李姝薈，劉微，郭婷，周鴻媛，張宇昊,2，劉曉竹，馬良,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(西南大學 生物科學研究中心，重慶，400715) 3(重慶微奧云生物技術有限公司，重慶，400039)

展青霉素(patulin，PAT)是一種由青霉屬、曲霉屬和絲衣霉屬等真菌代謝產生的天然毒物[1]，其污染范圍非常廣，歐洲和亞洲的多個國家和地區(qū)均有食品污染的相關報道[2-3]。PAT的主要污染對象是水果、堅果、油料作物及其制品，尤其是蘋果等果品及其制品等，其PAT污染是世界范圍內重點控制的果品真菌毒素污染[4]。GB 2761—2017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》明確規(guī)定，PAT在蘋果、山楂及其制品中限量標準為50 μg/kg[5]。目前PAT主要采用色譜技術來進行定量檢測，結果準確可靠，主要應用于實驗室和質檢部門。而PAT特殊的理化性質和較小的分子質量導致其目前尚無成熟的抗體，因此基于免疫技術的快檢方法(酶聯(lián)免疫法、免疫層析等)及產品研發(fā)相對其他真菌毒素差距較大，為PAT快檢發(fā)展帶來嚴峻挑戰(zhàn)[6]。

適配體是一種人工合成的核酸，對目標物具有高特異性，同時具有結構穩(wěn)定、制備成本低、便于化學修飾的特點，是抗體的良好替代物。目前，已成功篩選到PAT的適配體，在一定程度上緩解了PAT抗體缺乏的情況，利用適配體建立PAT的快速檢測方法具有良好的發(fā)展前景[7-9]。ZnO納米材料具有化學性質穩(wěn)定、晶體形態(tài)多樣、生物相容性好、電催化效應強等多重優(yōu)勢，在電化學檢測方面得到了廣泛的研究[10-11]。目前已有一些基于ZnO納米材料構建生物傳感器的報道，如王寶[12]使用水熱反應合成ZnO納米花材料，并將其噴涂于ITO電極表面構建左旋多巴電化學傳感器，利用ZnO納米花增大電化學反應面積，提高了左旋多巴傳感器的檢測性能；有學者在玻碳電極上組裝了ZnO納米棒，為酶提供了大量的結合位點，實現(xiàn)對靶標物鄰苯二酚的高靈敏檢測[13]。然而，利用刷狀ZnO納米材料構建電化學傳感器報道較少[8]。

本研究通過制備刷狀ZnO納米材料，利用殼聚糖優(yōu)異的分散性和成膜性，將氨基改性的ZnO納米刷均勻滴涂在金電極表面以增大工作電極有效面積，利用酰胺反應將PAT的適配體固定在ZnO納米刷表面，構建PAT電化學適配體傳感體系，進行PAT的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PAT標準品、赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)標準品，新加坡Pribolab公司；Zn(NO3)2·6H2O、NaOH、正硅酸乙酯(tetraethyl orthosilicate, TEOS)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(aminopropyltriethoxysilane, APTES)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxy succinimide, NHS)、殼聚糖(chitosan, CS)，上海阿拉丁生化科技有限公司；AlCl3、K3[Fe(CN)6]、K4Fe(CN)6、KCl、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、果膠酶，上海麥克林生化科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；PAT適配體(序列[14]：5′-COOH-GGC CCG CCA ACC CGC ATC ATC TAC ACT GAT ATT TTA CCTT-3′)、PBS磷酸緩沖液，上海生工生物工程有限公司；所用試劑均為分析純，試驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

反應釜，析?？萍加邢薰?；101-4-S電熱恒溫鼓風干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械廠；SU8010高分辨場發(fā)射掃描電鏡，日立(中國)有限公司；Spectrun100傅里葉變換紅外光譜儀，美國PerkinElmer公司；X’Pert PRO MPD X射線衍射儀，荷蘭帕納科公司；CHI600E電化學工作站，三電極系統(tǒng)(參比電極：CHI150飽和甘汞電極；對電極：CHI115鉑絲電極；工作電極：CHI101金盤電極)，上海辰華儀器有限公司；氮吹儀，常州朗越儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 ZnO納米刷材料的合成

