鄒仁英,朱慧越,許夢(mèng)舒,田培郡,張灝,趙建新,陳衛(wèi),王剛

(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)

抑郁癥(depression)是一種常見的精神疾病,臨床表現(xiàn)為持續(xù)的情緒低落,并伴隨有快感缺失、社交孤立、自毀傾向等癥狀。抑郁癥的發(fā)病機(jī)理十分復(fù)雜,現(xiàn)有觀點(diǎn)認(rèn)為其主要與大腦中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)缺乏和下丘腦-垂體-腎上腺軸功能亢進(jìn)密切相關(guān)[1]。近年來(lái)大量研究表明,抑郁患者伴隨有腸道菌群紊亂的現(xiàn)象,主要體現(xiàn)在乳酸桿菌、雙歧桿菌等有益菌的豐度顯著降低,而好氧真菌和致病菌的豐度顯著上升[2-4]。隨著“微生物-腸-腦軸”概念的提出,越來(lái)越多的研究將腸道菌群作為防治抑郁癥的新靶點(diǎn)[1]。

胃腸消化系統(tǒng)疾病與抑郁癥具有極高的共病性,其中便秘是抑郁患者最常見的臨床伴隨癥狀之一。MOEZI等[5]針對(duì)9 000名成年人的流行病學(xué)調(diào)查顯示,患有抑郁、焦慮等精神疾病的患者出現(xiàn)便秘的概率約為29.8%。研究表明,應(yīng)激(包括急性應(yīng)激和慢性應(yīng)激)是導(dǎo)致排便紊亂的原因之一。應(yīng)激引發(fā)的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)功能異常,不僅能夠?qū)е聟⑴c消化和蠕動(dòng)的激素分泌減少,而且能夠抑制副交感神經(jīng)對(duì)結(jié)腸的支配,進(jìn)而導(dǎo)致便秘的發(fā)生[6]。此外,便秘也是使用精神類藥物的副作用之一。研究表明,三環(huán)類抗抑郁藥物具有明顯的抗膽堿作用,可拮抗副交感神經(jīng),導(dǎo)致胃腸動(dòng)力下降,從而引發(fā)便秘[7]。由于便秘的高發(fā)性,多數(shù)抑郁患者會(huì)采用瀉藥協(xié)同治療。長(zhǎng)期使用瀉藥不僅會(huì)形成藥物依賴,而且會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷腸道屏障功能,甚至導(dǎo)致結(jié)腸黑變病[8]。由于目前精神疾病的藥物開發(fā)相對(duì)滯后,能同時(shí)緩解抑郁和便秘的新療法亟待被開發(fā)。

益生菌作為一類對(duì)宿主有益的活性微生物,可參與調(diào)節(jié)腸道菌群,進(jìn)而廣泛影響宿主的生理、病理過(guò)程。2013年,來(lái)自愛爾蘭科克大學(xué)的神經(jīng)藥理學(xué)家JOHN和精神病學(xué)家TIMOTHY首次提出了“精神益生菌(psychobiotics)”的概念,不僅將傳統(tǒng)益生菌的應(yīng)用范圍推廣到了調(diào)控神經(jīng)功能、行為等方面,也為基于“微生物-腸-腦軸”的精神疾病干預(yù)策略開辟了具體的實(shí)踐途徑。益生菌對(duì)便秘的調(diào)節(jié)作用已有大量報(bào)道,有效種屬包括乳桿菌、乳球菌、雙歧桿菌、芽孢桿菌等[9-10]。此外,在針對(duì)腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)患者的臨床試驗(yàn)中,益生菌對(duì)患者也展現(xiàn)出良好的情緒和胃腸功能調(diào)節(jié)作用,例如凝結(jié)芽孢桿菌MTCC5856和長(zhǎng)雙歧桿菌NCC3001[11-12]。這些研究均提示我們,開發(fā)具有改善便秘功效的精神益生菌,對(duì)于抑郁及胃腸功能異常的預(yù)防和治療具有十分重要的科學(xué)和實(shí)踐意義。此外,目前缺乏益生菌緩解抑郁和便秘的共同機(jī)制的研究,而中樞的5-羥色胺(5-hydroxytryptomine,5-HT)和腸道的5-HT分別在調(diào)控精神疾病和胃腸道蠕動(dòng)能力方面起著重要作用,因此5-HT的生物合成及代謝可能直接影響抑郁和便秘。

