胡淑芳 劉玄林 楊麗

白色脂肪組織(WAT)和棕色脂肪組織(BAT)是內(nèi)分泌信號傳導和免疫炎癥反應調(diào)節(jié)的重要場所[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，白色脂肪細胞釋放代謝和免疫因子，包括瘦素、抵抗素、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素6(IL-6)等調(diào)控肥胖和2型糖尿病(T2DM)中脂肪細胞再生、分化、增生和肥大，以及胰島素抵抗(IR)和炎癥反應[3-6]。微小RNA(miRNA，miR)在代謝疾病中具有重要調(diào)節(jié)作用[7-9]。近年來研究結果顯示，上調(diào)miR-26a和miR-206-3p等表達可體外促進脂肪細胞分化[10-13]。有研究發(fā)現(xiàn)，T2DM患者和模型小鼠的miR-199a-3p表達明顯下調(diào)[14-15]；且miR-199a-3p在人脂肪細胞中呈低表達，并受游離脂肪酸和多種脂肪因子調(diào)節(jié)[16-17]。最新研究證實，miR-199a-3p在分化的人脂肪來源的間充質(zhì)干細胞中呈高表達，并下調(diào)KDM6A/WNT信號通路抑制脂肪細胞分化[18]。然而，miR-199a-3p的差異表達與脂肪細胞再生、分化之間的關聯(lián)仍有待闡明。因此，本研究通過體外實驗分析miR-199a-3p與T2DM臨床表征的相關性及其對白色脂肪細胞代謝和脂肪因子分泌及分化的影響，探討miR-199a-3p參與調(diào)控脂肪細胞再生的分子機制，為T2DM的診斷提供更好的生物標記物和治療靶點提供理論參考。

對象與方法

1.對象：2015年6月～2018年4月于我院就診的T2DM患者131例(T2DM組)，其中男101例，女30例，年齡20～38歲，平均年齡(28.3±8.6)歲。依據(jù)各臨床診斷指標水平[19]分為：輕度糖尿病組(54例)：空腹血糖(FPG)長期保持穩(wěn)定(7.0～8.4 mmol/L)，無低血糖發(fā)生，無急、慢性并發(fā)癥，體重正常，生活起居自如，能勝任正常工作；中度糖尿病組(48例)：8.4 mmol/L≤FPG≤10.1 mmol/L或波動較大，偶有反復發(fā)生糖尿病急性和慢性并發(fā)癥；重癥糖尿病組(29例)：FPG>10.1 mmol/L或波動較大，反復發(fā)生糖尿病急性并發(fā)癥，并已經(jīng)出現(xiàn)慢性并發(fā)癥。同期征集健康志愿者146例(NC組)，男118例，女28例，年齡25～39歲，平均年齡(32.3±5.4)歲。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

2.方法

(1)臨床資料收集：收集研究對象的年齡、身高、體重、腰圍、血壓。禁食12 h后采集靜脈血檢測ALT、AST、FPG、空腹胰島素(FIns)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)，并計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，HOMA-IR=FPG(mmol/L)×FIns(μU/ml)/22.5。

(2)外周血漿has-miR-199家族檢測：采用RT-qPCR法檢測患者外周血漿has-miR-199a-5p、has-miR-199a-3p、has-miR-199b-5p和has-miR-199b-3p含量，并進行相關性分析。取250 μl血漿加入750 ml Trizol顛倒混勻10次，室溫靜置5 min，4 ℃、14 000 g離心20 min,吸取上清200 μl至新EP管中，并加入200 μl異丙醇顛倒混勻10次，4 ℃、14 000 g離心10 min，棄上清，加入75%乙醇400 μl懸浮沉淀。以7 500 g離心10 min，棄上清后室溫揮干20 min，加入30 μl TE buffer溶解。采用NanoDrop 2000檢測濃度和純度。取1 000 ng RNA采用has-miR-199a-5p、has-miR-199a-3p、has-miR-199b-5p和has-miR-199b-3p特異性逆轉(zhuǎn)錄引物(由廣州銳博生物技術公司提供，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為Thermo Fisher K1621)合成cDNA，以30 ng cDNA為模板，以20 μl的RT-qPCR反應體系檢測相關基因mRNA水平(SYB Green Ⅰ 染料TaKaRa RR420A)。反應程序：95 ℃15 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，擴增40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算has-miR-199a-5p、has-miR-199a-3p、has-miR-199b-5p和has-miR-199b-3p相對表達量。

(3)外周血漿脂肪因子與炎癥因子含量檢測：取患者外周血漿100 ml，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測TNF-α、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、瘦素、脂聯(lián)素、內(nèi)脂素、抵抗素和IL-6含量。