將5 mmol Zn(NO3)2·6H2O和5 mmol NaOH分別用10 mL超純水溶解，之后將NaOH溶液緩慢滴加至Zn(NO3)2溶液中(不斷攪拌)，調節(jié)pH至13后，將溶液轉入50 mL的反應釜中，100 ℃下反應2 h,離心，所得固體產物分別用乙醇和超純水洗滌3次，放入烘箱60 ℃烘干，得到白色粉末狀固體。將所得固體用X射線衍射儀和掃描電子顯微鏡進行表征。

1.3.2 ZnO納米刷材料的改性

取20 mg ZnO納米刷材料，分散波處理于20 mL正丙醇和40 mL乙醇的混合液中，超聲波處理10 min。邊攪拌邊依次加入1.5 mL氨水(質量分數(shù)25%、320 μL TEOS、80 μL APTES，室溫下攪拌反應8 h。將上述溶液8 000 r/min離心10 min,得到沉淀，隨后用超純水清洗該沉淀,并將其分散于PBS溶液中。改性后的材料進行紅外光譜表征。

1.3.3 ZnO納米刷材料對適配體的負載

取適量改性的ZnO納米刷材料上清液，依次向其中加入等體積的0.4 mol/L EDC和0.1 mol/L NHS混合液，再加入不同濃度的適配體溶液，使得ZnO納米材料的質量(mg)與適配體物質的量(μmol)之比呈現(xiàn)1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10的梯度，37 ℃水浴中攪拌2 h，離心，測定上清液260 nm處的吸光度，通過朗伯-比爾定律公式(1)和差減法計算得到ZnO納米材料上所負載的適配體量。

A=a×l×c

(1)

式中：a,吸光系數(shù)，L/(g·cm)；l,光在樣本中經過的距離(通常為比色皿的厚度)，cm；c,溶液質量濃度，g/L

1.3.4 PAT電化學適配體傳感器的構建與表征

配制5 mmol/L K3[Fe(CN)6]、5 mmol/L K4Fe(CN)6混合水溶液(含有0.1 mmol/L KCl)作為電解質支持液。金電極作為工作電極，甘汞電極作為參比電極，鉑絲電極作為對電極，使用循環(huán)伏安法(cyclic voltammetry，CV)掃描，掃速為50 mV/s，當氧化峰和還原峰的電位差小于90 mV時，表明金電極拋光效果達到要求。將符合要求的金電極用超純水沖洗，氮氣吹干備用。

將1 mg ZnO納米刷材料與1 mg殼聚糖分散在1 mL乙酸(體積分數(shù)1%)水溶液中，超聲波處理30 min得到均勻的ZnO-CS分散液。將2 μL分散液垂直滴加在電極上，同時將等體積含0.4 mol/L EDC和0.1 mol/L NHS的溶液與適配體溶液混合，37 ℃保溫30 min以活化適配體5′端修飾的羧基。之后在電極表面滴適配體溶液，37 ℃濕孵。在金電極表面滴加質量分數(shù)5% BSA 溶液。取一定濃度的PAT乙腈溶液，豎直滴加于金電極表面，室溫下反應1 h。每一層修飾操作完畢后，對金電極進行CV掃描和電化學阻抗譜掃描(electrochemical impedance spectroscopy, EIS)，掃描的頻率范圍設置為0.01 k～100 kHz。

1.3.5 對PAT適配體傳感器性能的影響因素研究

將打磨好的金電極置于電解支持液中，進行差分脈沖伏安法(differential pulse voltammetry, DPV)掃描，掃描范圍0～0.8 V，記錄初始電流峰值I0，然后將不同體積ZnO-CS分散液滴加在金電極表面，37 ℃孵育，直到干燥，再次進行DPV掃描，記錄電流峰值I1，計算ΔI1=I0-I1。之后用不同濃度適配體修飾電極，濕孵一段時間，超純水沖洗電極，氮吹后進行DPV掃描，記錄電流峰值I2，計算ΔI2=I0-I2。再將適配體用不同的修飾時間修飾電極，濕孵一段時間后用超純水沖洗，氮吹后進行DPV掃描，記錄電流峰值I3，計算ΔI3=I0-I3。最后滴加含質量分數(shù)5% BSA的PBS溶液5 μL，濕孵一段時間，用超純水沖洗，氮吹，再次進行DPV掃描，記錄電流峰值I4，計算ΔI4=I0-I4。

