廖若宇，張春娥*,劉新保，孫悅，田建文

1(寧夏回族自治區(qū)糧油產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心, 寧夏 銀川, 750001)2(寧夏農(nóng)林科學(xué)院,寧夏 銀川, 750001)

食品生產(chǎn)工業(yè)中，著色劑因可修飾產(chǎn)品外觀色澤而發(fā)揮著巨大作用。按照來源不同，著色劑可分為天然色素和合成色素。合成色素因成本低廉、穩(wěn)定性好而被廣泛用于食品行業(yè)。亮藍(lán)是一種水溶性偶氮酸性著色劑(分子結(jié)構(gòu)見圖1),易溶于水及乙醇，其耐光和耐熱性較強(qiáng)，對酸和堿均不敏感[1]，現(xiàn)已用于酸奶[2]、果味飲料、果醬[3]、茶葉[4]等產(chǎn)品的染色。目前，國家已頒布相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)對食品中亮藍(lán)著色劑的最大添加量進(jìn)行了限定?，F(xiàn)階段對食品中合成著色劑的檢測方法較多，如薄層色譜法[5-6]、高效液相色譜法[7-9]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10-11]、分光光度法[12]、電化學(xué)傳感器法[13-14]、表面增強(qiáng)拉曼散射法[15-17]等。

圖1 亮藍(lán)分子結(jié)構(gòu)圖[18]Fig.1 Bright blue molecular structure diagram

黑米，屬珍貴糧油作物，是一種藥食兼用的有色大米，分為糯米和黏米兩種[19]，具有極高的營養(yǎng)價值、藥用及保健功能。黑米中顯現(xiàn)出來的顏色來源于種皮上沉積的色素，經(jīng)研究證明其內(nèi)部含有花色苷類化合物，是一種天然水溶性色素。黑米花色苷主要活性成分為矢車菊素-3-葡萄糖苷，其結(jié)構(gòu)內(nèi)部含有酚羥基，表現(xiàn)出抗氧化活性[20-21]。黑米色素易溶于極性大的溶劑，如水、乙醇等，難溶于非極性溶劑[22]。黑米具有免疫調(diào)節(jié)、降血脂、抗癌、抗粥樣動脈硬化等功能[23]，學(xué)術(shù)領(lǐng)域?qū)诿滋匦?、營養(yǎng)成分等研究越來越深入和廣泛。

目前，已有學(xué)者研究多種方法提取黑米樣品中的花青素，將其應(yīng)用于動物體內(nèi)，以測試并分析其功能性成分的作用機(jī)制[24-25]，也有將黑米與不同功能性食品復(fù)配制備新產(chǎn)品的研究[26-27]，但尚未發(fā)現(xiàn)針對黑米中是否含有合成著色劑及其含量的研究。本實(shí)驗(yàn)以黑米為原材料，在本實(shí)驗(yàn)前處理過程中引入NaHCO3，綜合考察產(chǎn)品加標(biāo)回收率，類比國標(biāo)方法中涉及到相關(guān)方法的加標(biāo)回收率，從而驗(yàn)證輔助提取試劑及新方法的可行性。旨在尋找前處理方法操作簡單、定量準(zhǔn)確，同時適合不同種類糧油產(chǎn)品中合成著色劑測定的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料與試劑

1.1.1 儀器

LC-20AT 高效液相色譜儀配備紫外檢測器，島津國際貿(mào)易有限公司；LABORATORY MILL 3100(Perten)實(shí)驗(yàn)?zāi)?，瑞典波通儀器公司；PL602-L 電子天平，瑞士梅特勒-托利多(上海)有限公司；GL-20G-C 高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；Lab dancer 渦旋器，艾卡儀器設(shè)備有限公司；C300A 真空泵，德國WGIIENS；RV 10 Control 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國IKA公司；HY-5 回旋式振蕩器，江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；XC-300C超聲波清洗機(jī)，濟(jì)寧鑫欣超聲電子設(shè)備有限公司；COMFORT純水/超純水機(jī)，德國賽多利斯公司。

1.1.2 試劑與材料

市購3種黑米產(chǎn)品。

0.5 mg/mL國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)亮藍(lán)[GBW(E)100005a]，中國計(jì)量科學(xué)研究院；甲醇(色譜級)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；NaHCO3(分析純)，廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心；甲酸(色譜純)、NaCl(分析純)、氨水(分析純)、乙酸鈉(優(yōu)級純)、乙酸銨(優(yōu)級純),天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；KCl(優(yōu)級純)，成都市科龍化工試劑廠；Na2CO3(優(yōu)級純)，山東西亞化學(xué)股份有限公司。

