尚雪嬌,方三勝,朱媛媛,趙慧君,郭壯

(湖北文理學院 食品科學技術(shù)學院,鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所,湖北 襄陽, 441053)

豆渣是豆腐和腐乳等大豆制品加工過程中的主要副產(chǎn)物,富含膳食纖維、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和大豆異黃酮等成分[1]。由于豆渣口感粗糙且極易腐敗變質(zhì),常被用作飼料或直接作為廢料丟棄,造成了資源的浪費和環(huán)境的污染[2],積極探討豆渣的加工利用極為重要。霉豆渣又稱豆渣粑,是將新鮮的豆渣經(jīng)微生物自然發(fā)酵而成的一類發(fā)酵食品,主要分布在湖北省武漢市、洪湖市、荊州市、恩施土家苗族自治州和江西南昌、瑞金等地區(qū)[3],使用植物油將其煎炸后常作為火鍋的佐料食用。

經(jīng)實地調(diào)研發(fā)現(xiàn),不同農(nóng)戶制作的霉豆渣品質(zhì)存在較大差異,品質(zhì)較好的霉豆渣無不良風味,但部分農(nóng)戶制作的霉豆渣則會有一定的臭味,究其原因可能是由于制作環(huán)境較為開放,微生物對霉豆渣品質(zhì)形成的優(yōu)劣具有重要影響。石威[4]利用純培養(yǎng)技術(shù)對江西南昌地區(qū)霉豆渣中的酵母菌、乳酸菌和霉菌進行了分離純化,發(fā)現(xiàn)酵母菌分別為Rhodotorulamucilaginosa(膠紅酵母)、Trichosporonmontevideense(圓形絲孢酵母)、Aureobasidiumpullulans(普魯蘭酵母)和Trichosporonasahii(阿氏絲孢酵母),乳酸細菌分別為Enterococcusfaecium(屎腸球菌)和Leuconostocmesenteroides(腸膜明串珠菌),霉菌為Rhizopusoryzae(米根霉)[4]；姚英政[5]采用純培養(yǎng)技術(shù)從湖北武漢地區(qū)霉豆渣粑樣品中分離出1株真菌,經(jīng)鑒定為MucorracemosusFresenius(總狀枝毛霉)；張燕鵬等[6]對江西瑞金地區(qū)的發(fā)酵豆渣進行菌相分析,發(fā)現(xiàn)豆渣中真菌主要為Monilia(串珠霉屬)、Rhizopus(根霉屬)和Saccharomyces(酵母屬)；細菌主要為Bacillussubtilis(枯草芽孢桿菌)、Enterobactersp.(腸桿菌屬)、Staphylococcus(葡萄球菌屬)、Pediococcus(片球菌屬)和Deinococcus(異常球菌屬)。上述研究均采用了純培養(yǎng)技術(shù),由于該技術(shù)對含量較低、非可培養(yǎng)微生物和某些特殊的微生物會有所遺漏,因而無法對樣品中所有微生物進行解析[7]。近年來,隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展,高通量測序技術(shù)不僅成本低、可讀量和質(zhì)量高,為微生物群落結(jié)構(gòu)的全面解析提供了有力工具[8],目前已廣泛應用于腐乳[9]、泡菜[10]和豆瓣醬[11]等調(diào)味制品中微生物多樣性的解析。

本研究采用高通量測序技術(shù)解析霉豆渣中細菌多樣性并結(jié)合PICRUSt軟件對細菌類群的基因功能進行了預測,以期為后續(xù)更加全面了解霉豆渣中細菌菌群多樣性提供理論依據(jù),為特色發(fā)酵豆制品的產(chǎn)業(yè)化推動提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

霉豆渣：采自湖北省荊州市石首市菜市場(E112°43′～112°47′,N29°67′～29°85′),共采集6 個樣品,編號記為M1～M6。

DNA提取試劑盒,德國QIAGEN公司；dNTPs Mix、Fast Pfu Buffer、5×Trans StartTM、Fast Pfu Fly DNA Polymerase,寶生物工程大連有限公司；引物,武漢天一輝遠生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

CR21 N高速冷凍離心機,日本HITACHI公司；ND-2000C微量紫外分光光度計,美國Nano Drop公司；Veriti 96孔梯度PCR儀,美國ABI公司；Fluor Chem FC3型化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng),美國ProteinSimple公司；Miseq PE300高通量測序平臺,美國Illumina公司；R930機架式服務器,美國DELL公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 宏基因組提取

參照DNeasy mericon Food Kit試劑盒中方法對霉豆渣樣品中的微生物總DNA進行提取。

1.3.2 細菌16S rRNA序列擴增

PCR擴增體系參照沈馨等[12]方法并略有修改。以霉豆渣樣品中提取的基因組DNA為模板,利用正向引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和反向引物806R(5′-GGACTACHVGGGT-3′)進行PCR擴增。

