陳亮，王雨晴，冀峰，李月琪，馬勇，谷瑞增*

1(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心 北京，100015) 2(島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司 北京，100020)

玉米低聚肽是以工業(yè)化濕法生產(chǎn)玉米淀粉過(guò)程中產(chǎn)生的玉米蛋白粉為原料，利用現(xiàn)代生物酶解技術(shù)制得的小分子短肽混合物[1-3]。與其他植物蛋白相比，玉米蛋白含有高比例的支鏈氨基酸，且在其多肽鏈中存在著不同的功能區(qū)，其功能性質(zhì)可經(jīng)過(guò)酶解技術(shù)被釋放，因此玉米蛋白粉是生產(chǎn)玉米低聚肽良好的蛋白原料。已有廣泛研究表明玉米低聚肽具有多種功能活性，包括抗氧化[4]、降血壓[5]、修復(fù)肝損傷[6]、醒酒[7-10]等方面的生理功能。

玉米蛋白粉中玉米醇溶蛋白(zein)含量最高，占比為68%[11-12]。圖1為一條來(lái)源于Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)的玉米醇溶蛋白alpha-zein序列，該序列含有較多的谷氨酰胺(Q)及亮氨酸(L)，并且存在11個(gè)谷氨酰胺亮氨酸(Glu-Leu，QL)的氨基酸序列組合(突出顯示)。有研究表明，位于N末端位置的谷氨酰胺殘基在水溶液中不穩(wěn)定，在加熱的情況下極易被環(huán)化形成焦谷氨酸殘基[13-16]，從而形成焦谷氨酰亮氨酸(pyroGlu-Leu，pEL)。有文獻(xiàn)報(bào)道，堿性蛋白酶對(duì)存在于C端的亮氨酸具有酶解傾向性[17]。因此，玉米蛋白經(jīng)堿性蛋白酶酶解制得的玉米低聚肽中可能存在一定量的pEL。

圖1 玉米醇溶蛋白alpha-zein的蛋白序列Fig.1 Protein sequence of alpha-zein

臨床上，抑郁癥的治療主要依賴于抗抑郁藥，而長(zhǎng)期服用藥物則存在著巨大的副作用風(fēng)險(xiǎn)。安全有效的食物輔助治療是增強(qiáng)抗抑郁療效的有效手段。食物所含的多種營(yíng)養(yǎng)因子在治療抑郁癥方面也發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，如部分維生素、礦物質(zhì)、ω-3脂肪酸、植物黃酮等功能食品配料[18]。研究表明，短肽的N末端具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)，當(dāng)C端為亮氨酸、異亮氨酸等支鏈氨基酸殘基時(shí)，一般具有抗抑郁的生理功能，研究已證實(shí)pEL二肽具有抗抑郁活性[19-20]。

本研究利用超快速液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UHPLC-MS/MS)考察玉米低聚肽中pEL二肽，旨在為玉米低聚肽的開發(fā)提供研究思路，并為其作為新型功能食品的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米蛋白粉，市售；pEL標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)，上海吉爾生化有限公司；甲酸(色譜純)，迪馬科技；乙腈(色譜純)，德國(guó)Merck公司；超純水(18.2 MΩ·cm)由Milli-Q純水系統(tǒng)制備；超濾膜(1 000 Da)，廈門福美科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LCMS-8060超快速液相色譜儀與三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀聯(lián)用系統(tǒng)，島津；3K15臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，SIGMA；XS205DU分析天平，Mettler Toledo；FlowMem-0250超濾裝置，福美科技。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 玉米低聚肽的制備

將300 g 玉米蛋白粉與5 L去離子水混勻，經(jīng)堿性蛋白酶酶解3 h(50 ℃、pH 8.0、酶底比1∶100)后，用復(fù)合蛋白酶酶解2 h(50 ℃、pH 8.0、酶底比1∶50)。充分酶解后攪拌滅酶10 min(100 ℃)，并離心15 min(3 000 r/min)，收集上清液。上清液經(jīng)1 000 Da的超濾膜超濾后得到分子質(zhì)量<1 000 Da的玉米低聚肽溶液，溶液經(jīng)濃縮及噴霧干燥后制得粉末狀玉米低聚肽。

1.3.2 玉米低聚肽的理化分析

采用國(guó)標(biāo)規(guī)定的方法測(cè)定總蛋白含量(GB 5009.5—2010)、酸溶蛋白和低聚肽含量(GB/T 22729—2008)、相對(duì)分子質(zhì)量分布(GB/T 22729—2008)和氨基酸組成(GB 5009.124—2016第一法)[13-15]，總蛋白含量以干基記，換算系數(shù)為6.25。

1.3.3 pEL結(jié)構(gòu)的測(cè)定

利用UHPLC-MS/MS測(cè)定玉米低聚肽的pEL結(jié)構(gòu)。

超快速液相色譜條件：Inertsil ODS-3色譜柱(2.1×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸乙腈溶液；流速0.2 mL/min；柱溫40 ℃；洗脫條件：0～15 min, 0～50% B；15～20 min, 50%～100% B；20～25 min, 100% B；25～35 min, 0% B。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源(electrospray ionization,ESI)，正離子掃描模式,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring,MRM)；霧化氣流速：3.0 L/min；加熱氣流速：10 L/min；干燥氣流速：10 L/min；噴霧電壓4.5 kV；接口溫度250 ℃；加熱器溫度400 ℃；離子源溫度300 ℃；利用儀器自動(dòng)優(yōu)化功能對(duì)pEL進(jìn)行MRM參數(shù)優(yōu)化，優(yōu)化后的MRM參數(shù)見表1。

