宋婷,王帥靜,汪沉,呂育財(cái),羅華軍,郭金玲,龔大春*

1(中國(guó)輕工業(yè)功能酵母重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(三峽大學(xué)),湖北 宜昌,443002)2(三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院,湖北 宜昌,443002)

近年來(lái),近平滑假絲酵母Candidaparapsilosis及其來(lái)源的羰基還原酶CpCR因廣泛的底物譜和優(yōu)良的催化特性,在香精、功能食品和藥物的研發(fā)中得到廣泛應(yīng)用[1]。常用于生物催化的近平滑假絲酵母有IFO 0708[2]、CDC317[3]、CCTCC M203011[4-5]和ATCC 7330[6]等優(yōu)勢(shì)菌株,均具有自己的底物譜,其中ATCC 7330的底物適應(yīng)性最強(qiáng),不僅對(duì)4-氯-3-酮基-丁酸乙酯(4-chlor-3-keto-butyrate-ethyl ester，COBE)具有優(yōu)良的還原能力[7],而且對(duì)苯基取代的二酮、酮醛、烯酮及烯胺的立體選擇性也非常強(qiáng)[8-9],對(duì)芳基烯醇、烯醇酯及吡咯環(huán)、噻吩環(huán)取代的烯醇酯[10]也具有優(yōu)良的動(dòng)力學(xué)拆分能力。

羰基還原酶和醇脫氫酶一樣,屬于氧化還原酶類(lèi),廣泛存在于細(xì)菌、真菌、酵母和動(dòng)植物體內(nèi)[11-15],以輔酶NAD(P)+或NAD(P)H作為電子受體和供體,可以特異性地催化酮 (醛) 和醇之間的相互轉(zhuǎn)化,用于合成重要價(jià)值的羥基化合物[16-21]。2013年,AGGARWAL等[6]解析了近平滑假絲酵母CandidaparapsilosisATCC 7330的羰基還原酶CpCR的晶體結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)為4OAQ,但對(duì)該酶的高效表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)研究較少[22-24]。

為了系統(tǒng)研究該酶的酶學(xué)性質(zhì),在本課題組前期研究的基礎(chǔ)上[25-27],擬從近平滑假絲酵母C.parapsilosisATCC 7330克隆出一個(gè)編碼羰基還原酶CpCR的基因(cpcr),并在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá),利用表達(dá)載體中的His標(biāo)簽分離純化重組酶CpCR,并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行考察。本研究將為近平滑假絲酵母C.parapsilosisATCC 7330羰基還原酶CpCR的分子改造以及催化應(yīng)用奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株CandidaparapsilosisATCC 7330、大腸桿菌EscherichiacoilBL21(DE3)由本實(shí)驗(yàn)室鑒定及保存；質(zhì)粒載體 pACYCDuet-1,上海生工生物工程有限公司；Phusion DNA Polymerase、限制性酶切酶SalI 和PstI,New England Biolabs；T4 連接酶、質(zhì)粒抽提試劑盒、產(chǎn)物純化試劑盒,Vazyme 生物技術(shù)有限公司；DL 5 000 bp Marker、蛋白質(zhì)電泳 Marker、6×loading Buffer、5×蛋白上樣緩沖液,TAKARA有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG),Calbiochem 公司,純度>99.9%；Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒,北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純；PCR 引物合成及測(cè)序由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。

PCR儀(C1000 Touch)、Gel凝膠成像儀(Doc XR+),Bio-Rad公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV1800),島津企業(yè)管理有限公司；蒸汽滅菌器(SX-700)、落地高速冷凍離心機(jī)(MX-307),日本Tomy公司；超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Nano Drop One),Thermo公司；超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD),蘇州凈化設(shè)備有限公司；恒溫培養(yǎng)搖床(ZQLY-180S),上海知楚儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱(LRH-250A),泰宏醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高效表達(dá)載體的構(gòu)建