1.4 實際樣品檢測

取1.0 g組織搗碎機處理好的樣品，加入超純水至10 mL(處理好的山楂片樣品直接加入10 mL超純水)，加入不同濃度的PAT毒素標準品溶液，渦旋混勻，室溫下靜置過夜。加入1 mg固體果膠酶，50 ℃水浴酶解3 h，加入10 mL乙酸乙酯，渦旋5 min，超聲波處理10 min，分層后小心吸取有機層，氮氣吹干，加入10 mL PBS溶液復溶，待測。

1.5 數(shù)據處理分析

相關實驗數(shù)據，使用Microsoft Office Excel 2016進行統(tǒng)計，并計算平均值和標準偏差，使用SPSS 22.0對數(shù)據進行方差分析(ANOVA)，使用Duncan’s 多重比較進行顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。使用Origin 9進行繪圖，標準偏差用對稱誤差棒表示，顯著性分析結果用字母表示。

2 結果與分析

2.1 ZnO納米材料的表征

2.1.1 ZnO納米材料的形貌

合成的ZnO納米材料掃描電鏡圖見圖1-a。合成的ZnO納米材料成簇生長，長度為10 μm左右，直徑在300 nm以內。ZnO納米材料表面粗糙，朝同一方向生成密集的片層結構，類似“刷狀”，這可能是由于ZnO在pH 13的堿性條件下合成，OH-含量太高，導致中間產物[Zn(OH)4]2-大量生成并被過量吸附在ZnO晶體的正極面(軸向)上，[Zn(OH)4]2-來不及完全水解生成ZnO，從而影響到之后中間體在極性面的堆砌過程，只能堆砌在側面(徑向)，最終形成刷狀結構[15]。

a-ZnO納米材料的掃描電鏡圖；b-ZnO材料的X射線衍射譜；c-ZnO納米刷修飾氨基前后的紅外光譜圖圖1 ZnO納米材料的表征Fig.1 Characterization of ZnO Nanomaterials

2.1.2 ZnO納米材料的晶型

使用X射線衍射儀對合成材料進行表征，以研究其物相。結果如圖1-b所示，X射線衍射圖譜與標準卡片PDF#80-0075相一致，說明該物質是六方纖鋅礦結構。此外，樣品衍射峰形態(tài)尖銳，寬度較窄，無其他雜峰，表明所合成的ZnO材料純度高，結晶性能較好。

2.1.3 ZnO納米材料的紅外光譜

利用硅烷試劑對ZnO納米材料進行改性和氨基修飾。TEOS通過水解作用生成SiO2并包裹在ZnO表面，其表面具有硅羥基，之后APTES提供氨基進行修飾。改性前和改性后的ZnO納米刷的紅外光譜圖見圖1-c。改性后出現(xiàn)3個明顯的吸收峰，3 414 cm-1處為N-H的伸縮振動峰，1 638 cm-1處為N-H的彎曲振動峰，1 075 cm-1處為Si-O-Si的不對稱伸縮振動峰，表明氨基已經成功修飾在ZnO納米刷材料表面[16]。此外，改性后新出現(xiàn)的位于2 500 cm-1附近的特征峰，為Si-H的伸縮振動峰；改性前后均存在1 400 cm-1附近的特征峰，可能與飽和烴基的變化有關,這可能是由于ZnO納米材料中殘留了清洗液無水乙醇，以及硅烷試劑水解生產的醇或硅醇。

2.2 電化學適配體傳感器的構建原理

PAT電化學適配體傳感器的構建如圖2所示，殼聚糖具有良好的成膜能力和導電性，透水性高，附著力好，利用其優(yōu)異的成膜性和穩(wěn)定性將氨基修飾的ZnO納米刷均勻滴涂在金電極表面[8]。

首先用EDC和NHS活化PAT適配體5′端的羧基，然后將適配體滴加于金電極表面，ZnO納米材料表面的氨基和適配體5′端的羧基發(fā)生酰胺反應，將PAT適配體固定在電極表面。接著使用BSA作為封閉劑，占據電極表面剩余的位點。滴加待測液后，當存在靶標物質PAT時，會被適配體識別，二者特異性結合形成復合物，導致金電極表面的電子傳遞能力發(fā)生改變，通過測定靶標物質結合前后的電化學信號變化值，計算待測液中靶標物質的含量。