13 mm 0.22 μm聚醚砜針式濾器,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；Strata-X-AW 33 μm Polymeric Weak Anion固相萃取柱，60 mg/3 mL；Cleanert PWAX固相萃取柱，150 mg/6 mL；Cleanert JXA固相萃取柱，500 mg/6 mL；0.45 μm微孔過濾膜(水系)；0.45 μm微孔過濾膜(有機(jī)系)。

乙酸銨溶液(0.02 mol/L)：稱取1.54 g 乙酸銨，加水至 1 L，溶解，經(jīng) 0.45 μm 水系濾膜過濾。

實(shí)驗(yàn)過程中所用水均為去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-SP C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長629 nm，柱溫35 ℃，流動相：V(甲醇)∶V(0.02 mol/L乙酸銨溶液)=45∶55,流速1.0 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL，等濃度洗脫，分析時間20 min。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)的配制

從亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液中吸取1 mL至10 mL容量瓶中，用去離子水定容至刻度，得到50 μg/mL的中間儲備液。再分別吸取適量中間儲備液，去離子水定容，制成質(zhì)量濃度0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5.00 g(精確至0.01 g)粉碎細(xì)度達(dá)80～100目且混合均勻的樣品，置于100 mL離心管中，加入0.52 g NaHCO3，再加入25 mL 體積分?jǐn)?shù)40%甲醇水渦旋提取12 min，將提取的樣品溶液離心5 min(4 000 r/min)，轉(zhuǎn)移上清液至100 mL比色管中。重復(fù)3次，保證樣品中色素被充分提取出來。

1.2.4 樣品凈化

依次用3 mL甲醇、水及體積分?jǐn)?shù)2%的甲酸水溶液活化固相萃取柱，再取1 mL提取液上樣，之后用3 mL 2%甲酸水淋洗萃取柱，棄去濾液，將小柱抽干。然后用1 mL 體積分?jǐn)?shù)25%氨水甲醇溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。將收集的洗脫液于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋蒸濃縮至干，再用1 mL去離子水復(fù)溶，渦旋混合1 min，待樣品充分溶解后，過0.22 μm親水性針式過濾器，待上機(jī)分析。

1.2.5 單因素考查及綜合因素優(yōu)化

通過單因素比對法，分別對提取方式、提取次數(shù)、輔助提取試劑種類、輔助提取劑(NaHCO3)添加量、提取試劑體積分?jǐn)?shù)、固相萃取柱種類以及濃縮方式等7個因素進(jìn)行考查，同時在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取NaHCO3添加量、甲醇水體積分?jǐn)?shù)、渦旋時間及凈化柱種類4個因素，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。以加標(biāo)回收率為響應(yīng)值，所有實(shí)驗(yàn)組中均添加2 μg/mL的亮藍(lán)標(biāo)樣，采用Design-Expert 8.0.6分析軟件得到二次回歸方程和誤差分析，確定優(yōu)化工藝并對最終優(yōu)化組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取方式對加標(biāo)回收率的影響

分別對比振蕩30 min、渦旋10 min及超聲10 min三種不同提取方式對檢測結(jié)果的影響(圖2)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，因黑米自身花青素色素干擾，在3種不同提取方式下，樣品顏色差異并不明顯，其中80 W功率下超聲提取的樣品，測得亮藍(lán)加標(biāo)回收率僅有20%左右，通過查閱文獻(xiàn)[22，29]發(fā)現(xiàn)，利用超聲波方式進(jìn)行色素提取多適用于植物中天然色素的提取，同時超聲功率在190 W以上時，才能更好地提取色素，本單位儀器功能無法滿足，故棄去超聲提取法。對比振蕩提取和渦旋提取，2種方式測得亮藍(lán)提取率在75%～90%，證明2種方法均可用于黑米中亮藍(lán)色素的提取，但考慮實(shí)際情況，優(yōu)先選擇耗時較短的提取方式，故本實(shí)驗(yàn)選取的提取方式為渦旋混合10 min。

圖2 提取方式對加標(biāo)回收率的影響Fig.2 Effect of extraction method on the recovery rate of standard addition