以近平滑假絲酵母ATCC 7330全基因組為模板，用引物：pACYC-F：5′-GCCTGCAG(PstI)ATGACTAAAGCAGTACCAGACA-3′；pACYC-R2：5′-TGTCGAC(SalI)TAAGCTTTGAATGCTTTGTCG-3′，擴(kuò)增CpCR基因。反應(yīng)體系：0.5 μL基因組 DNA 模板，0.5 μL Phusion DNA polymerase，10 μL Phusion GC Buffer(5×)，2.5 μL pACYC-F(10 μmol/L)，2.5 μL pACYC-R2(10 μmol/L)，1 μL dNTP(10 μmol/L)，1.5 μL DMSO，1.5 μL Mg2+，30 μL ddH2O。擴(kuò)增條件：98 ℃ 預(yù)變性 30 s，98℃ 變性 10 s，53 ℃ 退火20 s，72 ℃ 延伸 45 s，30 個(gè)循環(huán)，最后 75 ℃ 保溫5 min。

CpCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶PstI 和SalI 雙酶切后定向克隆至表達(dá)載體 pACYCDuet-1，并轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后，取適量菌液涂布在含 100 μg/mL 氯霉素的 LB 平板上，37 ℃避光培養(yǎng)，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。培養(yǎng)提取質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，獲得克隆載體，命名為pACYCDuet-1-cpcr(如圖 1)。

圖1 重組表達(dá)載體 pACYCDuet-1-cpcr 結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structural diagram of recombinant expression vector pACYCDuet-1-cpcr

1.2.2 羰基還原酶CpCR目的基因(cpcr)的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

挑取含有重組表達(dá)質(zhì)粒的單菌落于含100 μg/mL氯霉素的 LB 培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)。按OD600值為4的比例接種至100 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基(100 μg/mL氯霉素,1 mmol/L Mg2+、1 mmol/L Zn2+)中,23 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)至OD600為0.6,加入IPTG使終濃度為 0.4 mmol/L,23 ℃誘導(dǎo)16 h。同時(shí)與空載體與未誘導(dǎo)大腸桿菌做對(duì)照。離心收集菌體,用適當(dāng)體積的Buffer A (20 mmol/L Tris,500 mmol/L NaCl,5%甘油,0.5 mmol/L PMSF,pH 7.5) 重懸后,超聲破碎25 min(工作2 s,停 6 s),4 ℃,12 000 r/mim離心10 min取上清液。分別以上清液、沉淀為蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sufate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)檢測(cè),記錄并分析結(jié)果。

粗蛋白使用Ni-Agarose柱分離純化,將具有His標(biāo)簽的目的蛋白上清液經(jīng) 0.45 μm 濾膜過(guò)濾后上柱,分別用 10 倍柱體積Binding Buffer(20 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L 咪唑,500 mmol/L NaCl,pH 8.0)進(jìn)行洗雜,20 mL Elution Buffer(20 mmol/L Tris-HCl,500 mmol/L 咪唑,500 mmol/L NaCl,pH 8.0)洗脫,并按每 1 mL 流出液分管收集,保存于 4 ℃?zhèn)溆?。蛋白樣品?jīng) SDS-PAGE檢測(cè),記錄并分析結(jié)果,得到比酶活力高的重組酶CpCR。

1.2.3 蛋白的分析與測(cè)定

重組蛋白分析采用SDS-PAGE[18],濃縮膠 5%,分離膠 12%,考馬斯亮藍(lán) R-250 染色顯示蛋白條帶；蛋白濃度采用 Bradford 法[28]測(cè)定。

1.2.4 重組酶CpCR酶活力測(cè)定

羰基還原酶的酶活力檢測(cè)采用分光光度計(jì)法。測(cè)定方法：總反應(yīng)體積為 1 mL,包含750 μL 100 mmol/L PB Buffer(pH 7.5),100 μL 40 mmol/L苯甲醛,100 μL 2 mmol/L NADPH,30 ℃ 溫育 3 min,最后加入50 μL酶液,用紫外分光光度計(jì)在340 nm條件下測(cè)定吸光度值的變化。酶活力定義：在30 ℃、pH 7.5條件下,每1 min催化氧化1 μmol NADPH 所需要的酶量定義為1 U。并按公式(1)計(jì)算酶活力:

(1)

式中：ΔA為初速度范圍內(nèi)每分鐘吸光度值差值,min-1；V總為總反應(yīng)體積,mL；n為酶液稀釋倍數(shù)；6.22為NADPH的消光系數(shù),mmol/(L·cm)；d為比色皿直徑,1 cm；V為酶液添加體積,mL。

1.2.5 重組酶CpCR的酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.5.1 重組酶CpCR的溫度穩(wěn)定性考察和T50的測(cè)定

取適量酶液,采用pH 7.5 的緩沖液按照等體積比進(jìn)行稀釋,置于4～50 ℃ 條件下保溫2 h,移取部分酶液,按照1.2.4小節(jié)的方法測(cè)定剩余酶活力,通過(guò)計(jì)算相對(duì)酶活力,考察該酶溫度穩(wěn)定性,測(cè)定該酶的T50值。T50的定義：酶的相對(duì)酶活力降低至初始酶活力的50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的溫度。

1.2.5.2 重組酶CpCR的pH 穩(wěn)定性考察

取適量酶液,分別加入pH 5～8的緩沖液中(pH 5～6采用醋酸-醋酸鈉體系、pH 6～7.5采用磷酸-磷酸鹽體系、pH 7.5～8采用Tris-HCl體系分別配制100 mmol/L緩沖液),30 ℃保溫2 h,按照1.2.4小節(jié)的方法測(cè)定剩余酶活力,計(jì)算相對(duì)酶活力,考察該酶的 pH 穩(wěn)定性。

1.2.5.3 金屬離子對(duì)CpCR重組酶的影響

在反應(yīng)體系中加入 1 mmol/L 和 5 mmol/L的8種常見(jiàn)金屬離子(K+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+)的氯鹽,通過(guò)測(cè)定相對(duì)酶活力研究這些常見(jiàn)金屬離子對(duì)重組酶CpCR的影響。

1.2.5.4 重組酶CpCR的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km、Vmax、Kcat和催化特異性常數(shù)Kcat/Km測(cè)定

(1)重組酶CpCR對(duì)不同底物親和力和催化特異性常數(shù)的考察

分別以苯甲醛、正丁醛、COBE等為底物,選用0.5、1.0、1.5、2.0、3.0和4.0 mmol/L等不同濃度,參考1.2.4小節(jié)的方法選用對(duì)應(yīng)的底物測(cè)定吸光度變化值,以 Origin 8.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線(xiàn)性擬合,按照米氏方程計(jì)算并確定該條件下的重組酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km及Vmax值。依據(jù)1.2.3小節(jié)的方法測(cè)定酶的蛋白含量,結(jié)合文獻(xiàn)[23]中蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)信息和測(cè)定的相對(duì)分子質(zhì)量,計(jì)算出催化常數(shù)Kcat及催化特異常數(shù)Kcat/Km。比較重組酶CpCR對(duì)上述幾種底物的親和能力和催化效率。

(2)重組酶CpCR對(duì)輔酶NADPH和NADH親和力考察

分別以NADPH和NADH在0.5、1.0、1.5、2.0、3.0和4.0 mmol/L等不同濃度下,固定苯甲醛濃度為4.0 mmol/L,測(cè)定催化反應(yīng)的吸光度變化值,根據(jù)米氏方程確定該條件下的重組酶對(duì)2種不同輔助底物的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km及Vmax值,比較重組酶 CpCR對(duì)輔酶NADPH和NADH的親和力大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 羰基還原酶CpCR基因的表達(dá)與純化

2.1.1 目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

以近平滑假絲酵母 ATCC 7330為模板,用引物pACYC-F和pACYC-R2擴(kuò)增cpcr基因,結(jié)果如圖2 所示,可見(jiàn)約 1 100 bp 的特異性條帶,與預(yù)期條帶一致,為1 107 bp。