圖2 電化學適配體傳感器構建示意圖Fig.2 Construction diagram of electrochemical aptasensor

2.3 ZnO納米材料對適配體的負載能力

如圖3所示，實際添加的PAT適配體和ZnO納米刷的比例(AptPAT:ZnO)從2增大至10的過程中，適配體在ZnO納米刷上的負載量不斷增長，表明隨著PAT適配體添加量不斷增多，結合在ZnO納米刷表面的適配體數(shù)量顯著增加；當AptPAT∶ZnO大于10時，負載量趨于平穩(wěn)，表明結合在ZnO納米刷表面的適配體數(shù)量達到飽和狀態(tài)。此時，ZnO納米刷對PAT適配體的負載量為0.076 nmol/mg。

圖3 PAT適配體在ZnO納米材料上的負載量Fig.3 The number of patulin aptamers loaded on nanometer ZnO注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.4 電化學適配體傳感器的構建及表征

利用CV及EIS對構建的PAT電化學適配體傳感器進行表征(圖4)。圖4-a的曲線a顯示的是修飾改性前的裸金電極，電阻小、電子傳遞效率高，因此氧化還原電流峰值最高；曲線b顯現(xiàn)的是電阻增大，分析原因是ZnO納米材料在晶體狀態(tài)下導電性能較差，但殼聚糖本身帶正電，對于電解支持液中的[Fe(CN)6]3-/4-探針有很好的吸附能力，有助于電子傳遞，二者共同修飾電極之后，ZnO納米材料對電子傳遞的影響更占優(yōu)勢，因此氧化還原電流峰值降低[17]；曲線c也顯示氧化還原電流峰值降低，說明PAT適配體通過酰胺反應被固定在電極表面，由于DNA骨架本身帶負電，當[Fe(CN)6]3-/4-探針分子靠近電極時會產生排斥作用，阻礙電子轉移[18]；曲線d顯示氧化還原電流峰值進一步降低，原因是蛋白質BSA不導電，封閉電極上剩余的結合位點之后造成氧化還原電流峰值下降；當電極上的適配體與靶標物質PAT毒素結合生成復合物之后，會產生空間位阻，進一步阻礙電子傳遞，導致氧化還原電流峰值再次降低(曲線e)。上述結果表明，電極修飾過程中每一層物質都成功地修飾在電極表面上，并且檢測過程中探針和靶標物質成功發(fā)生特異性結合。

采用EIS進一步驗證和表征反應過程見圖4-b，主要通過奈奎斯特曲線高頻區(qū)半圓的直徑反映電子轉移阻抗(Ret)，即電子轉移能力的大小[19]。圖4-b中的a、b、c、d、e五條曲線依次對應金電極表面的每一層修飾操作，可以看出隨著修飾物在電極表面的層層組裝，至最后的特異性結合過程，阻抗依次增大，與CV表征中實驗結果具有一致性，進一步表明傳感器的成功構建以及檢測過程中特異性結合反應的發(fā)生。

a-裸金電極；b-裸金電極/ZnO；c-裸金電極/ZnO/適配體；d-裸金電極/ZnO/適配體/BSA；e-裸金電極/ZnO/適配體/BSA/PAT圖4 電化學適配體傳感器構建過程的CV(a)和EIS表征(b)Fig.4 Cyclic voltammetric characterization (a) and electrochemical impedance spectroscopy of constructing electrochemical aptamer (b)sensor

2.5 傳感器性能的影響因素

工作電極修飾條件對傳感器性能的影響見圖5，隨著ZnO-CS分散液滴加量的增加，ΔI1呈現(xiàn)先減后增的趨勢，這是由于ZnO不導電，而CS具有一定的導電性。當分散液體積為2 μL時，體系電流最大(圖5-a)，所以選擇2 μL為ZnO-CS分散液的最適修飾體積。

圖5-b顯示，PAT適配體修飾濃度為2～8 μmol/L時，ΔI2隨著修飾濃度的上升而增加，當修飾濃度大于8 μmol/L時，ΔI2基本不再變化，表明此時電極上結合的適配體已經達到飽和狀態(tài)，因此選擇8 μmol/L作為適配體最適合的修飾濃度。