2.1.2 提取次數(shù)對加標(biāo)回收率的影響

通過分別對比1次和3次、4次提取對實(shí)驗(yàn)中亮藍(lán)色素提取率的影響，為降低干擾，同時以大米為基底進(jìn)行視覺參考比對。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一次提取過程中，提取液顏色較淺，加標(biāo)回收率在60%～65%，而3次提取時，提取液顏色較深，加標(biāo)回收率在78%～82%。第4次提取時，提取液幾乎無色，經(jīng)測定，加標(biāo)回收率與提取3次差異不大，見圖3。因此，最佳提取次數(shù)為3次。

圖3 提取次數(shù)對加標(biāo)回收率的影響Fig.3 Effect of extraction times on the recovery rate of standard addition

2.1.3 輔助提取試劑種類對加標(biāo)回收率的影響

考察不同輔助提取試劑對亮藍(lán)加標(biāo)回收率的影響。稱取10份5.00 g樣品于離心管中，分別添加0.5 g NaHCO3、NaCl、KCl、Na2CO3和乙酸鈉5種試劑，每個水平設(shè)置2個平行，再加入25 mL 40%甲醇水渦旋提取10 min，將提取的樣品溶液4 000 r/min 離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至100 mL比色管中。重復(fù)操作3次，按照1.2.4方法凈化樣品，上機(jī)分析對比不同種類的輔助提取試劑對加標(biāo)回收率的影響。檢測發(fā)現(xiàn)，添加有NaHCO3的提取溶液采用方法1.2.4凈化時，無肉眼可見色素流失的情況存在，并且測試結(jié)果表明黑米中亮藍(lán)的加標(biāo)回收率明顯比其他4種輔助試劑高，加標(biāo)回收率在70%～88%，見圖4。因此，實(shí)驗(yàn)中選取NaHCO3作為輔助提取試劑。

圖4 輔助提取試劑種類對加標(biāo)回收率的影響Fig.4 Effect of different auxiliary extraction reagents on the recovery rate of standard addition

2.1.4 NaHCO3添加量對加標(biāo)回收率的影響

考察NaHCO3不同添加量對亮藍(lán)加標(biāo)回收率的影響。稱取10份5.00 g樣品于離心管中，分別添加0.1、0.5、0.7、1.0、1.5 g NaHCO3，每個水平設(shè)置2個平行，再加入25 mL 40%甲醇水渦旋提取10 min，將提取的樣品溶液離心5 min(4 000 r/min)，轉(zhuǎn)移上清液至100 mL比色管中。重復(fù)操作3次，按照1.2.4方法凈化樣品，上機(jī)測定對比不同添加量對試驗(yàn)結(jié)果的影響。檢測發(fā)現(xiàn)當(dāng)NaHCO3添加量為0.5 g時，黑米中亮藍(lán)的加標(biāo)回收率較其他水平略高，加標(biāo)回收率在86%～88%，見圖5。因此，本實(shí)驗(yàn)中NaHCO3添加量選取0.5 g。

圖5 NaHCO3添加量對加標(biāo)回收率的影響Fig.5 Effect of NaHCO3 on recovery rate of standard addition

2.1.5 提取試劑體積分?jǐn)?shù)對加標(biāo)回收率的影響

考察不同提取液體積分?jǐn)?shù)對亮藍(lán)加標(biāo)回收率的影響。稱取12份5.00 g樣品及0.5 g NaHCO3于離心管中，分別添加35%、40%、45%、50%、55%、60%(體積分?jǐn)?shù))的甲醇水溶液，每個水平設(shè)置2個平行，然后渦旋提取10 min，將提取的樣品溶液離心5 min (4 000 r/min)，轉(zhuǎn)移上清液至100 mL比色管中。重復(fù)操作3次，按照1.2.4方法凈化樣品，上機(jī)分析對比不同提取液體積分?jǐn)?shù)對試驗(yàn)結(jié)果的影響。當(dāng)提取液為體積分?jǐn)?shù)40%甲醇水溶液時，黑米中亮藍(lán)的加標(biāo)回收率較其他水平略高，加標(biāo)回收率在90%～93%，見圖6。因此，選取40%甲醇水溶液作為提取液。

圖6 提取試劑體積分?jǐn)?shù)對加標(biāo)回收率的影響Fig.6 Effect of concentration of extraction reagent on recovery rate of standard addition