(4)3T3-L1細胞培養(yǎng)與處理：3T3-L1細胞(購自武漢塞維爾生物技術有限公司)在42 ℃條件下復蘇后，加入10%胎牛血清(FBS)的杜氏改良Eagle(DMEM)高糖培養(yǎng)基，并置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)傳代。取5代以上細胞接種于12孔(5×104個/孔)中24 h后，更換為5 mmol/L和25 mmol/L葡萄糖完全培養(yǎng)基，同時，取12孔培養(yǎng)24 h的3T3-L1細胞(2×105個/孔)，加入分化誘導劑(1.7 μmol/L胰島素，0.5 mmol/L IBMX和1 μmol/L地塞米松)4天后，更換為維持液(2.0 μmol/L胰島素)，采用ELISA檢測上清TNF-α和IL-6含量。

(5)轉(zhuǎn)染和油紅O(ORO)染色：取miR-199a-3p類似物(mimics)和對照類似物干粉，依照說明說加入無菌TE溶液溶解至50 mmol/L。取兩支1.5 ml Ep管，各加入100 μl Opti-MEM后分別加入mimics或陰性對照類似物和5 μl Lipo2000，混勻后室溫孵育3 min，并將兩者混合再室溫孵育20 min，滴加入高糖DMEM(25 mmol/L)和低糖DMEM(5 mmol/L)處理12 h的3T3L-1細胞中繼24 h培養(yǎng)進行ORO染色。

(6)蛋白表達檢測：取接種于12孔的3T3-L1細胞，分為低糖組、高糖組、高糖+抗miR-199a-3p組。12 h后更換培養(yǎng)基，并相應轉(zhuǎn)染mimics或?qū)φ疹愃莆镏?8 h后。采用2×樣本緩沖裂解液處理細胞，超聲10 s破碎細胞并于95 ℃干熱變性5 min后，常規(guī)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，200 mA濕法轉(zhuǎn)移2 h至聚偏二氟乙烯膜上，2%牛血清白蛋白封閉30 min后加入一抗[兔抗鼠-胰島素受體底物-1(IRS-1)、兔抗鼠-磷酸化磷脂酰肌醇-3激酶P85亞基(p-P85)、兔抗鼠-磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、兔抗鼠-磷酸化糖原合成酶激酶3β(p-GSK3b)、兔抗鼠-葡萄糖轉(zhuǎn)運體-4(Glut-4)、兔抗鼠-β-actin、兔抗鼠-磷酸化信號傳導與轉(zhuǎn)錄激活因子-3(p-STAT3)、兔抗鼠-磷酸化一磷酸腺苷活化蛋白激酶(p-AMPK)、兔抗鼠-磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、兔抗鼠-NAD-依賴性去乙?；?SIRT1)和兔抗鼠-過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)]4 ℃ 12 h后，兔二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，常規(guī)三乙醇胺緩沖鹽水溶液漂洗4次，每次5 min。電化學發(fā)光顯影并應用Image J2x軟件分析灰度變化。

結 果

1.T2DM組與NC組臨床資料比較：T2DM組與NC組年齡、性別、血壓比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。T2DM組患者的BMI、腰圍、ALT、AST、FPG、FIns、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、SCr、BUN均明顯高于NC組，HDL-C明顯低于NC組(P<0.05)。見表1。

表1 T2DM組與NC組臨床資料比較

2.T2DM組與NC組miR-199a含量比較：T2DM組血漿miR-199a-3p、miR-199b-5p和miR-199b-3p含量均明顯低于NC組(P<0.05)，兩組miR-199a-5p含量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。在不同程度T2DM患者中，重度T2DM組miR-199a-3p含量(6.11±0.82)明顯低于輕、中度T2DM組(2.79±0.46、4.62±0.59，P<0.05)。

表2 T2DM組與NC組miR-199a和miR-199b含量比較

3.T2DM患者miR-199a-3p含量與血糖、生化指標的相關分析：T2DM組血漿miR-199a-3p含量與BMI(r=-0.542,P=0.011)、腰圍(r=-0.813,P=0.032)、FIns(r=-0.542,P<0.001)、FPG(r=-0.705,P<0.001)和HOMA-IR(r=-0.577,P<0.001)呈明顯負相關,與血脂、肝腎功能無顯著相關性(P>0.05)。

4.T2DM組與NC組血漿炎癥因子和脂肪因子比較：T2DM組血漿炎癥因子TNF-α、IL-6、MCP-1及脂肪因子瘦素、內(nèi)脂素、抵抗素水平均明顯高于NC組，脂聯(lián)素水平明顯低于NC組(P<0.05)。見表3。

表3 T2DM組與NC組血漿炎癥因子和脂肪因子水平比較

5.T2DM患者miR-199a-3p含量與脂肪因子和炎癥因子的相關分析：T2DM組血漿miR-199a-3p含量與TNF-α(r=-0.542,P=0.001)及IL-6(r=-0.382,P<0.001)呈負相關，與MCP-1、瘦素、脂聯(lián)素、內(nèi)脂素和抵抗素無明顯相關性(P>0.05)。

