趙琛 張尤歷 徐岷

肝癌是常見的惡性消化道腫瘤，包括肝細(xì)胞癌(HCC)、肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞癌、肝母細(xì)胞瘤及纖維板層癌。其中，HCC占肝癌的90%以上，具有早期不易發(fā)現(xiàn)、進(jìn)展快等特點(diǎn)。盡管目前在肝癌預(yù)防、篩查、診斷和治療技術(shù)方面取得了一定進(jìn)展，使我國肝癌發(fā)病率和死亡率下降[1]，但肝癌仍是全球第6位、我國第3位常見的癌癥[2]，嚴(yán)重威脅我國人民的生命和健康。血清甲胎蛋白(AFP)是目前臨床上常見的診斷肝癌的標(biāo)記物之一，但特異性卻不高。因此，尋找更加靈敏且特異的生物標(biāo)志物用于肝癌的早期診斷，對(duì)于提高肝癌患者的生存率尤為重要。

外泌體是由各種體液分泌的直徑為40～100 nm級(jí)別的膜性囊泡[3]，富含蛋白質(zhì)、RNA及核酸等物質(zhì)。其中來源于惡性腫瘤的外泌體(TDEs)更被認(rèn)為直接參與了腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥及免疫逃逸[4]。研究發(fā)現(xiàn)在某些特定疾病的患者循環(huán)中微小RNA(miRNA)的表達(dá)可發(fā)生特征性的變化，外泌體包裹下的miRNA擁有更好的生物穩(wěn)定性，從而使研究外泌體源性的miRNA較循環(huán)中的miRNA有著更好的前景。腫瘤細(xì)胞較正常細(xì)胞可分泌更多的外泌體，使得外泌體有可能成為早期診斷肝癌或肝癌轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物，因此,充分了解外泌體促進(jìn)肝癌進(jìn)展的機(jī)制，對(duì)肝癌的早期診斷和預(yù)后具有重要意義。

一、外泌體和miRNA

1.外泌體結(jié)構(gòu)和功能:外泌體作為一類細(xì)胞外囊泡(EVs)，最早是由Harding和Johnstone等提出。外泌體多指在正?；虿±頎顟B(tài)下，由各種細(xì)胞分泌的直徑約40～100 nm的膜性囊泡，其中含有大量的生物活性成分，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、信使RNA(mRNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)和miRNA。許多細(xì)胞都可以分泌外泌體，如B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等[5]。外泌體具有脂質(zhì)雙分子層的結(jié)構(gòu)特征，能夠有效保護(hù)其內(nèi)容物的活性，方便其在細(xì)胞間穿梭以促進(jìn)細(xì)胞間的通訊。外泌體可以與特定的受體結(jié)合，通過釋放囊泡內(nèi)容物的方式進(jìn)行信息傳遞，在細(xì)胞與其微環(huán)境之間的細(xì)胞間通信中起關(guān)鍵作用[6]。正是通過這種方式，外泌體可參與包括細(xì)胞通訊、腫瘤增殖遷移、血管生成在內(nèi)的多種生理和病理過程。

2.miRNA:miRNA是一類長度約為19～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA。miRNA可通過直接誘導(dǎo)mRNA降解，也可通過與靶基因mRNA的3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)中的互補(bǔ)堿基結(jié)合來抑制翻譯，從而反向調(diào)節(jié)基因表達(dá)[7-8]。miRNA可通過上述機(jī)制調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的分化、增殖和遷移。miRNA已被證實(shí)在多種腫瘤中的表達(dá)高于正常組織。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞除了分泌更多的外泌體外，其分泌的外泌體中miRNA含量也比正常細(xì)胞分泌的多。Kogure等[9]提取了肝癌細(xì)胞株Hep3B衍生的外泌體，共檢測出134種不同類型miRNA，其中55種miRNA表達(dá)量較其供體細(xì)胞上升4倍，25種miRNA含量上升166倍，最重要的是有11種miRNA僅在外泌體中表達(dá)。

二、外泌體源性的miRNA在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用

細(xì)胞間的通訊在肝癌的發(fā)生中起重要作用。除了已有的自分泌和旁分泌等通訊方式外，外泌體為細(xì)胞信號(hào)之間的通信提供了一種獨(dú)特方式。在大多數(shù)的外泌體中，特異性miRNA與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[10]。相關(guān)研究結(jié)果證實(shí)，與正常肝組織比較，miR-21、miR-96和miR-151在肝癌組織中的表達(dá)水平增加[11]。相比之下，miR-122a和miR-199a的表達(dá)水平在肝癌組織中則降低[12]。

