于潔,徐勤茜,李子院,劉紅艷,郝再彬,李海云*

1(桂林理工大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院,廣西 桂林,541004) 2(廣西高校食品安全與檢測重點實驗室(桂林理工大學(xué)),廣西 桂林,541004)

白藜蘆醇是一種非黃酮類多酚化合物,具有抑制腫瘤、抗癌等多種生理活性[1-4]。采用溶劑法直接從植物中提取分離白藜蘆醇,是目前天然白藜蘆醇最主要的生產(chǎn)方法[5-6]。中藥虎杖中白藜蘆醇含量較低,但虎杖苷含量較高,質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)2.55%,因而利用微生物或酶法轉(zhuǎn)化虎杖苷是制備白藜蘆醇的可行途徑之一[7-8]。β-葡萄糖苷酶屬于纖維素酶類,能水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-葡萄糖鍵,同時釋放出β-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基[9-10],在食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域中有重要的應(yīng)用價值[11-12]。目前，國內(nèi)外研究所用的β-葡萄糖苷酶主要來源于微生物[13-14]，利用微生物制備的酶液可用于虎杖苷轉(zhuǎn)化成白藜蘆醇[15]。馮薇等[16]通過梔子苷平板初篩、虎杖苷搖瓶復(fù)篩,篩選得到1株能夠分泌β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化虎杖苷生成白藜蘆醇的菌株沙福芽孢桿菌BacillussafensisCGMCC13129,對底物虎杖苷的轉(zhuǎn)化率可達(dá)90%以上；ZHOU等[17]從黑曲霉AspergillusnigerSK34.002中分離純化了水解虎杖苷生成白藜蘆醇的β-葡萄糖苷酶,并考察了其酶學(xué)性質(zhì)；XUE等[18]對海棲熱袍菌Thermotogamaritima中熱穩(wěn)定的β-葡萄糖苷酶水解虎杖苷生成白藜蘆醇的性質(zhì)進(jìn)行了研究。

本課題組前期從虎杖中分離獲得1株內(nèi)生真菌AspergillusaculeatusHZ001,其胞內(nèi)提取物可水解虎杖苷生成白藜蘆醇,本文探討了該菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶基本酶學(xué)性質(zhì),為后期該酶的分離純化及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

虎杖內(nèi)生真菌AspergillusaculeatusHZ001,分離自虎杖根。

馬鈴薯葡萄糖(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,水1 000 mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基：NaNO32.0 g,K2HPO41.0 g,KCl 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,FeSO40.01 g,蔗糖30 g,蒸餾水1 000 mL。

1.2 主要試劑

水楊苷，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；巰基乙醇，上海賢鼎生物科技有限公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、葡萄糖、瓊脂、Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4，汕頭市西隴化工有限公司。所用試劑均為分析純或生化試劑，所用水均為二次蒸餾水。

1.3 主要儀器

振蕩培養(yǎng)箱(LRH-150-Z)，珠江韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器(BXM-30R)，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；超凈工作臺(CJ-1SFS)，天津市泰斯特儀器有限公司；冷凍離心機(DL-5-B)，德國sigma；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-S2)，金壇市醫(yī)療儀器廠；可見分光光度計(VIS-722ON)，北京瑞利分析儀器有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 孢子懸液的制備

將試管斜面保存的菌株HZ001經(jīng)PDA培養(yǎng)基平板活化后,接種到平板產(chǎn)孢培養(yǎng)基,于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d,待孢子形成后,用無菌水制成106～107CFU/mL的孢子懸液。

1.4.2 搖瓶培養(yǎng)

取5 mL孢子懸浮液接種到滅菌冷卻后的100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,在30 ℃,150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)4 d。

1.4.3 粗酶液的制備

培養(yǎng)完畢,將發(fā)酵液抽濾、水洗后,收集濕菌體加入液氮冷凍研磨后,加入4倍體積的0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH6.5),用玻璃勻漿器研磨成勻漿[18],4 ℃,10 000 r/min冷凍離心10 min,收集上清液采用質(zhì)量濃度為662 g/L的(NH4)2SO4溶液鹽析后,4 ℃,10 000 r/min 離心10 min,收集沉淀,用蒸餾水復(fù)溶,充分溶解后4 ℃,10 000 r/mnin 離心10 min,取上清液,透析除鹽后,定容得粗酶液。