圖5-c研究了適配體最佳的修飾時間，在15～120 min內隨著修飾時間的增長，ΔI3逐漸增大，至45 min后基本保持不變，說明了此時適配體在金電極表面的結合已經達到飽和狀態(tài),因此選擇45 min作為修飾時間。

用5% BSA作為封閉劑研究非特異性吸附情況見圖5-d，結果發(fā)現(xiàn)當封閉時間<45 min時，ΔI4隨時間增加而增大，表明隨修飾時間增加，結合在電極表面的BSA數(shù)量在逐步增加。當封閉時間>45 min時,ΔI4基本穩(wěn)定，表明封閉達到飽和，因此，BSA封閉的最佳時長為45 min。

圖5 不同修飾條件DPV電流峰值差的影響Fig.5 Effect of different modification conditions on differences in peak value of DPV current

2.6 方法學評價

2.6.1 線性范圍和檢測限

圖6-b所示，PAT質量濃度1×10-3～5×103μg/L時，隨PAT濃度增加，ΔI逐漸增加，呈現(xiàn)典型S狀，其中在0.5～1×103μg/L的范圍內，PAT質量濃度的對數(shù)值與ΔI呈良好的線性關系，線性回歸方程為y=3.10lgρ+37.34，相關系數(shù)r=0.99，最低檢出限為0.15 μg/L。

a-PAT標準品DPV曲線; b- PAT標準品濃度與DPV電流峰值差的關系圖6 線性范圍和檢測限Fig.6 Linearity range and detection limit

2.6.2 精密度和特異性

選取100、10、1 μg/L濃度梯度對該檢測方法進行精密度研究，多次重復實驗的檢測結果如表1所示，相對標準偏差RSD(n=5)在2.51%～5.09%之間，均小于10%，表明該方法精密度良好。

表1 不同PAT濃度水平的相對標準偏差Table 1 The relative standard deviation at different concentration levels

選取果品常見污染毒素OTA(100 μg/L)作為干擾物質，對該電化學傳感器的特異性進行研究，結果如圖7所示。PAT和混合標準品(包括PAT)的峰值流變化顯著，而OTA的峰值電流變化相對較小，說明PAT適配體的特異性在快檢分析中可以接受，但由于目前篩選出的PAT適配體序列只有3條[20]，適配體的篩選與性能改進有較大研究空間。

圖7 基于PAT適配體的特異性研究Fig.7 Specificity study based on PAT aptamers

2.6.3 實際樣品檢測

蘋果、山楂及其制品是PAT的主要污染對象，因此本研究選擇蘋果汁和山楂片作為實際樣品進行加標檢測。加標樣品的檢測結果如表2所示，該方法在蘋果汁中的加標回收率為94.75%～110.84%，在山楂片中的加標回收率為103.46%～108.34%，表明該方法的準確度良好。

表2 樣品加標回收試驗(n=3)Table 2 Recovery test of PAT added to different samples

3 結論與討論

本研究利用ZnO納米刷增大傳感電極上PAT適配體的負載量,從而提高傳感器的靈敏度、擴大線性濃度范圍，構建了果品中PAT高靈敏度檢測的電化學適配體傳感器，實現(xiàn)PAT高靈敏度(檢出限為0.15 μg/L)、較高線性范圍(0.5～1×103μg/L)的快速檢測(單樣本檢測時間為2 min)，檢測準確度較高(蘋果汁和山楂片中的平均加標回收率為94.75%～110.84%)。與其他文獻報道的PAT檢測方法相比，線性范圍平均寬2個數(shù)量級左右[4,14,21-22]，最低檢測限比高效液相色譜[21]、上轉換熒光傳感檢測[22]等方法低1個數(shù)量級以上，與主流快檢納米金類[4]的方法以及本實驗室開發(fā)的適配體熒光傳感器[14]處于同一水平靈敏度，體現(xiàn)了該方法檢測范圍寬、靈敏度高的雙重優(yōu)勢。在特異性識別方面，未來PAT適配體序列種類進一步篩選和性能改進將會大大促進PAT快速檢測技術的發(fā)展。