1.外泌體源性的miRNA通過影響微環(huán)境促進(jìn)肝癌的增殖、遷移:1889年P(guān)aget在癌癥的背景下提出了“種子-土壤”假說來說明腫瘤微環(huán)境的重要性[13]。TDEs在腫瘤與其微環(huán)境中的作用尤為突出。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可通過免疫逃逸、代謝重組等方式創(chuàng)造一個(gè)有利于惡性腫瘤發(fā)展的前微環(huán)境。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)是一種特殊類型的成纖維細(xì)胞，是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分[14]，通過多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和侵襲。Zhou等[15]提取了3種不同的肝癌細(xì)胞株(97H、LM3及LO2)的外泌體，對(duì)后者進(jìn)行miRNA測序，發(fā)現(xiàn)其miR-21、miR-27、miR-126水平均顯著增高，miR-21的表達(dá)水平升高最為顯著。將提取后的外泌體與肝星狀細(xì)胞株(LX-2)共培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)LX-2激活成高表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，miR-21可通過下調(diào)其靶基因PTEN，激活PDK1/Akt通路，促進(jìn)LX-2向CAFs轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。此外Fang等[16]研究證明肝癌細(xì)胞衍生的外泌體中miR-1247-3p通過下調(diào)靶基因B4GALT3激活核因子(NF)-κB信號(hào)通路，活化CAFs促進(jìn)肝癌的肺轉(zhuǎn)移。以上研究結(jié)果均表明外泌體源性的特異miRNA可以通過影響靶基因，促進(jìn)CAFs的活化，進(jìn)而促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。

2.外泌體源性的miRNA促進(jìn)肝癌的免疫逃逸:腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)也是腫瘤微環(huán)境中的一類重要細(xì)胞，主要分為TAMs-M1型和TAMs-M2型，其中M2型可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。肝癌衍生的外泌體可通過激活NF-κB信號(hào)通路和誘導(dǎo)促炎癥因子來重建巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致TAMs-M2活化，使肝癌逃避免疫應(yīng)答[17]。Yin等[18]研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞分泌的外泌體可將miR-146a-5p轉(zhuǎn)運(yùn)至巨噬細(xì)胞，通過改變細(xì)胞因子來減弱巨噬細(xì)胞的抗原呈遞作用，并促進(jìn)巨噬細(xì)胞向TAMs-M2型轉(zhuǎn)化，造成T細(xì)胞死亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SAL4-STAT 3可協(xié)同調(diào)控miR-146a-5p的表達(dá)，過表達(dá)的miR-146a-5p可通過促進(jìn)TAMs-M2型的激活進(jìn)而促進(jìn)肝癌的免疫逃逸。

3.外泌體miRNA和肝癌化療耐藥:HCC患者對(duì)5-氟尿嘧啶(5-Fu)和阿霉素等常規(guī)化療藥物易產(chǎn)生耐藥性。在肝癌衍生的外泌體中，miR-122的表達(dá)量顯著低于正常肝臟組織中的外泌體，miR-122可通過下調(diào)多藥耐藥基因(MDR1)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶π等[19]相關(guān)耐藥基因來增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的化療敏感性。Fu等[20]對(duì)耐藥細(xì)胞株(bel/5-Fu)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-32-5p、miR-21-5p、miR-19a-3p、miR-92a-3p和miR-486-5p在bel/5-Fu均呈高表達(dá)，其中miR-32-5p的表達(dá)最明顯。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，bel/5-Fu通過外泌體將miR-32-5p轉(zhuǎn)運(yùn)到敏感細(xì)胞，并激活PI3k/Akt通路，通過調(diào)節(jié)血管生成和EMT誘導(dǎo)肝癌的多重耐藥。Raji等[21]的研究結(jié)果表明，miR-106a/b在順鉑耐藥的肝癌中高表達(dá)，miR-106a/b通過靶向調(diào)節(jié)SIRT1的表達(dá)影響Hela細(xì)胞對(duì)順鉑的化學(xué)敏感性。

三、外泌體源性的miRNA在肝癌中的應(yīng)用

外泌體中富含脂質(zhì)，對(duì)外泌體的結(jié)構(gòu)和內(nèi)容物起保護(hù)作用，使內(nèi)在的miRNA表達(dá)穩(wěn)定。此外，外泌體miRNA的表達(dá)水平在一定程度上可反映出細(xì)胞的狀態(tài)，使外泌體中的miRNA具有作為潛在的早期診斷標(biāo)志物、評(píng)估預(yù)后及治療的價(jià)值。