本研究采用慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激構(gòu)建抑郁和便秘合并的小鼠模型,對(duì)復(fù)合乳酸菌制劑(包含BifidobacteriumbreveCCFM1025、BifidobacteriuminfantisCCFM687和PediococcusacidilacticiCCFM6432)的抗抑郁、抗便秘效果及益生菌緩解抑郁和便秘的共同機(jī)制進(jìn)行了探究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

復(fù)合乳酸菌制劑由BifidobacteriumbreveCCFM1025、BifidobacteriuminfantisCCFM687和PediococcusacidilacticiCCFM6432按照活菌數(shù)1∶1∶1復(fù)配而成,上述菌株均來(lái)自于江南大學(xué)食品學(xué)院生物技術(shù)中心菌種保藏庫(kù)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

5-羥色胺(5-hydroxytryptomine,5-HT)、5-羥色氨酸(5-hydroxytryptophan,5-HTP)、色氨酸(L-tryptophan,L-Trp)標(biāo)準(zhǔn)品,美國(guó)Sigma公司；乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸標(biāo)準(zhǔn)品,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；小鼠促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)、皮質(zhì)酮(corticosterone,CORT)ELISA試劑盒,南京森貝伽生物科技有限公司；小鼠炎癥因子TNF-α、IL-1β-ELISA試劑盒,美國(guó)R&D試劑生產(chǎn)公司；活性炭粉、qRT-PCR相關(guān)引物,上海生工生物工程股份有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

熒光定量PCR儀,美國(guó)Bio-Rad公司；Waters e2695高效液相色譜儀、Waters 2475熒光檢測(cè)器,美國(guó)Waters公司；C18色譜柱(5 μm,150 mm×4.6 mm),日本島津公司；酶標(biāo)儀、GC-MS,美國(guó)Thermo公司；5415R小型臺(tái)式離心機(jī),德國(guó)Eppendorf公司；GR60DA立式高壓蒸汽滅菌器,美國(guó)Zealway公司；高通量組織研磨器,寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 灌胃所用菌懸液的制備

實(shí)驗(yàn)用菌株(BifidobacteriumbreveCCFM1025、BifidobacteriuminfantisCCFM687、PediococcuslactisCCFM6432)分別于固體培養(yǎng)基上劃線分離,挑取單菌落于液體MRS培養(yǎng)基中活化2代,活化后接種于液體培養(yǎng)基中,37 ℃擴(kuò)培24 h,4 ℃、6 000×g離心20 min,無(wú)菌生理鹽水清洗菌泥2次,傾注法調(diào)整總活菌量在109CFU/mL,用10%脫脂乳作為保護(hù)劑,將菌液凍存在-80 ℃?zhèn)溆?；灌胃前將菌液? ℃、6 000×g離心3 min,用無(wú)菌生理鹽水重懸后使用。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及方案設(shè)計(jì)

1.3.1 動(dòng)物飼養(yǎng)

雄性C57BL/6 J實(shí)驗(yàn)小鼠(5周齡,SPF級(jí),體質(zhì)量18～20 g)購(gòu)于蘇州格瑞斯威公司。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案獲得江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理編號(hào)為：JN.No20190330c0840522)。實(shí)驗(yàn)鼠飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)中,環(huán)境溫度為(23±2) ℃,相對(duì)濕度為(50±10)%,光照模式為12 h∶12 h晝夜交替。

將24只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為空白組、慢性應(yīng)激組和益生菌干預(yù)組,每組8只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,除空白組外,其余2組小鼠采用慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)[13]造模4周。造模期間,益生菌干預(yù)組小鼠給予每只109CFU/d的復(fù)合乳酸菌懸液,其余2組小鼠每天灌胃0.2 mL的10%脫脂乳。從第36天開始,開展行為學(xué)測(cè)定。第40天進(jìn)行小腸推進(jìn)率實(shí)驗(yàn)、處死小鼠并取材。

圖1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)Fig.1 Design for animal experiments

1.3.2 糖水偏好實(shí)驗(yàn)(sucrose preference test,SPT)

參考ZHANG等[14]報(bào)道的方法。實(shí)驗(yàn)開始前對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行24 h的糖水適應(yīng),結(jié)束后禁水禁食24 h。正式實(shí)驗(yàn)時(shí),同時(shí)放置純水和1%的蔗糖水,每隔3 h記錄1次純水和糖水的消耗量。為避免實(shí)驗(yàn)鼠的飲水習(xí)慣帶來(lái)的干擾,每隔1 h調(diào)換1次水瓶的位置。