1.3.3 序列質(zhì)控和生物信息學分析

序列下機,采用尚雪嬌等[13]方法選擇符合條件的序列進行拼接,然后將拼接好的序列切除7個標簽(barcode)序列和引物并進行下一步分析。

使用QIIME(v1.7.0)分析平臺[14],對質(zhì)控后的序列進行分析。采用PyNAST[15]軟件將序列對齊,接著進行兩步UCLUST[16]劃分構(gòu)建分類操作單元矩陣(operational taxonomic units,OTU),然后利用Greengenes[l7]和RDP[18]數(shù)據(jù)庫進行同源性比對,最后在使用FastTree軟件[19]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹的基礎上,計算霉豆渣樣品中細菌微生物的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)等α多樣性指標。在使用Greengenes和RDP數(shù)據(jù)庫進行同源性比對時,若某一序列在2個數(shù)據(jù)庫中的比對結(jié)果不相同,則在該分類學地位下將其判定為不可鑒定(unclassfield),同時觀察其上一分類學地位比對結(jié)果是否相同,若相同則采納該分類學地位下的比對結(jié)果,否則繼續(xù)將其判定為不可鑒定(unclassfield),并進一步觀察其再上一分類學地位結(jié)果,直到兩個數(shù)據(jù)庫在該分類學地位下判定結(jié)果一致為止。

1.3.4 基因功能預測

使用PICRUSt軟件對霉豆渣樣品中微生物的基因功能進行預測[20],并參照蛋白質(zhì)直系同源簇數(shù)據(jù)庫(clusters of orthologous groups of proteins,COG)進行功能注釋[21]。

1.3.5 圖表繪制

本研究主要使用Origin 2017C軟件繪制堆積圖和柱狀圖,使用R軟件(v3.6.3)的pheatmap軟件包繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序深度分析

切除barcode和引物后序列的長度分布情況如圖1所示。測序長度在小于425 bp有39 458 條序列,占總序列數(shù)的18.54%；測序長度在425～433 bp有173 398 條序列,占總序列數(shù)的81.46%；測序長度在434～442 bp、443～451 bp或大于451 bp累計共有8 條序列。由此可知,切除barcode和引物后,81.46%的序列長度在425～451 bp,基本涵蓋了16S rRNA V3～V4區(qū),因而后續(xù)可在分類學地位“屬”水平上對樣品細菌多樣性進行分析。

圖1 測序長度分布圖Fig.1 Sequencing length distribution

2.2 序列豐富度和多樣性分析

由表1可知,6 個霉豆渣樣品中共產(chǎn)生212 864 條高質(zhì)量16S rRNA序列,平均每個樣品產(chǎn)生35 477 條,在97%的相似度下劃分的OTU數(shù)分別為262、526、395、450、473和419 個。樣品M5中的序列可鑒定到100 個屬,而M6中序列僅鑒定為23 個屬；當測序量達到24 010 條時,樣品M2的Chao1指數(shù)為628,微生物豐度最大,而M1的Chao1指數(shù)僅為297；樣品M4的Shannon指數(shù)為5.77,生物多樣性最高,而M1的Shannon指數(shù)僅為1.49。由此可見,不同霉豆渣樣品的細菌多樣性存在較大的差異。

表1 16 rRNA測序情況及各分類地位數(shù)量Table 1 16 rRNA read counts and number of identifiable units at different taxonomical levels

2.3 基于門和屬水平的細菌群落結(jié)構(gòu)分析

霉豆渣樣品中相對含量大于1.0%的優(yōu)勢細菌門構(gòu)成如圖2所示。霉豆渣中平均相對含量大于1.0%的優(yōu)勢菌門為Proteobacteria(變形菌門)、Firmicutes(硬壁菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)和Actinobacteria(放線菌門),其平均相對含量分別為46.50%、38.80%、12.62%和1.81%。且樣品M1和M6中的優(yōu)勢菌門構(gòu)成較為相似,主要為Firmicutes,而M2、M3、M4和M5中的優(yōu)勢菌門較為相似,主要為Proteobacteria。

圖2 霉豆渣中平均相對含量>1.0%的細菌門Fig.2 Bacterial phyla with an average relative abundance of >1.0% in Meitauza samples

