物和聚酮類化合物代謝與信號轉導功能的相對豐度顯著降低,而膜轉運功能的相對豐度增加。研究間接證明了林地栽參后土壤微生態(tài)失衡和根系酸化可能是人參連作障礙的部分原因。因而,通過提高土壤肥力和調節(jié)微生態(tài)平衡,有利于減輕人參連作障礙,進而提高人參的產量和質量。