韋杰,尹雅潔,,3,江偉,宋層業(yè),魏靈,廖志力,韓興林

1(四川省宜賓竹海酒業(yè)有限公司，四川 宜賓，644304) 2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，國家酒類品質(zhì)與安全國際聯(lián)合研究中心，北京，100015) 3(湖北師范大學 生命科學學院，食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室，湖北 黃石，435002)

竹葉是禾本科竹亞科植物的莖葉[1]，我國藥用歷史悠久。竹葉含有豐富的天然活性成分，如竹葉黃酮、竹葉多糖、內(nèi)酯、氨基酸等[2-5]。我國竹葉資源極其豐富，由于竹葉的開發(fā)利用價值大，現(xiàn)已成為我國食品行業(yè)的新材料，如將竹葉提取物用于食品的保鮮[6]、開發(fā)竹葉保健飲料[7]等。近年來，竹葉在我國釀酒行業(yè)的應用十分廣泛，竹葉提取物釀造黃酒能有效抑制發(fā)酵中產(chǎn)生的氨基甲酸乙酯[8]；以竹葉為釀造原輔料釀造濃香型竹酒[9]、清香型竹酒[10]、竹葉黃酒[11]、麻竹竹酒[12]等保健酒功效顯著。然而，隨著竹酒的開發(fā)，竹葉揮發(fā)性成分以及竹葉品種差異對竹酒風味的影響尚不清楚。因此，以竹葉為起點，研究不同品種竹葉的原始自然風味成分，可為后期竹類飲料或飲料酒的研究提供理論依據(jù)。

GC-MS是一種高效快速、準確度高、靈敏度大的分離分析技術，在食品、環(huán)保、生物等領域廣泛應用[13-16]，目前，已經(jīng)應用于鑒定竹葉中的揮發(fā)性成分[17-18]。而氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用結合固相微萃取技術(headspace solid phase micro extraction-GC-MS,HS-SPME-GC-MS)能一次性對復雜的混合物樣品進行分離、定性及定量分析。本文采用HS-SPME-GC-MS技術對麻竹、黃竹、綿竹、箭竹、慈竹、苦竹及斑竹葉7種竹葉的揮發(fā)性物質(zhì)進行定性定量分析，并結合統(tǒng)計學分析竹葉品種差異，為今后不同香型、不同品種竹酒風味的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

共收集了7種不同品種竹葉，經(jīng)鑒定分別為麻竹(DendrocalamuslatiflorusMunro)、黃竹(DendrocalamusmembranceusMunro)、綿竹(Lingnaniaintermedia)、箭竹(FargesiaspathaceaFranch)、慈竹(Neosinocalamusaffinis)、苦竹(Pleioblastusamarus)及斑竹(Phyllostachysbambusoidesf.lacrima-deae)。

乙酸乙醇、乙醇、芳樟醇、羅勒烯等色譜純標準品，賽默科有限公司；正構烷烴(C8～C40)混標 標準品(色譜純,質(zhì)量濃度 0.5 mg/mL)，國家標準品網(wǎng)整理提供。

1.2 儀器與設備

ST180-A蘇格電磁爐，廣東省中山市蘇格電器有限公司；Clarus 600型GC-MS聯(lián)用儀，美國PerkinElmer公司；HH-1數(shù)顯電子恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；固相微萃取進樣器、固相微萃取柱(50/30 μm，DVB/CAR/PDMS)，美國Supelco 。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

粉碎竹葉樣品，稱取3 g粉碎樣品于20 mL萃取瓶中，加蓋密封置于40 ℃水浴鍋中平衡15 min，采用固相微萃取吸附40 min后插入氣相色譜進樣口，250 ℃條件下解析5 min。

1.3.2 GC-MS分析條件

氣相色譜條件：DB-WAX ETR型色譜柱 (30 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱溫箱升溫程序：初始溫度35 ℃，恒溫2 min，以4 ℃/min升至230 ℃，保持7 min。進樣口溫度為250 ℃，載氣為He，流速為1.0 mL/min，不分流。