M-DL 5 000 DNA Marker；泳道 1～2為 CpCR 酶基因圖2 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoretic map of the PCR amplification products

2.1.2 重組表達(dá)載體pACYCDuet-1-cpcr的鑒定

對(duì)篩選到的陽(yáng)性克隆重組表達(dá)載體 pACYCDuet-1-cpcr經(jīng)PstI 和SalI 雙酶切,0.8% 瓊脂糖凝膠電泳分析,結(jié)果如圖3所示,可見(jiàn)約 4 kb的載體片段和1.1 kb的目的基因片段。將酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒送至上海生工公司測(cè)序,結(jié)果顯示該羰基還原酶基因的序列全長(zhǎng)為 1 107 bp,包含 368 個(gè)氨基酸的編碼序列。

M-DL5 000 DNA Marker；泳道 1-完整重組質(zhì)粒 pACYCDuet-1-cpcr；泳道 2～5-Pst I 和 Sal I雙酶切重組質(zhì)粒 pACYCDuet-1-cpcr圖3 重組表達(dá)載體 pACYCDuet-1-cpcr 的酶切電泳圖譜Fig.3 Digestion electrophoresis of recombinant expression plasmid pACYCDuet-1-cpcr

2.1.3 CpCR目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化

將經(jīng)測(cè)序鑒定正確的表達(dá)載體 pACYCDuet-1-cpcr轉(zhuǎn)化至宿主菌E.coliBL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)。收集濕菌體,超聲破碎后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。由圖4可知,空載質(zhì)粒菌、未誘導(dǎo)空載質(zhì)粒菌破碎液均未見(jiàn)目標(biāo)蛋白；未誘導(dǎo)的重組菌的破碎上清液和沉淀中有目標(biāo)蛋白,但含量很少；誘導(dǎo)的重組菌的破碎上清液和沉淀中均出現(xiàn)特異性條帶,結(jié)合NCBI的CpCR酶的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù),確定為 41 kDa左右,與預(yù)期目的蛋白分子量相近。由此可知,該羰基還原酶在宿主菌E.coliBL21(DE3)中表達(dá)成功,但有部分以包涵體形式不可溶表達(dá)。

M-蛋白 Marker；1-空載質(zhì)粒菌；2-未誘導(dǎo)空載質(zhì)粒菌；3-未誘導(dǎo)重組菌破碎上清液；4-未誘導(dǎo)重組菌破碎沉淀；5-誘導(dǎo)重組菌破碎上清液；6-誘導(dǎo)重組菌破碎沉淀圖4 目的蛋白CpCR的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE analysis of the CpCR protein

采用重組菌E.coliBL21(DE3)-pACYCDuet-1-cpcr在 IPTG 誘導(dǎo)下進(jìn)行異源表達(dá)含有 His 標(biāo)簽的羰基還原酶 CpCR,按照1.2.2小節(jié)的方法經(jīng) Ni-Agarose柱親和層析純化后,與重組菌菌體破壁上清液相比(圖4),純化后的目的蛋白條帶較單一(圖5泳道4)。洗脫液總蛋白含量為 8.3 mg,比酶活力為 20 U/mg,總酶活力為 168 U,總回收率為71%,純化倍數(shù)為 5.5(表1)。本研究比文獻(xiàn)[6]報(bào)道的利用谷胱甘肽(glutathione,GST)作為標(biāo)簽表達(dá)的重組酶CpCR分離純化耗時(shí)少,效率高。

M-蛋白 Marker；1-粗酶液；2-鎳柱流穿液；3-鎳柱洗滌液；4-洗脫液圖5 重組蛋白純化 SDS-PAGE 電泳Fig.5 Purification of SDS-PAGE electrophoresis by recombinant protein

表1 重組酶 CpCR 的純化Table 1 Purification of recombinant enzyme CpCR

2.2 重組酶CpCR的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.2.1 重組酶CpCR的溫度穩(wěn)定性考察