(1)

1.3.3 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)(elevated plus maze test,EPM)

參考TIAN等[2]報(bào)道的方法。將實(shí)驗(yàn)鼠面向開放臂放入高架十字迷宮的中心區(qū)域,攝像機(jī)記錄實(shí)驗(yàn)鼠6 min內(nèi)的運(yùn)動(dòng)軌跡,為減少氣味信息等干擾,每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用75%的酒精擦拭迷宮的四臂。分析實(shí)驗(yàn)鼠在開臂停留的時(shí)間及進(jìn)入開臂的頻率。

1.3.4 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(force swim test,FST)

參考DESBONNET等[15]報(bào)道的方法。將實(shí)驗(yàn)鼠放入在5 L燒杯中[水深10 cm,水溫為(23±2 ℃)],攝像機(jī)記錄6 min內(nèi)小鼠的運(yùn)動(dòng)情況,分析實(shí)驗(yàn)鼠在水中的靜止時(shí)間。

1.3.5 首粒黑便測(cè)定

參考王琳琳等[16]報(bào)道的方法。開始實(shí)驗(yàn)前,對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠禁食12 h,然后灌胃0.2 mL的墨汁,記錄完成灌胃以及排出首粒黑便的具體時(shí)刻,計(jì)算獲得首粒黑便的時(shí)間。

1.3.6 糞便含水率測(cè)定

參考XU等[17]報(bào)道的方法。每只實(shí)驗(yàn)鼠單獨(dú)放入代謝籠中,收集糞便(>5粒)于1.5 mL EP管中,稱量糞便的濕重,充分凍干后記錄糞便的干重。

(2)

1.3.7 小腸推進(jìn)率測(cè)定

參考NAGAKURA等[18]報(bào)道的方法。對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行12 h的禁食處理后,每只實(shí)驗(yàn)鼠被灌胃0.2 mL的墨汁,30 min后處死小鼠,完整剪下小鼠的幽門到盲腸段組織,測(cè)量小腸的總長(zhǎng)度和墨汁從胃幽門端向盲腸推進(jìn)的長(zhǎng)度。

(3)

1.3.8 神經(jīng)遞質(zhì)及其前體的測(cè)定

采用高效液相-熒光檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定小鼠前額葉皮質(zhì)以及結(jié)腸中5-HT和L-Trp的濃度,參考楊佳麗等[19]建立的方法。組織與無(wú)菌生理鹽水按1∶9(g∶mL)進(jìn)行勻漿,組織液在4 ℃、12 000 r/min離心15 min,取100 μL上清液,加入等體積的5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))高氯酸以沉淀蛋白,同條件下離心,將上清液過(guò)0.22 μm玻璃濾器,轉(zhuǎn)移至液相小瓶待上機(jī)檢測(cè)。使用C18色譜柱分離。流動(dòng)相A為0.1 mol/L的乙酸鈉溶液,B相為純甲醇,流動(dòng)相比例為85∶15(A∶B),檢測(cè)發(fā)射波長(zhǎng)為330 nm,激發(fā)波長(zhǎng)為290 nm。

1.3.9 血清皮質(zhì)酮和炎癥因子的測(cè)定

全血靜置2 h,3 500 r/min離心15 min,收集上層血清。ACTH、CORT與TNF-α、IL-1β的測(cè)定方法采用酶聯(lián)免疫法,具體實(shí)驗(yàn)步驟依循試劑盒說(shuō)明書。

1.3.10 結(jié)腸Htr4基因表達(dá)量的測(cè)定

以Gapdh為內(nèi)參基因,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)測(cè)定受體Htr4的基因表達(dá)量。采用Trizol裂解組織以提取結(jié)腸樣本的RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄制備穩(wěn)定性更高的模板DNA。在Bio-Rad CFX384 PCR儀器上進(jìn)行定量分析,反應(yīng)體系為10 μL,每個(gè)樣品重復(fù)3次,采用2-ΔΔCt分析。所使用基因序列來(lái)自于Primer Bank,相關(guān)信息見表1。