2.1.6 固相萃取柱的選擇對加標(biāo)回收率的影響

弱陰離子交換固相萃取柱和聚酰胺固相萃取柱均可用來凈化食品中的合成著色劑，而亮藍(lán)中含有苯磺酸結(jié)構(gòu)，因此本研究選取Strata-X-AW和Cleanert PWAX兩種弱陰離子交換固相萃取柱[30]和Cleanert JXA聚酰胺固相萃取柱進(jìn)行樣品凈化試驗(yàn)。稱取6份5.00 g樣品及0.5 g NaHCO3于離心管中，加入25 mL 40%甲醇水渦旋提取10 min，將提取的樣品溶液離心5 min(4 000 r/min)，轉(zhuǎn)移上清液至100 mL比色管中。重復(fù)操作3次，按照1.2.4方法凈化樣品，每組設(shè)置2個平行，考察3種凈化柱對加標(biāo)回收率的影響。結(jié)果表明：3種凈化柱對加標(biāo)回收率影響的順序?yàn)镾trata-X-AW>Cleanert JXA>Cleanert PWAX，其中Strata-X-AW固相萃取柱的加標(biāo)回收率在80%～95%，而另外2種固相萃取柱凈化后的樣品加標(biāo)回收率在61%～80%，雖然3種凈化柱均可用于黑米中亮藍(lán)的凈化，但是Strata-X-AW固相萃取柱效果最佳(圖7)。

圖7 固相萃取柱對加標(biāo)回收率的影響Fig.7 Effect of SPE column on recovery rate of standard addition

在凈化過程中，針對是否需要平衡凈化柱,對相關(guān)方式進(jìn)行比對。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未加入2%甲酸水平衡的凈化柱，在上樣后棄去的樣液中存在部分亮藍(lán)顏色，同時加標(biāo)回收率僅為10%～40%，證明未經(jīng)甲酸水溶液平衡的固相萃取柱，無法將食品中提取的色素固定在凈化柱中，因而在淋洗、洗脫等后續(xù)操作中會流失部分色素。而經(jīng)甲酸水平衡的固相萃取柱，其加標(biāo)回收率可達(dá)75%～92%。從凈化柱結(jié)構(gòu)來看，弱陰離子交換固相萃取柱在上樣時為保證化合物離子最大化，應(yīng)使樣品溶液的pH高于化合物酸度系數(shù)至少2個pH單位，而洗脫時，洗脫溶液pH應(yīng)大于化合物酸度系數(shù)至少2個pH單位。因此，選取在活化過程中加入弱有機(jī)酸水溶液——甲酸水來平衡固相萃取柱。

本實(shí)驗(yàn)中還嘗試比對了樣品過凈化柱及未過凈化柱對試驗(yàn)結(jié)果的影響。經(jīng)儀器分析發(fā)現(xiàn)，未過凈化柱直接檢測的樣品，其加標(biāo)回收率為100%～110%，證明樣品中亮藍(lán)色素已被完全提取，但存在長時間測定時，儀器基線不穩(wěn)，雜峰較多的問題。因此，本實(shí)驗(yàn)采取過凈化柱處理。

2.1.7 濃縮方式對樣品加標(biāo)回收率的影響

分別考察旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和氮?dú)獯祾邇煞N濃縮方式對樣品加標(biāo)回收率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)方式濃縮的樣品加標(biāo)回收率明顯高于氮?dú)獯祾邼饪s的樣品，并且樣品平行性較好，同時可實(shí)現(xiàn)自動控制，便于試驗(yàn)操作。而氮?dú)獯祾邼饪s的樣品，在烘干過程中，可能存在樣品沾到小試管管壁上方而造成樣品部分損失。同時，由于無法自動監(jiān)控樣品烘干情況，當(dāng)樣品烘干過度，再次利用去離子水溶解烘干后的樣品時，樣品無法完全溶解。因此，本實(shí)驗(yàn)中采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)方式濃縮樣品。

綜上所述，單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：采取渦旋混合方式提取樣品，提取次數(shù)為3次，NaHCO3添加量為0.5 g時，加標(biāo)回收率好，同時發(fā)現(xiàn)NaHCO3添加量在0.1和0.5 g時加標(biāo)回收率呈現(xiàn)緩慢上漲趨勢，遂以NaHCO3添加量、甲醇水體積分?jǐn)?shù)、渦旋時間、凈化柱種類4個因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.2.1 建立二次回歸方程及誤差分析