由圖6可知，該酶在 4～35 ℃的溫度范圍穩(wěn)定性很好,在33 ℃相對(duì)酶活力仍可保持在80% 左右。但是當(dāng)溫度超過(guò)35 ℃,相對(duì)酶活力迅速降低,37 ℃時(shí),該酶的酶活力降低至初始酶的50%,故該酶的T50值為37 ℃。表明該酶在低溫或者室溫下保藏較好。

圖6 重組羰基還原酶CpCR溫度穩(wěn)定性Fig.6 Temperature stability of recombinantcarbonyl reductase CpCR

2.2.2 重組酶CpCR的pH穩(wěn)定性考察

由圖7可知,重組酶 CpCR在pH 6.2～7.5穩(wěn)定性較好,相對(duì)酶活力保持在80%以上,中性條件下穩(wěn)定性最好。但該酶在pH低于6和高于8條件下,其相對(duì)酶活力降低較快。因此該酶的pH范圍相對(duì)較窄,在應(yīng)用過(guò)程中要嚴(yán)格控制其催化體系的酸堿性。SUDAKARA等[22]報(bào)道來(lái)自該菌株的另一種羰基還原酶SRED,采用GST標(biāo)簽表達(dá)重組得到,其酶pH穩(wěn)定性也較窄,其最穩(wěn)定的pH值為5。重組酶CpCR耐酸堿范圍小的特性為該酶的分子改造提供了依據(jù)。

圖7 重組酶CpCR的pH穩(wěn)定性Fig.7 pH stability of recombinant carbonyl reductase CpCR

2.2.3 8種常見(jiàn)金屬離子對(duì)重組酶CpCR的影響

很多羰基還原酶在催化氧化還原反應(yīng)時(shí)需要金屬離子的參與,有些金屬離子對(duì)氧化還原酶具有一定的激活或者抑制作用。由圖8 可知,羰基還原酶的酶活力在一定濃度下受金屬離子的影響較大。在1 mmol/L低濃度下,除Ca2+和Cu2+外,其他6種的金屬離子對(duì)重組酶CpCR 的酶活力影響較??；但在加入濃度為 5 mmol/L時(shí),抑制作用明顯,重組酶CpCR 相對(duì)酶活力降低最大的是Cu2+,幾乎降低50%,其次是Ca2+、Fe2+的影響較大,相對(duì)酶活力降低到 60% 左右,Ni2+和Mn2+相對(duì)酶活力降低到70%左右,而Zn2+的相對(duì)酶活力仍然在80%以上。因此Cu2+對(duì)CpCR 酶的抑制作用最大,分析其原因可能是由于該羰基還原酶的活性中心含有2個(gè)半胱氨酸,分別在48位和167位,Cu2+可能會(huì)與酶分子中的半胱氨酸側(cè)鏈上的巰基基團(tuán)結(jié)合,從而導(dǎo)致酶活力降低。這表明該酶的應(yīng)用環(huán)境要嚴(yán)格控制Cu2+的存在。本研究與SUDAKARA等[21]報(bào)道來(lái)自該菌株的重組酶SRED的金屬離子特性基本一致,在1 mmol/L的Cu2+作用下,SRED相對(duì)酶活力下降到初始酶活力的67%。