質(zhì)譜條件：電子轟擊(electron impact, EI)離子源，電子能量70 eV，傳輸線溫度240 ℃，離子源溫度240 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z55～500。

1.3.3 化合物定性

通過質(zhì)譜軟件處理化合物在GC-MS上的采集信息。首先，將分離的每1個色譜峰采用NIST譜庫2.2進行檢索和比對，當質(zhì)譜庫計算機檢索出物質(zhì)與樣品中物質(zhì)的匹配度高于90%時，再結合實際保留指數(shù)和參考保留指數(shù)的相近度，確定每1個色譜峰的物質(zhì)種類。

“真的??？那你可是我女兒的學長咯，她年底就要來悉尼大學報到了?！碧岬剿畠簳r，她的眼里如同能放出光芒般神采飛揚。“她學習成績可好了，省重點熊貓班前三……”

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010對數(shù)據(jù)進行匯總和制圖；采用SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進行顯著性分析(每組數(shù)據(jù)3次平行)以及主成分分析(principal component analysis, PCA)和聚類分析(cluster analysis, CA)。

2 結果與分析

2.1 不同品種竹葉的GC-MS圖譜分析

不同品種的竹葉樣品采用GC-MS檢測得到總離子流圖(圖1)。通過NIST譜庫2.2檢索、保留指數(shù)針對指紋圖譜進行物質(zhì)種類的鑒定。由于竹葉的揮發(fā)性主體和微量成分眾多，且各種揮發(fā)性物質(zhì)的含量差別非常顯著，因此除對樣品進行揮發(fā)性物質(zhì)的分析鑒定之外，還要針對所有物質(zhì)的相對含量進行深入地分析和研究。

a-斑竹;b-苦竹;c-慈竹;d-箭竹;e-綿竹;f-黃竹;g-麻竹圖1 七種竹葉的質(zhì)譜總離子流圖譜Fig.1 Mass spectrometric total ion flux spectrum of seven kinds of bamboo leaves

2.2 七種竹葉的揮發(fā)性物質(zhì)鑒定結果

7種品種的竹葉共檢測出142種揮發(fā)性成分，其中每一類占比較高的揮發(fā)性化合物共計46種詳細列出了相關的鑒定信息，結果如表1所示。不同品種竹葉在揮發(fā)性成分上差異較大，己醛、順-2-己烯醛、甲基庚烯酮、癸酸甲酯等10種揮發(fā)性成分在7種竹葉中均有檢出；芳樟醇、α-紫羅酮、乙酸等在6個竹葉品種中檢測出，部分揮發(fā)性成分為個別竹葉特有的物質(zhì)，如羅勒烯僅在麻竹葉中檢出，葉醇僅在黃竹葉中檢出。

2.3 七種竹葉的揮發(fā)性物質(zhì)對比分析

2.3.1 竹葉的化合物數(shù)量分析

針對7種竹葉的揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量進行統(tǒng)計分析，見圖2。7種竹葉檢測出的化合物在種類上略有差異，但并不顯著。7種竹葉均具有圖2中的九大類物質(zhì)，說明7種竹葉在揮發(fā)性化合物的種類方面具有較強的穩(wěn)定性和一致性。但不同品種的竹葉其揮發(fā)性物質(zhì)在數(shù)量上存在差異，麻、黃、綿、箭、慈、苦及斑竹葉分別檢測出71、52、51、62、63、52及53種揮發(fā)性成分。

圖2 七種竹葉中化合物數(shù)量的分類統(tǒng)計結果Fig.2 Statistical results of the number of compounds in seven kinds of bamboo leaves