對表1中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合得到二次回歸方程。加標(biāo)回收率=-586.789+85.742A+29.963B+1.964C+36.692D-0.453AB+0.898AC+2.208AD-0.054BC-0.290BD+1.435CD-80.542A2-0.354B2-0.147C2-9.400D2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Design and results of response surface test

2.2.2 優(yōu)化組合驗(yàn)證試驗(yàn)

使用快速上升法優(yōu)化得到的提取黑米中亮藍(lán)的最佳方案為：NaHCO30.52 g，甲醇體積分?jǐn)?shù)40.11%，渦旋時間12.17 min，凈化柱種類為2.32，預(yù)估加標(biāo)回收率為91.00%，但考慮實(shí)際情況，選取NaHCO30.52 g，甲醇水體積分?jǐn)?shù)為40%，渦旋時間12 min，2號凈化柱，對上述條件進(jìn)行的驗(yàn)證,結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面誤差分析結(jié)果Table 2 Error analysis results of response surface

表3 最優(yōu)組驗(yàn)證試驗(yàn)Table 3 Validation test of optimal group

由表3得出，最優(yōu)組亮藍(lán)提取加標(biāo)回收率為91.81%，接近于響應(yīng)面試驗(yàn)組中最高組回收率，與理論預(yù)測值相比，其相對誤差約為0.81%。說明響應(yīng)面優(yōu)化后得出的回歸方程有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、方法檢出限及精密度

合成著色劑亮藍(lán)的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖及黑米樣品中加標(biāo)后的亮藍(lán)色譜圖分別見圖8和圖9。選取標(biāo)準(zhǔn)曲線中間濃度點(diǎn)重復(fù)進(jìn)樣測定10次，對儀器穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證。以質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的色譜峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立線性回歸方程。方法檢出限依據(jù)3倍信噪比計(jì)算，方法定量限依據(jù)10倍信噪比計(jì)算。經(jīng)測定可得，亮藍(lán)的線性方程為Y=87 231.6X-451.536 2，相關(guān)系數(shù)R=0.999 99，最低檢出濃度為0.02 mg/kg，定量限為0.05 mg/kg，方法精密度[23]為5.00%，標(biāo)準(zhǔn)方差為2.00%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.63%。

圖8 合成著色劑亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.8 Chromatogram of synthetic colorant bright blue

圖9 黑米樣品中加標(biāo)后亮藍(lán)色譜圖Fig.9 Bright blue spectrum in black rice samples

2.4 樣品方法驗(yàn)證及加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

購買3種不同品牌的黑米樣品，分別對樣品中的亮藍(lán)進(jìn)行測定，同時驗(yàn)證其加標(biāo)回收率，測定結(jié)果如表4所示。

表4 不同品牌黑米樣品加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 Spike recovery and relative standard deviation of different black rice samples

3種不同市購黑米樣品內(nèi)部本身都不存在亮藍(lán)色素，在不同濃度加標(biāo)情況下測得回收率為81.70%～91.52%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.39%～1.75%，證明了本實(shí)驗(yàn)方法可行性及穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

本文聯(lián)合采用固相萃取及高效液相色譜法測定黑米中的著色劑亮藍(lán)，通過對國標(biāo)GB 5009.35—2016中前處理和測定方法的改進(jìn)，簡化了前處理的操作，使亮藍(lán)色素得到更好地分離。目前對黑米樣品中天然色素(花色苷)方面的研究較多，而產(chǎn)品中是否含有合成著色劑還未曾驗(yàn)證，本文隨機(jī)購買市面上3種黑米產(chǎn)品，通過分析驗(yàn)證得出黑米類產(chǎn)品中不含著色劑亮藍(lán)。無論是產(chǎn)品還是提取方法，均突顯出本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新性。本實(shí)驗(yàn)研究得出當(dāng)NaHCO3添加量為0.52 g，體積分?jǐn)?shù)40%甲醇水溶液作為提取液，渦旋12 min，重復(fù)3次提取時，能夠?qū)⒑诿字刑砑拥牧了{(lán)完全提取出來，同時采用經(jīng)甲酸水平衡的Strata-X-AW固相萃取柱凈化，后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)方式濃縮樣品，得到樣品加標(biāo)回收率為81.70%～91.52%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.39%～1.75%，為黑米中著色劑亮藍(lán)的提取與測定提供了一種可靠、快速和便捷的分析方法。