1.4.4 β-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

1.4.4.1 最適催化溫度和熱穩(wěn)定性的測定

以質(zhì)量濃度為5.0 g/L水楊苷(溶于pH 4.8的醋酸緩沖液)為底物,分別于40、45、50、55、60、65和70 ℃反應(yīng)1 h后測定酶活力。

穩(wěn)定性的測定：取適量體積的粗酶液置于40、45、50、55、60、65和70 ℃水浴中保溫10 h,每隔2 h取樣,以未處理酶液的酶活力為100%,測定相對酶活力。

1.4.4.2 最適pH 值及pH穩(wěn)定性

分別配制pH為3.2、3.6、4.0、4.4、4.8、5.2、5.6和6.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液,在最適催化溫度下測定不同pH的酶活力,考察不同pH對β-葡萄糖苷酶催化反應(yīng)的影響。

穩(wěn)定性的測定：將粗酶液用醋酸-醋酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)pH值后,在最適催化溫度下保存不同時間,以未處理酶液的酶活力為100%,測定相對酶活力。

1.4.4.3 不同金屬離子對β-葡萄糖苷酶活力的影響

取適量粗酶液分別加入CaCl2、MgSO4、FeSO4和CoSO4溶液,使金屬離子終濃度為 1.0 mmol /L,在最適溫度和最適pH條件下,以不加金屬離子的酶活力為100%,測定相對酶活力。

1.4.4.4 其他抑制劑對β-葡萄糖苷酶酶活力的影響

分別在酶反應(yīng)液中加入巰基乙醇、SDS、DMSO和EDTA等常見酶抑制劑,使各抑制劑的最終濃度均為1.0 mmol/L,在最適溫度和最適pH條件下,以不加抑制劑的酶活力為100%,測定相對酶活力,考察不同抑制劑對β-葡萄糖苷酶活性的影響。

1.4.4.5 酶催化動力學(xué)模型的建立

在最適催化條件下,采用不同濃度的底物溶液進(jìn)行酶催化反應(yīng),測定反應(yīng)初速度V,繪制V-[S]曲線,構(gòu)建動力學(xué)模型,計算最大反應(yīng)速率Vmax和米氏常數(shù)。

1.4.5 蛋白質(zhì)含量和β-葡萄糖苷酶酶活力的測定

蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[19],β-葡萄糖苷酶酶活力的測定參照韓萍萍等[20]的方法。β-葡萄糖苷酶酶活為單位定義為：在最適溫度和最適pH條件下,1 min分解底物水楊苷生成1 μmol葡萄糖所需的酶蛋白量(mg)為1個酶活力單位(U)。酶活力單位以U/mg表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性

不同溫度下虎杖內(nèi)生真菌HZ001所產(chǎn)葡萄糖糖苷酶酶活力變化如圖1所示。在溫度低于60 ℃時,酶活力隨著溫度的升高而上升；反應(yīng)溫度為60 ℃時,酶活力達(dá)最大值,為134.3 U/mg；隨著溫度的繼續(xù)升高,酶活力下降,在反應(yīng)溫度為70 ℃時,該酶喪失大部分活性。

圖1 溫度對虎杖內(nèi)生真菌A.aculeatus HZ001 β-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.1 Effect of temperature on the activity of β-glucosidase produced by the endophytic fungi A.aculeatus HZ001 from Polygonum cuspidatum

虎杖內(nèi)生真菌HZ001所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性,其結(jié)果如圖2所示。當(dāng)溫度低于60 ℃時,β-葡萄糖苷酶穩(wěn)定性較好；當(dāng)溫度超過60 ℃時,β-葡萄糖苷酶穩(wěn)定性下降;當(dāng)70 ℃保存6 h時，其酶活力基本完全喪失。

圖2 虎杖內(nèi)生真菌A.aculeatus HZ001 β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性Fig.2 Thermal stability of β-glucosidase produced by the endophytic fungi A.aculeatus HZ001 from Polygonum cuspidatum

2.2 最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性

pH 會影響酶的構(gòu)象,還會影響酶與底物的解離狀態(tài),從而影響酶的活性和穩(wěn)定性。由圖3可知,在pH為4.8條件下,酶活力最高,為133.6 U/mg,在pH低于4.8條件下,隨著pH值的增加,酶活力逐漸上升；而當(dāng)pH值高于4.8時,酶活力隨著pH值的升高而顯著降低。