2.3.2 竹葉中各類化合物相對含量分析

以每種化合物的峰面積占所有化合物的峰面積總和的比例作為該化合物的相對含量,進一步對7種竹葉的揮發(fā)性化合物相對含量進行分析，如圖3所示。7種竹葉中各類揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量從高到低分別為烴類(13.66%～44.00%)，醛類(19.08%～37.18%)，醇類(13.65%～30.85%)，酮類(6.38%～16.33%)，酯及內(nèi)酯(5.67%～14.35%)，萜類(0～11.18%)，酸類(0.68%～6.72%)，芳香類(0.29%～6.24%)，醚類(0～3.91%),雜環(huán)類(0～1.01%)。此外，7種竹葉在揮發(fā)性物質(zhì)含量上存在顯著差異，箭、慈竹葉中烴類物質(zhì)占比較大，分別為44.00%、30.68%；斑竹葉中醛類物質(zhì)相對含量較高，為37.18%；而黃竹和苦竹葉中醇類物質(zhì)占比較大，分別為24.07%、30.85%。

圖3 七種竹葉的化合物相對含量的統(tǒng)計分類結果Fig.3 Statistical classification results of the relative contents of seven kinds of bamboo leaves

竹葉的揮發(fā)性化合物較多，主要選取醛類、酮類、酯及內(nèi)酯、醇類和萜類5類與竹酒風味及功效密切相關的化合物進行下一步分析。以每種化合物的峰面積占其所在類別的總峰面積的比例作為該物質(zhì)的相對含量。選取每類化合物相對含量較高的3種物質(zhì)進行分析，結果見圖4。竹葉具有獨特的清香，這種芳香成分是天然香料的重要來源，能賦予竹酒特別的竹香。醛類物質(zhì)是竹葉芳香成分的基礎，不同的竹葉所含有的醛類物質(zhì)含量和組成不同[19-20]。竹葉芳香成分中醛類物質(zhì)以順-2-己烯醛為主，順-2-己烯醛為淡黃色液體，具有新鮮綠葉的清香，能調(diào)配食用香精[21]。李翔等[21]在麻竹葉揮發(fā)油成分中發(fā)現(xiàn)9種醛類,占揮發(fā)油總含量的21.37%；其中順-2-己烯醛是揮發(fā)油的重要成分，占比14.62%，與本研究結果類似。7種竹葉中醛類物質(zhì)含量較高的為順-2-己烯醛，在不同品種竹葉中相對含量分別為30.74%(麻竹葉)、62.26%(黃竹葉)、35.63%(綿竹葉)、52.24%(箭竹葉)、32.61%(慈竹葉)、26.14%(苦竹葉)、42.43%(斑竹葉)。

醛-1：順-2-己烯醛；醛-2：藏紅花醛；醛-3：苯甲醛；酮-1：α-紫羅酮；酮-2：β-紫羅酮；酮-3：甲基庚烯酮；酯-1：癸酸甲酯；酯-2：1H-四唑-5-乙酸乙酯；酯-3：二氫獼猴桃內(nèi)酯；醇-1：苯乙醇；醇-2：苯甲醇；醇-3：2,3-丁二醇；萜-1：芳樟醇；萜-2：α-法呢烯；萜-3：反式-橙花叔醇圖4 七種竹葉中揮發(fā)性物質(zhì)的統(tǒng)計分類結果Fig.4 Statistical classification results of volatile substances in seven kinds of bamboo leaves

此外，藏紅花醛僅在麻竹葉(17.69%)、綿竹葉(16.14%)、慈竹葉(14.75%)中檢出。而苯甲醛在苦竹葉(31.01%)和慈竹葉(26.57%)中相對含量較高。不同品種的竹葉在醛類成分上大致相同，但由于個別物質(zhì)的差異使每種竹葉具有獨特的竹葉芳香，可用于開發(fā)具有獨特清香的不同品種的竹酒。