表1 Gapdh、Htr4基因引物序列Table 1 Gapdh,Htr4 gene primer sequence

1.3.11 短鏈脂肪酸的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)方法在毛丙永等[20]的方法上進(jìn)行合理改進(jìn)。采用GC-MS測(cè)定小鼠盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸的含量。盲腸內(nèi)容物經(jīng)過(guò)冷凍干燥后記錄干重,加入飽和NaCl溶液浸泡,均質(zhì)機(jī)粉碎后加入10%的硫酸酸化,經(jīng)過(guò)無(wú)水乙醚浸提之后,將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至裝有無(wú)水硫酸鈉的EP管,離心充分吸收水分,取上層溶有短鏈脂肪酸的有機(jī)清液,裝入氣相瓶進(jìn)行檢測(cè)。采用外標(biāo)法建立6種短鏈脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)特征峰面積計(jì)算各類短鏈脂肪酸的含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)值均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用GraphPad Prism 8作圖,空白組與慢性應(yīng)激組、益生菌干預(yù)組與慢性應(yīng)激組進(jìn)行非配對(duì)t檢驗(yàn),P<0.05代表組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以符號(hào)區(qū)分顯著性等級(jí),其中*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。相關(guān)性分析采用Pearson’s相關(guān)性系數(shù)(r值)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌緩解慢性應(yīng)激導(dǎo)致的小鼠行為異常

持續(xù)4周的慢性應(yīng)激導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)鼠呈現(xiàn)出顯著的抑郁狀態(tài)。采用經(jīng)典的強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和糖水偏好實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠的抑郁樣行為進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果如圖2所示。與空白對(duì)照組相比,慢性應(yīng)激小鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中靜止不動(dòng)的時(shí)間顯著升高(P<0.001),對(duì)糖水的攝入率顯著降低(P<0.01)。由于焦慮與抑郁在臨床上具有高度并發(fā)性[21],進(jìn)一步采用高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠的焦慮樣行為進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,慢性應(yīng)激小鼠在開放臂停留的時(shí)間和進(jìn)入開放臂的次數(shù)(P<0.001)均降低,表現(xiàn)出典型的焦慮樣表型。與慢性應(yīng)激小鼠相比,復(fù)合乳酸菌干預(yù)治療可以顯著降低小鼠在強(qiáng)迫游泳中的靜止時(shí)間(圖2-a,P<0.01),提高其糖水偏好度(圖2-b,P<0.01),并增加小鼠進(jìn)入開放臂頻率(圖2-c,P<0.01)。

a-強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn); b-糖水偏好實(shí)驗(yàn); c-高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)圖2 行為學(xué)測(cè)試結(jié)果Fig.2 Results of behavioral tests

2.2 益生菌能夠改善慢性應(yīng)激導(dǎo)致的便秘

在首粒黑便和小腸推進(jìn)率的實(shí)驗(yàn)中,相比于正常小鼠,慢性應(yīng)激小鼠排出首粒黑便的平均時(shí)間滯后了近80 min,且小腸推進(jìn)率由75%降低為44%。小腸推進(jìn)率可以反應(yīng)小腸的運(yùn)動(dòng)能力,而首粒黑便可以模擬食糜在整個(gè)腸道中的運(yùn)動(dòng)時(shí)間[4]。這表明慢性應(yīng)激誘發(fā)實(shí)驗(yàn)鼠出現(xiàn)典型的便秘癥狀。早期的臨床研究發(fā)現(xiàn),約27%的重度抑郁患者通常會(huì)伴隨便秘癥狀[22]。此外,張郭鶯等[6]采用慢性不可預(yù)知溫和刺激實(shí)驗(yàn)鼠,也觀察到典型的抑郁和便秘癥狀。益生菌干預(yù)可以改善小腸蠕動(dòng)減慢的現(xiàn)象(圖3-b,P<0.01),加快食糜的傳輸速率,進(jìn)而縮短首粒黑便的排出時(shí)間(圖3-a,P<0.05)。此外,通過(guò)糞便含水率對(duì)糞便的干結(jié)程度進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激可導(dǎo)致小鼠糞便含水率顯著降低(圖3-c,P<0.01),而補(bǔ)充復(fù)合乳酸菌后,可使得模型鼠的糞便含水率提高約14.5%,這也表明復(fù)合乳酸菌能夠潤(rùn)腸通便,具有緩解便秘的潛力。

a-首粒黑便實(shí)驗(yàn);b-小腸推進(jìn)率實(shí)驗(yàn);c-糞便含水率實(shí)驗(yàn)圖3 表觀便秘指標(biāo)測(cè)試結(jié)果Fig.3 Results of apparent constipation index