圖8 金屬離子對(duì)重組酶CpCR的酶活影響Fig.8 Effects of metal ions on the activity of CpCR

2.2.4 重組酶CpCR對(duì)不同底物的動(dòng)力學(xué)參數(shù)及催化特性參數(shù)的考察

由表2可知，重組酶CpCR對(duì)2種醛類(lèi)物質(zhì)的親和力均很高,最大反應(yīng)速度是阿伐他汀藥物中間體COBE的7倍。Kcat表示單位時(shí)間內(nèi)每一活性中心或每分子酶所能轉(zhuǎn)換的底物分子數(shù),反映了酶催化特定底物的能力大小。結(jié)果顯示每個(gè)重組酶CpCR分子在1 s可以轉(zhuǎn)化12個(gè)分子左右的醛類(lèi)物質(zhì),而對(duì)COBE僅能轉(zhuǎn)化近2個(gè)分子左右。Kcat/Km是衡量酶的催化效率參數(shù),又稱(chēng)特異性常數(shù),表示不同酶對(duì)特定底物的催化效率,或者表示同一種酶對(duì)不同底物的催化效率。從表2可以看出,對(duì)苯甲醛或正丁醛的催化效率是COBE的20倍左右。文獻(xiàn)[23-24]也報(bào)道了利用N-端GST標(biāo)簽分離純化的CpCR酶對(duì)苯甲醛、2,4-二氯苯甲醛的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度,和本研究基本一致。重組酶CpCR對(duì)苯甲醛、正丁醛親和力較強(qiáng),但本研究考察了重組酶CpCR對(duì)底物COBE動(dòng)力學(xué)參數(shù)和3種底物催化特異性參數(shù),進(jìn)一步揭示了該重組酶CpCR的催化特性。

表2 重組酶 CpCR 對(duì)不同底物 的動(dòng)力學(xué)參數(shù)和催化特性參數(shù)Fig.2 The dynamics and catalytic parameters of the recombinant enzyme CpCR

2.2.5 重組酶CpCR對(duì)兩種輔酶NADPH和NADH的親和力考察

按照1.2.5.4小節(jié)的方法,選取不同的NADPH和NADH的濃度開(kāi)展重組酶初速度測(cè)定,根據(jù)初速度和輔酶濃度變化曲線(xiàn),采用Origin 8.0 軟件進(jìn)行非線(xiàn)性擬合,得到NADPH的Km為0.058 mmol/L,而在NADH條件下幾乎不反應(yīng),說(shuō)明該重組酶CpCR是NADPH依賴(lài)型。與文獻(xiàn)[23]報(bào)道的GST標(biāo)簽重組CpCR酶依賴(lài)輔酶NADPH的結(jié)論一致。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)成功克隆了近平滑假絲酵母CandidaparapsilosisATCC 7330 中的羰基還原酶 CpCR 基因,并在大腸桿菌BL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)。結(jié)果表明,該羰基還原酶 CpCR 基因序列全長(zhǎng) 1 107 bp,編碼 368 個(gè)氨基酸,重組酶分子量大小在 41 kDa 左右。重組酶CpCR分離純化后對(duì)底物苯甲醛的比酶活力為 20 U/mg。His標(biāo)簽的重組酶的酶學(xué)性質(zhì)研究表明：重組酶CpCR在33 ℃以下穩(wěn)定性較好,相對(duì)酶活力在80%以上,但隨著溫度的逐漸升高,酶活力下降較快；該重組酶CpCR的適宜pH范圍在6.2～7.5,該酶在酸性和堿性條件下穩(wěn)定性不好,可以通過(guò)蛋白質(zhì)分子改造進(jìn)一步提升其適應(yīng)范圍；該重組酶CpCR在K+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+和Mn2+常見(jiàn)金屬離子中,在5 mmol/L條件下均有一定抑制,其中Cu2+對(duì)該酶的抑制作用最強(qiáng),相對(duì)酶活力下降50%左右；通過(guò)該酶對(duì)底物的親和力和催化特性的研究表明,該酶對(duì)底物苯甲醛、正丁醛親和能力強(qiáng)于COBE,對(duì)苯甲醛或正丁醛的催化效率是對(duì)COBE的20倍左右；該重組酶CpCR是一種NADPH依賴(lài)型的羰基還原酶。本研究采用His標(biāo)簽的重組表達(dá)的羰基還原酶CpCR與GST標(biāo)簽的重組酶SRED相比在耐酸堿特性上有一定的差異,與GST標(biāo)簽的重組酶CpCR的酶學(xué)性質(zhì)基本相同,但His標(biāo)簽的重組酶分離純化操作更加方便,效率更高。