酮類物質(zhì)不僅是竹葉芳香的來源,還是多種風味物質(zhì)的中間體。酮類物質(zhì)中α-紫羅酮和β-紫羅酮呈現(xiàn)紫羅蘭香氣，能較好地協(xié)調(diào)竹葉的其他芳香成分，促進竹葉特殊香氣的平衡。甲基庚烯酮具有檸檬草和乙酸異丁酯般的香氣，是醫(yī)藥、香料的重要中間物質(zhì)。7種竹葉中α-紫羅酮(0～53.33%)在綿竹葉(53.33%)、苦竹葉(52.65%)中相對含量較高，但α-紫羅酮在黃竹葉中未檢出。每種竹葉的β-紫羅酮(19.85%～26.92%)相差不大，而甲基庚烯酮在斑竹葉(27.91%)和箭竹葉(26.94%)中含量較高(圖4)。竹葉的酮類物質(zhì)不僅能平衡協(xié)調(diào)其主體芳香，更是不可忽視的活性成分。

酯類物質(zhì)具有令人愉悅的花香和水果香氣，對竹葉香氣具有重要貢獻。內(nèi)酯類物質(zhì)的香氣和其對應的酯類物質(zhì)類似，是不可忽視的香氣成分。酯類及內(nèi)酯類物質(zhì)的香氣怡人、留香持久，可能成為竹酒中不可或缺的一類呈香物質(zhì)。如圖4所示，7種竹葉中的酯及內(nèi)酯類物質(zhì)在種類及相對含量上差異較大，其中癸酸甲酯(23.84%～49.96%)、二氫獼猴桃內(nèi)酯(3.98%～19.67%)在7種竹葉均有檢出，是7種竹葉最主要的酯及內(nèi)酯類物質(zhì)。而1H-四唑-5-乙酸乙酯僅在麻、慈、苦竹葉中檢出，在麻竹葉中(24.84%)相對含量最高。

醇類物質(zhì)是竹葉中占比較高的物質(zhì)，也是竹酒的主要呈香呈味物質(zhì)。此外，醇類物質(zhì)還具有一定的抑菌效果。由圖4可知，7種竹葉中的醇類物質(zhì)在種類及相對含量上差異較大，苯乙醇(玫瑰花香)是主要的醇類物質(zhì)，在黃竹葉中(75.65%)含量最高；其次是苯甲醇(芳香味)，在綿竹葉(23.26%)含量最高；而2,3-丁二醇僅在麻竹葉(13.15%)和慈竹葉(39.92%)中檢出。不同品種竹葉醇類物質(zhì)的差異可能會導致竹酒風味的差異。

萜類物質(zhì)廣泛存在于高等植物中，是構成植物香精、色素等的揮發(fā)性成分，同時具有各種有益人體健康的抗性活性成分。竹類植物中含有的大量萜類物質(zhì)香氣豐富，能協(xié)調(diào)竹葉風味的整體性。如圖4所示，芳樟醇是最主要的萜類物質(zhì)，相對含量分別為39.12%(麻竹葉)、52.55%(黃竹葉)、96.95%(綿竹葉)、100%(箭竹葉)、92.28%(慈竹葉)、75.18%(斑竹葉)，苦竹葉中未檢測到萜類物質(zhì)。芳樟醇帶有鈴蘭花香和木香，但隨來源不同而香氣各異，在香料、香精中廣泛存在。此外，芳樟醇還具有抗菌、抗病毒、殺蟲驅(qū)蟲的藥理作用[22]。本研究中發(fā)現(xiàn)6種竹葉中含有大量的芳樟醇，證明竹葉的萜類活性成分含量較高，更好地豐富了竹酒的功效。另外，α-法呢烯(花香)在麻竹葉(39.05%)中含量最高，反式-橙花叔醇在斑竹葉(24.82%)中含量最高。