2.3 益生菌對(duì)應(yīng)激導(dǎo)致的神經(jīng)生理學(xué)異常的改善作用

大腦中5-HT的缺乏是導(dǎo)致抑郁癥的主要原因之一[23]。目前,臨床一線抗抑郁藥物——選擇性5-HT重?cái)z取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitor,SSRI),主要通過(guò)抑制神經(jīng)元對(duì)5-HT的重吸收,從而提高突觸間隙的5-HT水平[24]。結(jié)果表明,慢性應(yīng)激小鼠前額葉皮質(zhì)中5-HT含量顯著降低(圖4-a,P<0.05),這可能是導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為的直接原因。前額葉皮質(zhì)是參與情緒調(diào)控和認(rèn)知的重要腦區(qū),廣泛參與對(duì)宿主情緒、睡眠、痛覺等神經(jīng)活動(dòng)的調(diào)控。服用復(fù)合乳酸菌能夠使應(yīng)激小鼠前額葉皮質(zhì)中的5-HT、L-Trp(5-HT合成前體)的水平顯著上調(diào)(圖4-a,P<0.000 1；圖4-b,P<0.05),這提示益生菌可能通過(guò)加速外周的L-Trp進(jìn)入前額葉來(lái)促進(jìn)腦部5-HT的合成,進(jìn)而發(fā)揮抗抑郁功效。

a-前額葉皮質(zhì)5-HT水平;b-前額葉皮質(zhì)L-Trp水平;c-前額葉皮質(zhì)TNF-α水平d-前額葉皮質(zhì)IL-1β水平;e-血清皮質(zhì)酮水平;f-血清促腎上腺皮質(zhì)激素水平圖4 復(fù)合益生菌對(duì)抑郁理化指標(biāo)的緩解作用Fig.4 Effects of multi-probiotics on biochemical indicators of depression

除此之外,應(yīng)激小鼠的前額葉皮質(zhì)中TNF-α和IL-1β含量升高(圖4-c,P<0.01;圖4-d,P<0.05)。與此同時(shí),其血清中ACTH和CORT的含量也顯著升高(圖4-e,P<0.05；圖4-f,P<0.05)。這表明應(yīng)激小鼠出現(xiàn)下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA axis)功能亢進(jìn)。HPA軸是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要部分,參與控制應(yīng)激的反應(yīng),并調(diào)節(jié)許多身體活動(dòng),如消化、免疫、情緒、性行為以及能量代謝等。大量研究已經(jīng)證明,HPA軸亢進(jìn)及其伴隨的免疫系統(tǒng)失調(diào),是抑郁癥發(fā)生和發(fā)展的重要因素之一[1]。SAPOLSKY等[25]發(fā)現(xiàn),小鼠和猴子在補(bǔ)充過(guò)量CORT的情況下,其海馬和前額葉出現(xiàn)萎縮,進(jìn)而導(dǎo)致腦功能受損；WERMERSKIRCHEN等[26]采用ACTH刺激刀豆蛋白(concanavalin A,ConA)激活的淋巴細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)其促炎因子IL-2的分泌量顯著提高。臨床研究也表明,與健康對(duì)照相比,抑郁癥患者具有更高的血清皮質(zhì)醇水平[27]。PERRIN等[28]基于15項(xiàng)臨床試驗(yàn)及11項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的薈萃分析表明,糖皮質(zhì)激素水平的升高通常伴隨著促炎因子水平的上調(diào)。在采用復(fù)合乳酸菌干預(yù)后,應(yīng)激導(dǎo)致的HPA軸功能亢進(jìn)和炎癥均得到有效逆轉(zhuǎn),并趨于正常的水平(圖4-c～4-f)。

進(jìn)一步對(duì)益生菌干預(yù)的小鼠的行為學(xué)和神經(jīng)生理學(xué)檢測(cè)進(jìn)行相關(guān)性分析(圖5)。結(jié)果表明,前額葉IL-1β與小鼠的抑郁樣行為有顯著相關(guān)性(FST不動(dòng)時(shí)間：r=0.6,P<0.05；EPM開放臂進(jìn)入頻率：r=-0.5,P<0.05)；類似的,血清皮質(zhì)酮水平也與抑郁樣行為呈現(xiàn)顯著相關(guān)性(FST不動(dòng)時(shí)間：r=0.43,P<0.05；EPM開放臂進(jìn)入頻率：r=-0.53,P<0.05)。而血清皮質(zhì)酮水平與前額葉5-HT含量呈顯著負(fù)相關(guān)性(r=-0.53,P<0.05)。