1.外泌體miRNA可作為肝癌診斷的血清標(biāo)記物:Jun等[22]對(duì)正常人、慢性乙型肝炎和肝癌患者血清外泌體miR-21和總循環(huán)miR-21的表達(dá)水平進(jìn)行比較分析后發(fā)現(xiàn)，肝癌組患者血清外泌體中miR-21水平明顯高于慢性乙型肝炎組(2.12倍)和健康組(5.57倍)。此外，肝癌患者中總循環(huán)miR-21表達(dá)量雖也升高，但不如血清外泌體中miR-21表達(dá)升高明顯；且外泌體中miR-21表達(dá)水平升高，與慢性肝硬化和肝癌的TNM分期呈正相關(guān)[23]，這一觀察結(jié)果表明，血清外泌體中某些miRNA，如miR-21可作為一種潛在的生物標(biāo)記物，用于肝癌的早期檢測和篩選。

2.外泌體miRNA與肝癌的治療:外泌體作為運(yùn)輸載體可運(yùn)送特異性的小RNA分子，通過控制腫瘤生長實(shí)現(xiàn)治療作用，開始受到廣泛關(guān)注。外泌體作為運(yùn)輸載體較傳統(tǒng)的運(yùn)輸載體具有獨(dú)特優(yōu)勢：外泌體的雙層膜結(jié)構(gòu)和特異的表面蛋白可輕松進(jìn)入靶細(xì)胞中，作為一種高效的載體發(fā)揮作用；外泌體還可由自身細(xì)胞分泌，不易引起免疫反應(yīng)。間充質(zhì)干細(xì)胞具有分泌大量外泌體的功能，Lou等[24]用脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞(AMSC)轉(zhuǎn)染miR-122，收集AMSC衍生的外泌體加入受體肝癌細(xì)胞中，結(jié)果顯示，miR-122轉(zhuǎn)染的AMSC能有效產(chǎn)生富含miR-122的外泌體，通過改變肝癌細(xì)胞中miR-122靶基因的表達(dá)使癌細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感。此外，在動(dòng)物模型體內(nèi)注射miR-122外泌體可顯著提高索拉非尼的抗腫瘤效果。上述研究結(jié)果均表明外泌體作為一種獨(dú)特的載體，在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，為臨床上肝癌的診斷與治療提供了一種新的思路。

3.外泌體miRNA與肝癌的預(yù)后評(píng)估:Shi等[25]收集了126例HCC患者及21例健康受試者的血清，從中提取外泌體并檢測miR-638表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)HCC組受試者外泌體miR-638水平顯著降低，降低程度與肝癌大小和TNM分期呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步分析表明，血清miR-638水平降低的肝癌患者3年和5年生存率較低。另有研究結(jié)果指出，血清外泌體中miR-718可通過調(diào)節(jié)HOXB8的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞分化。此外，在肝癌患者肝移植治療后，復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)的肝癌患者血清外泌體中miRNA-718表達(dá)水平也存在差異，肝癌復(fù)發(fā)的患者血清外泌體中miRNA-718呈低表達(dá)，未復(fù)發(fā)的患者血清外泌體中miRNA-718呈高表達(dá)，進(jìn)一步說明miRNA-718的低表達(dá)與肝癌預(yù)后不良密切相關(guān)[26]。以上研究結(jié)果均表明，血清外泌體中miRNA在肝癌中可作為新的標(biāo)記物用于評(píng)估預(yù)后情況。

外泌體作為一種新的細(xì)胞間的傳遞介質(zhì)，參與了多種生理病理過程。本文綜述外泌體在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，并對(duì)其在肝癌的臨床應(yīng)用前景進(jìn)行展望。然而，目前外泌體在肝癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制尚未明確，阻礙了其在肝癌診斷和治療中的應(yīng)用。此外，盡管外泌體作為臨床診斷肝癌的標(biāo)記物具有前景，但由于現(xiàn)階段血清外泌體提取、純化、鑒定等步驟的繁瑣及困難，距離應(yīng)用于臨床還需要一段時(shí)間，未來的研究應(yīng)集中在改進(jìn)提取、純化外泌體的方法，爭取實(shí)現(xiàn)其在臨床中的早期應(yīng)用。