2.4 主成分分析和聚類分析

2.4.1 主成分分析

為進一步明確不同品種竹葉間的差異，以7種竹葉樣品為分析對象，采用主成分分析對10大類別的揮發(fā)性成分進行分析。結果如圖5所示，3個主成分中，第1成分反映34.52%的數(shù)據(jù)信息，第2主成分反映23.25%的數(shù)據(jù)信息，3個主成分累積反映73.52%的數(shù)據(jù)信息。由圖5可知，酯及內(nèi)酯類物質(zhì)和芳香類物質(zhì)在PC1上距離較近，對PC1正向貢獻較大；酸類、萜類物質(zhì)對PC2正向貢獻較大；醇類物質(zhì)對PC3的正向貢獻較大。

圖5 七種竹葉主成分分析結果Fig.5 PCA results of seven kinds of bamboo leaves

2.4.2 聚類分析

采用離差平方和法將7個品種竹葉的所有揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)據(jù)進行聚類分析，結果如圖6所示，在距離為10處可將竹葉分為3大類，第1類為箭竹葉、苦竹葉、斑竹葉；第2類為黃竹葉；第3類為麻竹葉、綿竹葉、慈竹葉。結果表明，黃竹葉與其他6個品種竹葉揮發(fā)性成分差異性較大，箭、苦、斑竹葉揮發(fā)性成分相似；麻、綿、慈竹葉揮發(fā)性成分差異不大。聚類分析能有效地通過揮發(fā)性成分對竹葉進行分類，同時也反映出不同品種的竹葉在揮發(fā)性物質(zhì)上存在一定差異，竹葉品種的差異可能導致開發(fā)的竹酒品質(zhì)差異較大。

圖6 七種竹葉聚類分類結果Fig.6 CA analytical diagram of seven kinds of bamboo leaves

3 結論

采用HS-SPME-GC-MS分析研究了7種不同品種的竹葉，通過譜庫進行檢索和保留指數(shù)驗證，共鑒定出142種揮發(fā)性物質(zhì)，主要包括醛類、酮類、醇類、酯類、萜類、酸類等大多數(shù)品種竹葉共有的化合物。而每種竹葉中檢測出的揮發(fā)性化合物種類為麻竹葉(71種)>慈竹葉(63種)>箭竹葉(62種)>斑竹葉(53種)>黃竹葉(52種)、苦竹葉(52種)>綿竹葉(51種)。7種不同品種的竹葉在化合物種類上差異不顯著，但各類化合物的相對含量差異較大，箭、慈竹葉中烴類物質(zhì)占比較大，分別為44.00%、30.68%；斑竹葉中醛類物質(zhì)相對含量較高，為37.18%；而黃和苦竹葉中醇類物質(zhì)占比較大，分別為24.07%、30.85%。

本研究7種竹葉檢測到的揮發(fā)性化合物中醛類物質(zhì)以順-2-己烯醛(26.14%～62.26%)、苯甲醛(10.70%～31.01%)相對含量較高；酯及內(nèi)酯類物質(zhì)主要包括癸酸甲酯(23.84%～49.96%)、二氫獼猴桃內(nèi)酯(3.98%～19.67%)；酮類物質(zhì)相對含量較高的為α-紫羅酮(0～53.33%)、β-紫羅酮(19.85%～26.92%)；醇類物質(zhì)中,苯乙醇(18.42%～75.65%)、苯甲醇(5.65%～23.26%)相對含量較高，萜類物質(zhì)以芳樟醇(39.12%～100%)的相對含量最高。

HS-SPME-GC-MS結合主成分分析、聚類分析較好地對竹葉品種進行區(qū)分，揮發(fā)性物質(zhì)含量的差異可以反映出竹葉的品種差異，本研究中黃竹葉與另外6個品種竹葉揮發(fā)性差異較大，箭、苦、斑竹葉揮發(fā)性相似,麻、綿、慈竹葉揮發(fā)性差異不大，竹葉品種的差異可能導致竹酒的揮發(fā)性差異較大。本研究主要對竹葉的揮發(fā)性進行鑒定和對竹葉品種進行區(qū)分，通過對竹酒原材料的深入研究為下一階段研究不同香型、不同種類竹酒的揮發(fā)性提供一定的指導作用。