6.miR-199a-3p對脂肪細胞分化的影響：高糖組miR-199a-3p含量高于對照組(2.65±0.03比1.00±0.00，P=0.013)，分化的脂肪細胞內(nèi)miR-199a-3p含量明顯高于3T3-L1細胞(3.32±0.11比1.00±0.00，P=0.001)。高糖組TNF-α和IL-6的含量明顯高于對照組(分別為42.45±8.06比24.60±4.21、62.25±8.13比29.50±3.52，P<0.05)，分化的脂肪細胞TNF-α和IL-6含量明顯高于3T3-L1細胞(分別為43.75±8.18比27.60±4.15、52.6±8.03比23.9.60±4.19，P<0.05)。ORO染色結果顯示，高糖組較對照組油脂滴明顯增多，mimics組油脂滴數(shù)量明顯低于陰性對照類似物組，見圖1。

7.miR-199a-3p對IGF/IRS-1/PI3K/AKT信號通路的影響：高糖組IRS-1、p-P85、p-AKT、p-GSK3b和Glut-4蛋白表達均明顯高于低糖組(P<0.05)，高糖+抗miR-199a-3p組與高糖組上述指標比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

8.miR-199a-3p對STAT3、SIRT-1、PPAR-γ及AMPK/mTOR信號通路的影響:高糖組p-STAT3、p-AMPK、p-mTOR、SIRT-1和PPAR-γ蛋白表達均明顯高于對照組(P<0.05)。高糖+抗miR-199a-3p組p-AMPK、p-mTOR、SIRT-1和PPAR-γ均明顯低于高糖組(P<0.05)，而兩組p-STAT3比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3。

討 論

臨床研究結果顯示，正常體重人群和肥胖患者的WAT結構和功能存在顯著差異，肥胖患者白色脂肪細胞常表現(xiàn)為脂肪細胞肥大、異位脂肪堆積和炎癥反應[2]。白色脂肪細胞功能障礙是肥胖相關代謝并發(fā)癥IR和T2DM的決定因素；同時，脂肪組織重塑、脂肪細胞分化與再生是白色脂肪細胞功能障礙的重要調(diào)控過程之一[2]。miR-199a-3p參與調(diào)控T2DM發(fā)生發(fā)展中的多個方面，包括自由脂肪酸、IL-6等分泌[16-17]。然而，其在脂肪細胞再生中的作用尚未闡明。

本研究證實，miR-199的2個亞型(miR-199a和miR-199b)、4個成熟體(miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-199b-3p和miR-199b-5p)在不同嚴重程度T2DM患者外周血中含量不同，其中miR-199a-3p差異表達最為明顯，且其隨T2DM嚴重程度增加而逐漸降低。與早期研究結果一致[17]；同時，其含量與T2DM患者的BMI、腰圍、FIns、FPG及HOMA-IR呈顯著負相關，表明miR-199a-3p具有調(diào)控肥胖、糖代謝和IR的潛在作用。其次，本研究分析了其與炎癥因子和代謝因子之間的聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p與IL-6和TNF-α含量呈顯著負相關，表明其對脂肪因子和炎癥因子具有潛在的調(diào)節(jié)作用[14]。因而，本研究采用高糖誘導的白色脂肪細胞炎癥和脂肪再生模型，探究miR-199a-3p對炎癥和脂肪細胞分化的影響，結果顯示，高糖誘導和經(jīng)典分化的3T3-L1白色脂肪細胞的miR-199a-3p顯著降低，IL-6和TNF-α含量均顯著增加[16-17]。同時，miR-199a-3p上調(diào)顯著抑制高糖誘導的3T3-L1白色脂肪細胞油脂增加，表明miR-199a-3p具有抑制脂肪再生的作用。IGF-1/AKT/mTOR和IRS-1/PI3K/AKT是IR調(diào)節(jié)的重要信號通路，且文獻報道m(xù)iR-199a-3p可調(diào)節(jié)癌細胞中該通路的激活[14,20]。本研究結果顯示，miR-199a-3p并不影響IRS-1/PI3K/AKT通路、糖轉(zhuǎn)運體Glut-4、IGF和GSK-3b蛋白表達，提示其與IGF-1/GSK-3b依賴性促炎反應和糖轉(zhuǎn)運無關。因此本研究分析STAT3、PPAR-γ、AMPK/mTOR和SIRT-1蛋白的表達，證實miR-199a-3p通過影響PPAR-γ、SIRT-1及調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號通路參與脂肪細胞分化，且調(diào)控IL-6和TNF-α的釋放[17,21]。

圖1 ORO染色檢測miR-199a-3p對3T3-L1脂肪細胞油脂滴形成的影響(A:對照組；B：對照組+mimics；C：高糖組+陰性對照類似物；D：高糖組+mimics) 圖2 Western blot檢測miR-199a-3p對3T3-L1細胞IGF/IRS-1/PI3K/AKT信號通路的影響 圖3 Western blot檢測miR-199a-3p對3T3-L1細胞STAT3、SIRT-1、PPAR-γ及AMPK/mTOR信號通路的影響

綜上所述，T2DM患者的外周血中低表達的miR-199a-3p與血糖、IR和脂肪因子和炎癥因子呈顯著負相關，其機制可能是通過調(diào)控AMPK/mTOR及SIRT-1和PPAR-γ蛋白表達，影響IL-6和TNF-α炎癥因子釋放，參與白色脂肪炎癥和脂肪細胞分化再生。