圖3 pH對虎杖內(nèi)生真菌A.aculeatus HZ001 β-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.3 Effect of pH on the activity of β-glucosidase produced by the endophytic fungi A.aculeatus HZ001 from Polygonum cuspidatum

虎杖內(nèi)生真菌HZ001所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶在不同pH下的穩(wěn)定性如圖4所示。該酶在pH為3.6～4.0時有較高的殘留酶活力,此條件下相對酶活力隨著保溫時間的增加而逐漸趨于平緩,相對酶活力維持在80%左右；當(dāng)pH值不斷升高時,隨著保溫時間的增加,相對酶活力逐漸降低,β-葡萄糖苷酶酶活力逐漸喪失。

圖4 虎杖內(nèi)生真菌A.aculeatus HZ001 β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性Fig.4 Thermal stability of β-glucosidase produced by the endophytic fungi A.aculeatus HZ001 from Polygonum cuspidatum

2.3 金屬離子對β-葡萄糖苷酶活力的影響

在最適條件下,金屬離子對虎杖內(nèi)生真菌HZ001所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶活力的影響如表1所示。當(dāng)體系中金屬離子濃度為1.0 mmol/L 時,Fe2+對β-葡萄糖苷酶具有一定的激活作用,相對酶活力達(dá)120.36%；而Co2+、Ca2+和Mg2+對該酶有一定的抑制作用,其中Co2+的抑制作用最明顯,在反應(yīng)液中加入該離子后,相對酶活力僅為19.65%。

表1 金屬離子對虎杖內(nèi)生真菌A.aculeatus HZ001 β-葡萄糖苷酶活性的影響Table 1 Effect of metal ions on the activity of β-glucosidase produced by the endophytic fungi A.aculeatus HZ001 from Polygonum cuspidatum

2.4 抑制劑對β-葡萄糖苷酶活力的影響

在最優(yōu)條件下,常見酶抑制劑對虎杖內(nèi)生真菌HZ001所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶活的影響如圖5所示。其中,EDTA、DMSO、巰基乙醇和SDS等4種抑制劑對該酶都有一定的抑制作用,因 EDTA與該酶催化所需的金屬離子發(fā)生絡(luò)合作用,加入EDTA后,β-葡萄糖苷酶的相對酶活力最低,僅10%左右。

圖5 抑制劑對虎杖內(nèi)生真菌Aspergillus aculeatus HZ001 β-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.5 Effect of inhibitors on the activity of β-glucosidase produced by the endophytic fungi A.aculeatus HZ001 from Polygonum cuspidatum

2.5 β-葡萄糖苷酶動力學(xué)分析

酶的動力學(xué)參數(shù)是酶學(xué)中的一個重要指標(biāo),是作為評估酶與底物親和力的重要參考。通過考察不同底物濃度對虎杖內(nèi)生真菌HZ001所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶催化反應(yīng)速度的影響,以底物濃度[S]的倒數(shù)為橫坐標(biāo),初速度V的倒數(shù)為縱坐標(biāo)作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖,得到一條直線,其回歸方程為y=4.332 1x+1.684 8(R2=0.991 4),該直線在X軸的截距為1/Km的絕對值,在Y軸的截距為1/Vmax,據(jù)此計算出米氏常數(shù)Km值為2.571 mmol/L,Vmax值為0.594 μmol/(mL·h)。

3 結(jié)論

本文以虎杖內(nèi)生真菌A.aculeatusHZ001所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶為目標(biāo),考察了溫度、pH、金屬離子和其他抑制劑等對該β-葡萄糖苷酶酶活力及穩(wěn)定性的影響。該酶最適溫度為60 ℃、最適pH 4.8,在低于60 ℃、pH 3.6～4.0條件下較穩(wěn)定。在選取的4種金屬離子中,Fe2+可以促進(jìn)該酶催化,相對酶活力達(dá)到了120.36%；而Co2+等離子明顯抑制該酶催化,相對酶活僅有19.65%。巰基乙醇、SDS、DMSO、EDTA等4種抑制劑均對該酶有抑制作用,其中EDTA的抑制作用最明顯,在該抑制劑作用下相對酶活力僅有10%左右。以水楊苷為底物時,該酶催化反應(yīng)的米氏常數(shù)Km值為2.571 mmol/L,Vmax值為0.594 μmol/(mL·h)。