圖5 行為學(xué)與神經(jīng)生理學(xué)指標(biāo)相關(guān)性分析Fig.5 Pearson’s correlation analysis among the behavioral and neurobiological dataset

這些結(jié)果進(jìn)一步表明,緩解HPA軸功能亢進(jìn)及其伴隨的炎癥,是復(fù)合乳酸菌發(fā)揮抗抑郁功效的關(guān)鍵機(jī)制。

2.4 益生菌緩解便秘的機(jī)制探究

便秘是一種常見的胃腸道疾病,其主要癥狀為排便困難、排不盡感、排便頻率低、排便時(shí)間長(zhǎng)以及糞便干結(jié)[29]。便秘的發(fā)病原因復(fù)雜,與不良生活習(xí)慣、腸道病變、藥物濫用以及精神心理因素等密切相關(guān)。研究表明,胃腸道動(dòng)力不足會(huì)導(dǎo)致小腸運(yùn)動(dòng)減緩,從而引發(fā)便秘；5-HT作為重要的神經(jīng)遞質(zhì),不僅參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)諸多功能,而且在腸神經(jīng)系統(tǒng)中也扮演著重要角色。腸嗜鉻細(xì)胞分泌的5-HT能夠刺激上行性中間神經(jīng)元釋放P物質(zhì)、降鈣素基因相關(guān)肽,這些胃腸道激素作用于興奮性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,引起腸道環(huán)形收縮,增加腸道動(dòng)力[3]。在本實(shí)驗(yàn)中,益生菌干預(yù)組結(jié)腸中5-HT的水平顯著上調(diào)(圖6-a,P<0.01),表明益生菌可能通加速結(jié)腸平滑肌的運(yùn)動(dòng),從而緩解模型鼠的便秘癥狀。

近期一項(xiàng)研究表明,阻斷腸黏膜及黏膜下層的5-HT分泌,并不能阻止擴(kuò)張引起的蠕動(dòng)[30]。這說(shuō)明5-HT并不是參與調(diào)節(jié)腸道蠕動(dòng)的唯一要素。陳小燕等[31]發(fā)現(xiàn),5-HT4受體拮抗劑——哌波色羅能夠抑制腸神經(jīng)元釋放乙酰膽堿,減緩胃腸動(dòng)力；與之相反,新型5-HT4受體激動(dòng)劑——米沙比利DSP-6952,可以提高胃腸道的蠕動(dòng)能力,增加排便的頻率[32]。這些研究直接印證了5-HT4受體對(duì)于胃腸道蠕動(dòng)的重要意義。由圖6-b可知,慢性應(yīng)激可以導(dǎo)致小鼠結(jié)腸5-HT4受體的基因表達(dá)量顯著降低(P<0.01),而在補(bǔ)充復(fù)合乳酸菌后,這種異常得到恢復(fù)(P<0.01)。

a-結(jié)腸5-HT水平;b-結(jié)腸Htr4基因表達(dá)量;c-糞便含水率d-GC-MS測(cè)定短鏈脂肪酸;e-盲腸內(nèi)容物中6種短鏈脂肪酸水平圖6 復(fù)合益生菌對(duì)便秘理化指標(biāo)的緩解作用Fig.6 Effects of multi-probiotics on biochemical indicators of constipation

除此之外,圖6-e的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,補(bǔ)充復(fù)合乳酸菌可以顯著提高應(yīng)激小鼠盲腸中短鏈脂肪酸的含量,包括乙酸(P<0.05)、丙酸(P<0.000 1)、丁酸(P<0.001)、異丁酸(P<0.001)、戊酸(P<0.01)和異戊酸(P<0.05)。與此同時(shí),應(yīng)激導(dǎo)致的糞便含水率降低也得到了顯著逆轉(zhuǎn)(圖6-c,P<0.05)。短鏈脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)是腸道厭氧微生物在結(jié)腸內(nèi)發(fā)酵碳水化合物所獲得的一類飽和脂肪酸。乙酸、丙酸、丁酸是3種主要的短鏈脂肪酸,大約占總量的90%～95%[33]。臨床研究發(fā)現(xiàn),慢性便秘和功能性便秘患者的糞便中,SCFAs的總量降低[34-35]。HURST等[36]采用結(jié)腸管腔注射的方式,分別為豚鼠補(bǔ)充乙酸鹽和丁酸鹽,證明乙酸和丁酸可促進(jìn)結(jié)腸蠕動(dòng)。類似的,王琳琳等[16]給予洛哌丁胺誘導(dǎo)的便秘模型小鼠乙酸、丙酸和丁酸治療,發(fā)現(xiàn)單酸和混酸均能改善小鼠的糞便水分含量和腸蠕動(dòng)性。MACFARLANE等[37]的研究表明,腸道SCFAs水平的升高,能夠增加糞便中Na+、K+的含量和滲透壓,從而增加糞便含水量,進(jìn)而緩解便秘癥狀。我們的結(jié)果與之前報(bào)道一致。