表1 測(cè)定pEL的MRM優(yōu)化參數(shù)Table 1 The MRM conditions of pEL

樣品前處理：將樣品用流動(dòng)相A配制成200 μg/mL的溶液，混勻后離心取上清液，用0.22 μm的過(guò)濾膜過(guò)濾，制得待測(cè)樣品。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)共收集5批次玉米低聚肽樣品，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。采用Excel計(jì)算不同批次樣品中pEL含量，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米低聚肽的蛋白質(zhì)、肽含量和分子質(zhì)量分布

玉米低聚肽的蛋白質(zhì)(干基)含量為87.70%，肽(干基)含量為82.76%。表明蛋白質(zhì)和肽含量高。測(cè)定玉米低聚肽相對(duì)分子質(zhì)量分布的色譜圖見圖2，分子質(zhì)量分布結(jié)果見表2。

圖2 玉米低聚肽的分子質(zhì)量分布色譜圖Fig.2 Chromatograph of molecular weight distribution注：圖中虛線色譜圖分別對(duì)應(yīng)4種分子量標(biāo)準(zhǔn)品：細(xì)胞色素C (相對(duì)分子質(zhì)量12 500)、桿菌酶(相對(duì)分子質(zhì)量1 450)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(相對(duì)分子質(zhì)量451)和乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(相對(duì)分子質(zhì)量189)12 500);實(shí)線色譜圖代表玉米低聚肽樣品

表2 玉米低聚肽分子質(zhì)量分布結(jié)果Table 2 Molecular weight distribution of corn oligopeptide

由表2可知，玉米低聚肽分子質(zhì)量主要集中在140～1 000 Da，平均分子量為461.20 Da。有研究顯示，分子質(zhì)量<1 000 Da的蛋白水解物更易被人體吸收從而發(fā)揮功能活性[16-17]，因此玉米低聚肽作為小分子短肽的混合物，有被人體直接吸收和發(fā)揮功能的潛力。

2.2 玉米低聚肽的氨基酸分析

根據(jù)1.3.2所述方法測(cè)定玉米低聚肽中氨基酸組成及含量(除色氨酸)，結(jié)果如表3所示。

表3 玉米低聚肽的氨基酸組成及含量Table 3 Amino acid profile of corn oligopeptide

玉米低聚肽中氨基酸總量為85.76%，必需氨基酸含量為28.22%，占總氨基酸的32.91%。谷氨酸(谷氨酰胺)為玉米低聚肽中含量最高的氨基酸，含量為21.76%；亮氨酸僅次于谷氨酸(谷氨酰胺)，且是含量最高的必需氨基酸，含量為12.79%。N末端的谷氨酸和谷氨酰胺易形成焦谷氨酸殘基，這使得玉米低聚肽中含有pEL二肽的可能性極大。

2.3 玉米低聚肽中pEL含量的分析

對(duì)共計(jì)5個(gè)批次的玉米低聚肽進(jìn)行了分析定量。經(jīng)計(jì)算，5批次玉米低聚肽中pEL的含量在0.58%～0.70%，如表4所示，且批次間無(wú)顯著差異(P>0.05)。定量色譜圖如圖3所示。

表4 不同批次玉米低聚肽中pEL的含量 單位：%

a-標(biāo)準(zhǔn)品;b-玉米低聚肽樣品圖3 pEL的定量色譜圖Fig.3 Quantitative chromatogram of pEL

本研究中，玉米低聚肽中pEL的含量均在0.5%以上，這使得玉米低聚肽在新型功能食品的開發(fā)方面具有一定前景。

3 結(jié)論

玉米低聚肽中蛋白含量高且多以低聚肽的形式存在，蛋白質(zhì)(干基)含量為87.70%，肽(干基)含量為82.76%。分子質(zhì)量主要集中在140～1 000 Da，平均分子質(zhì)量為461.20 Da。玉米低聚肽中氨基酸總量為85.76%，必需氨基酸含量為28.22%，占總氨基酸的32.91%。谷氨酸(谷氨酰胺)為玉米低聚肽中含量最高的氨基酸，含量為21.76%；亮氨酸僅次于谷氨酸(谷氨酰胺)，且是含量最高的必需氨基酸，含量為12.79%。N末端的谷氨酸和谷氨酰胺易形成焦谷氨酸殘基，這使得玉米低聚肽中含有pEL二肽的可能性極大。結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果顯示有pEL二肽存在，且5批次玉米低聚肽中pEL的含量在0.58%～0.70%之間，批次間無(wú)顯著差異，含量穩(wěn)定。

本研究通過(guò)對(duì)玉米低聚肽中具有抗抑郁的天然成分pEL二肽進(jìn)行分析，為玉米低聚肽作為新型功能食品的開發(fā)提供了理論依據(jù)。