霉豆渣樣品中平均相對含量大于1.0%的優(yōu)勢細菌屬構(gòu)成如圖3所示。霉豆渣中平均相對含量大于1.0%的優(yōu)勢菌屬包括隸屬于Proteobacteria的Acinetobacter(不動桿菌屬)、Pseudomonas(假單胞菌屬)、Enterobacter(腸桿菌屬)、Brevundimonas(短波單胞菌屬)、Stenotrophomonas(寡養(yǎng)單胞菌屬)和Comamonas(叢毛單胞菌屬),其平均相對含量分別為17.27%、10.38%、4.29%、4.03%、3.05%和2.52%,累計相對含量為41.54%；隸屬于Firmicutes的Enterococcus(腸球菌屬)、Bacillus(芽孢桿菌屬)、Brevibacillus(短芽孢桿菌屬)和Lysinibacillus(賴氨酸芽胞桿菌屬),其平均相對含量分別為1.09%、11.60%、2.41%和21.15%,累計相對含量為36.25%；隸屬于Bacteroidetes的Wautersiella(沃特氏菌屬)和Sphingobacterium(鞘氨醇桿菌屬),其平均相對含量分別為8.68%和2.17%,累計相對含量為10.85%；以及隸屬于Actinobacteria的Nocardia(諾片氏菌屬),其平均相對含量為1.36%。

圖3 霉豆渣中平均相對含量>1.0%的細菌屬Fig.3 Bacterial genera with an average relative abundance of >1.0% in Meitauza samples

有報道指出隸屬于Acinetobacter、Pseudomonas、Brevundimonas、Stenotrophomonas和Comamonas的某些種具有一定的條件致病性，例如隸屬于Acinetobacter的A.baumannii(鮑氏不動桿菌)為醫(yī)院感染的重要病原菌[22]，隸屬于Pseudomonas的P.aeruginosa(綠膿桿菌)[23]、隸屬于Brevundimonas的B.vesicularis(泡囊短波單胞菌)[24]、隸屬于Stenotrophomonas的S.maltophilia(嗜麥芽窄食單胞菌)[25]和隸屬于Comamonas的C.acidovorans(食酸叢毛單胞菌)可引起肺炎等炎癥[26]。Bacillus在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物中含多種抗菌物質(zhì),其中Lysinibacillus發(fā)酵產(chǎn)物有抗真菌活性[27],也可產(chǎn)生蛋白酶,可有效降解豆渣中大分子蛋白為肽類和氨基酸,從而促進人體消化吸收。張燕鵬等[6]在對江西瑞金地區(qū)的發(fā)酵豆渣進行菌相分析發(fā)現(xiàn)豆渣中的細菌主要有Bacillus等,這與本研究發(fā)現(xiàn)一致。

由圖3亦可知,雖然樣品M1和M6在門水平上構(gòu)成較為相似,但其在屬水平上呈現(xiàn)出較大的差異,其中樣品M1中占優(yōu)勢的細菌為Lysinibacillus,而樣品M6為Bacillus。此外,雖然樣品M2、M3、M4和M5中的優(yōu)勢菌門較為相似,但在屬水平上亦呈現(xiàn)出較大的差異,樣品M2中相對含量占前3位的菌屬分別為Acinetobacter、Pseudomonas和Lysinibacillus,其相對含量分別為29.03%、21.22%和18.76%；樣品M3為Acinetobacter、Wautersiella和Enterobacter,其相對含量分別為36.50%、23.09%和17.74%；樣品M4為Acinetobacter、Wautersiella和Pseudomonas,其相對含量分別為34.62%、11.78%和10.28%；而樣品M5為Pseudomonas、Brevundimonas和Lysinibacillus,其相對含量分別為27.73%、22.20%和10.61%。由此可見,在屬水平上不同霉豆渣樣品的細菌多樣性亦呈現(xiàn)出較大的差異。

2.4 基于OTU水平的細菌群落結(jié)構(gòu)分析

本研究共產(chǎn)生了1 355 個OTU,若某一OTU在所有樣品中均存在則將其定義為核心OTU[28],本研究共發(fā)現(xiàn)了8 個核心OTU,占OTU總數(shù)的0.59%,包含的序列數(shù)分別占總序列數(shù)的9.35%,由此可見,6 個霉豆渣樣品中含有的核心細菌類群僅占所有序列數(shù)的10%,不同樣品間的細菌構(gòu)成存在較大差異。霉豆渣中核心OTU的相對含量統(tǒng)計結(jié)果如表2所示。

表2 霉豆渣中核心OTU的相對含量 單位：%

由表2可知,8 個核心OTU,各有2 個被鑒定為Enterobacter和Pseudomonas,其余的4 個各被鑒定為Klebsiella、Weissella、Acinetobacter和Lactococcus。樣品M2、M3、M4和M5中核心OTU的累計平均相對含量較高,分別為10.94%、24.13%、13.49%和10.49%,但樣品M1和M6中的核心OTU含量僅為0.41%和0.75%。值得一提的是,樣品M2和M5中的核心OTU主要隸屬于Pseudomonas,累計平均相對含量分別為9.01%和10.18%,樣品M3中的核心OTU主要隸屬于Enterobacter,累計平均相對含量為17.71%,而M4中的核心OTU主要隸屬于Enterobacter和Pseudomonas,累計平均相對含量為5.62%和7.53%。