2.5 腸源L-Trp參與益生菌介導(dǎo)的抑郁和便秘的緩解

考慮到L-Trp/5-HT代謝在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)的中的關(guān)鍵作用,檢測(cè)了結(jié)腸中L-Trp的含量,并對(duì)益生菌干預(yù)小鼠的結(jié)腸L-Trp和腦L-Trp/5-HT進(jìn)行相關(guān)性分析,如圖7所示。結(jié)果表明,慢性應(yīng)激造成了小鼠腸道結(jié)腸L-Trp含量的降低,但服用益生菌無(wú)法逆轉(zhuǎn)這種異常。然而,結(jié)腸L-Trp的含量和前額葉皮質(zhì)中5-HT的含量呈顯著正相關(guān)(r=0.861 8,P=0.012 6；與前額葉皮質(zhì)中L-Trp含量正相關(guān),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.059 0)。

a-結(jié)腸L-Trp含量;b-結(jié)腸與前額葉皮質(zhì)L-Trp含量的相關(guān)性;c-結(jié)腸L-Trp與前額葉皮質(zhì)5-HT含量的相關(guān)性圖7 腸源L-Trp含量及其腸-腦相關(guān)性分析Fig.7 Intestinal L-Trp level and concentration analysis between gut and brain L-Trp levels

腸道是人體5-HT合成的主要來(lái)源。腸嗜鉻細(xì)胞能夠分泌機(jī)體約95%的5-HT,但由于血腦屏障的存在,外周神經(jīng)系統(tǒng)的5-HT無(wú)法穿越血腦屏障進(jìn)入大腦。然而,必需氨基酸L-Trp作為5-HT的前體物質(zhì),能夠穿過(guò)血腦屏障,進(jìn)而影響腦部5-HT的生物合成[38]。研究表明,在急性L-Trp耗竭狀態(tài)下,機(jī)體腦部的5-HT生物合成顯著降低,并誘發(fā)抑郁癥狀[39-40]。結(jié)合這些研究背景和本文的結(jié)果,我們認(rèn)為腸源色氨酸缺乏與抑郁的形成密切相關(guān),而益生菌對(duì)腸道和大腦L-Trp/5-HT合成的調(diào)控,可能是益生菌緩解便秘和抑郁的共同機(jī)制。

3 結(jié)論

本研究對(duì)復(fù)合乳酸菌制劑(包含BifidobacteriumbreveCCFM1025、BifidobacteriuminfantisCCFM687和PediococcusacidilacticiCCFM6432)的健康功效進(jìn)行評(píng)價(jià)。慢性應(yīng)激導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)典型的抑郁癥狀,而補(bǔ)充該復(fù)合乳酸菌制劑能夠通過(guò)提高小鼠腦中神經(jīng)遞質(zhì)(L-Trp、5-HT)、降低HPA軸應(yīng)激激素(ACTH、CORT)和腦中炎癥因子(TNF-α和IL-1β)的水平,實(shí)現(xiàn)對(duì)抑郁的緩解作用。此外,該復(fù)合乳酸菌制劑還能提高小鼠結(jié)腸5-HT、Htr4基因轉(zhuǎn)錄以及腸道短鏈脂肪酸的水平,顯著緩解應(yīng)激小鼠的便秘癥狀。益生菌對(duì)腸道和大腦L-Trp/5-HT合成的調(diào)控,可能是益生菌緩解便秘和抑郁的共同機(jī)制,本研究證實(shí)了該復(fù)合乳酸菌作為精神益生菌的潛力,也為抑郁癥及其伴隨胃腸道功能紊亂的治療提供了新的思路。