若某一OTU僅在某一樣品中存在,而在其他樣品中均不存在,則將其定義為特有OTU[28],霉豆渣樣品中特有OTU的相對含量統(tǒng)計結(jié)果如表3所示。

表3 霉豆渣中特有OTU的相對含量Table 3 The relative content of unique OTU in Meitauza samples

由表3可知,在6 個樣品中出現(xiàn)1 次的OTU為711 個,占OTU總數(shù)的52.47%,包含的序列數(shù)僅占總序列數(shù)的6.34%。由此可見,在6 個霉豆渣樣品中同時存在,或僅單獨存在于某一樣品中OTU所包含序列數(shù)均較少,可能多數(shù)OTU僅存在于2～5 個樣品中。

本研究進一步對霉豆渣中OTU出現(xiàn)頻率和序列數(shù)進行統(tǒng)計,其結(jié)果如圖4所示。在6 個樣品中出現(xiàn)2、3、4和5 次的OTU分別為336、151、104和45 個,分別占OTU總數(shù)的24.80%、11.14%、7.68%和3.32%,包含的序列數(shù)分別占總序列數(shù)的2.17%、24.60%、23.64%和33.90%。由此可見,多數(shù)OTU可能存在于3～5個樣品中。

圖4 OTU出現(xiàn)頻率和序列數(shù)統(tǒng)計Fig.4 Occurrence frequency of OTU and number of sequences within OTU

本課題組前期對米酒曲[29]、辣椒醬[12]和鲊廣椒[30]中細菌多樣性進行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述發(fā)酵食品均共有大量的核心細菌菌群,其含量高達80%以上,而本研究中霉豆渣的共有核心細菌菌群僅占10%。米酒曲水分含量較低且添加了鳳凰草等中草藥,在一定程度上限制了雜菌的生長,使霉菌和戊糖片球菌成為其優(yōu)勢微生物類群[29]；而辣椒醬中食鹽的添加量高達15%左右,較高的滲透壓抑制了多數(shù)細菌的生長,僅有芽孢桿菌等耐受性強的細菌得以存活[12]；鲊廣椒為厭氧發(fā)酵,在一定程度上抑制了好氧菌的生長,乳酸菌成為其優(yōu)勢細菌類群[30]；而霉豆渣以新鮮豆渣為主要原料,原料含有大量的水分和豐富的營養(yǎng)物質(zhì),且發(fā)酵方式為開放式發(fā)酵,適宜于環(huán)境中各類微生物的生長。由此可見,導致不同霉豆渣樣品間的細菌構(gòu)成存在較大差異的根本原因在于其原料滲透壓較低、含有豐富營養(yǎng)物質(zhì)和開放式的發(fā)酵方式。

2.5 基因功能預測

在對霉豆渣核心細菌類群解析的基礎上,進一步對其基因功能進行了預測,結(jié)果如圖5所示。

圖5 霉豆渣中細菌的基因功能預測Fig.5 The gene functional prediction of bacteria in Meitauza samples

本研究從霉豆渣細菌中共注釋到4 106 個COG,分別隸屬于23 個功能類別,樣品M1～M6中各有占總序列數(shù)10.47%、10.13%、9.58%、9.86%、10.83%和10.77%的序列無法預測其功能。由圖5可知,碳水化合物的運輸與代謝、氨基酸的轉(zhuǎn)運與代謝在樣品中表達較強,RNA的加工與修飾及細胞骨架在樣品中表達較低；樣品被分為2個聚類,一類是由樣品M3和M5構(gòu)成,另一類是由樣品M1、M2、M4和M6構(gòu)成,表明樣品M3與M5細菌功能較為相似,與另外4 個樣品細菌功能有部分差異。豆渣中蛋白質(zhì)含量較高,發(fā)酵過程中某些細菌的次級代謝產(chǎn)物可產(chǎn)生蛋白酶,在蛋白酶的作用下蛋白質(zhì)分解成游離氨基酸,游離氨基酸越多,霉豆渣味道越鮮美[31]。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)霉豆渣中優(yōu)勢細菌門為Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria；優(yōu)勢細菌屬為Acinetobacter、Pseudomonas、Brevundimonas、Stenotrophomonas、Comamonas、Enterococcus、Bacillus、Brevibacillus、Lysinibacillus、Wautersiella、Sphingobacterium和Nocardia；碳水化合物的運輸與代謝和氨基酸的轉(zhuǎn)運與代謝在霉豆渣細菌類群中具有較強的表達能力。不同霉豆渣樣品間細菌類群存在較大的差異,究其原因可能與制作環(huán)境較為開放及其自身營養(yǎng)物質(zhì)豐富有關(guān)。