楊忠霞 丁方回 張偉 蔣妮 毛小榮

原發(fā)性肝癌(PLC)是目前我國第4位常見惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因[1-2]，早期不易診斷，大部分患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，失去手術(shù)治療機(jī)會。由于PLC存在較高的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險，患者5年生存率不到12%[3]。研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇蛋白多糖3(GPC3)蛋白、信使RNA(mRNA)與PLC的診斷及預(yù)后具有相關(guān)性，但收集更為方便、經(jīng)濟(jì)的GPC3-循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)是否對PLC診斷及病情評價具有價值尚不明確，本研究旨在探討GPC3-ctDNA對PLC診斷及病情評價的作用。

對象與方法

1.對象：選取2017年9月～2018年9月于我院感染科住院治療的PLC患者80例(PLC組)，PLC診斷符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中男59例，女21例，年齡26～68歲，平均年齡(56.6±11.2)歲。68例(85%)患者有肝硬化病史。選擇同期就診于我院的肝硬化患者30例(肝硬化組)，肝硬化診斷符合2019年我國《肝硬化診治指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)并排除合并肝癌者，其中男18例，女12例，年齡18～65歲，平均年齡(51.3±11.2)歲；慢性肝炎患者30例(慢性肝炎組)，慢性肝炎診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》診斷標(biāo)準(zhǔn)并排除合并肝癌者，其中男16例，女14例；年齡25～58歲，平均年齡(31.5±6.8)歲。選取健康體檢者(否認(rèn)既往慢性肝炎等其他疾病史)30例作為正常組，其中男17例，女13例，年齡23～67歲，平均年齡(52.6±12.0)歲。4組患者在年齡、性別構(gòu)成及3組肝臟疾病患者的病因構(gòu)成比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1。本研究經(jīng)蘭州大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)[LDYYLL2020-04號]，受試者均知情同意。

表1 PLC組、肝硬化組和慢性肝炎組患者病因分布[例，(%)]

2.方法

(1)臨床資料收集：觀察PLC組患者入組時的體力、神志情況。經(jīng)上腹部CT或MRI檢查后，收集PLC患者的癌結(jié)節(jié)數(shù)目、腫瘤最大直徑、門靜脈癌栓情況及腹腔積液狀況。

(2)實(shí)驗(yàn)室檢查：所有入組者采集空腹靜脈血 3 ml置于乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝采血管中，4 ℃下以2 000 r/min離心10 min，取上清液置于-80 ℃冰箱保存。所有PLC患者入組時均留取空腹靜脈血(留取血標(biāo)本前均未行手術(shù)、介入及靶向治療等抗腫瘤治療)，檢測ALT、AST、總膽紅素(TBil)、白蛋白、凝血酶原時間(PT)、甲胎蛋白(AFP)等。

(3)循環(huán)游離DNA(cfDNA)分離和提純：采用血液微量基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取血漿cfDNA，為減少誤差，所有標(biāo)本用同一批號試劑盒，操作按照說明書進(jìn)行，將提取的溶液儲存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

(4)實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測ctDNA含量：通過生物合成人GPC3 DNA序列作為標(biāo)準(zhǔn)品(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，然后將該序列片段克隆到質(zhì)粒pUC57中，經(jīng)過驗(yàn)證后純化并提取DNA作為本研究標(biāo)準(zhǔn)品。血漿GPC3-ctDNA含量通過實(shí)時熒光定量PCR檢測(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)。GPC3基因上游引物：5’-GGAGCAAGACGTGACCTGAA-3’；下游引物：5’-CGGCCACAGTCCTTACTGAA-3’。

結(jié) 果

1.PLC組患者的臨床特征：55%的PLC患者AFP<400 μg/L，體力活動狀態(tài)(ECOG PS評分)為0～2分；腫瘤結(jié)節(jié)為多發(fā)(數(shù)目≥2個)，腫瘤直徑>3 cm，肝功能Child-Pugh分級為A/B級。9例患者發(fā)生肝外轉(zhuǎn)移，其中8例腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，1例骨骼轉(zhuǎn)移。見表2。

表2 80例PLC組患者臨床特征

2.GPC3-ctDNA定量分析結(jié)果：PLC組、肝硬化組、慢性肝炎組、正常組ctDNA含量分別為(100.95±85.16)copies/μl、(34.12±14.01)copies/μl、(28.60±5.55)copies/μl、(25.40±8.53)copies/μl。PLC組明顯高于肝硬化組、慢性肝炎組和正常組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；肝硬化組、慢性肝炎組與正常組兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3.GPC3-ctDNA用于PLC診斷的敏感性和特異性分析：ROC曲線分析結(jié)果顯示，ctDNA單獨(dú)診斷PLC的ROC曲線下面積(AUC)為0.737(95%CI0.561～0.913)，約登指數(shù)最大為0.63，對應(yīng)的特異性是84%，敏感性是63%。AFP單獨(dú)診斷PLC的AUC為0.725(95%CI0.613～0.958)，約登指數(shù)最大為0.58，對應(yīng)的特異性是73%，敏感性是82%。ctDNA聯(lián)合AFP診斷PLC的AUC為0.861(95%CI0.718～1.000)，約登指數(shù)最大為0.65，對應(yīng)的特異性是94%，敏感性80%。

4.不同臨床特征PLC患者GPC3-ctDNA水平比較：PLC組中腫瘤直徑>3 cm且發(fā)生門靜脈癌栓的患者ctDNA水平較腫瘤直徑≤3 cm且無門靜脈癌栓的患者高(P<0.05)。BCLC進(jìn)展期及終末期患者ctDNA水平較早中期患者高(P<0.05)。不同年齡、性別、Child-pugh分級的PLC患者ctDNA水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同臨床特征PLC患者GPC3-ctDNA水平比較

討 論

PLC惡性程度高，預(yù)后差，早期診斷、早期治療、密切監(jiān)測病情變化對改善預(yù)后具有重要價值。AFP是目前PLC臨床診斷及病情評價常用的血液標(biāo)志物，但敏感性和特異性仍較低[4-5]。肝臟穿刺活組織檢查由于其有創(chuàng)性及受到基礎(chǔ)肝病的限制，不易在臨床常規(guī)、反復(fù)應(yīng)用[6]。目前，AFP與其他指標(biāo)聯(lián)合檢測被認(rèn)為有望提高PLC的早期診斷率[7]。

ctDNA是存在于腫瘤患者外周血液中的DNA片段，攜帶有腫瘤遺傳信息。研究表明，多種腫瘤患者的血漿中可檢測到ctDNA[8-9]。GPC3表達(dá)與PLC的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)，研究表明PLC癌組織中GPC3蛋白高表達(dá)，而在正常肝組織中不表達(dá)或低表達(dá)[10-11]，因此，本研究以GPC3基因作為檢測ctDNA的靶基因。而GPC3-ctDNA是否能夠幫助診斷疾病尚不明確，本研究分別對PLC、肝硬化、慢性肝炎及正常人群外周血中GPC3-ctDNA水平進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，PLC患者外周血中GPC3-ctDNA水平顯著升高，提示GPC3-ctDNA具有成為診斷PLC生物標(biāo)志物的潛力。本研究中ROC曲線分析結(jié)果顯示，相較于單一ctDNA定量或單一AFP檢測，GPC3-ctDNA聯(lián)合AFP可以提高對PLC的診斷效能。

PLC易發(fā)生門靜脈侵犯、腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后差。其中門靜脈侵犯是臨床中最多見的PLC進(jìn)展形式。除了在診斷方面的價值外，ctDNA在病情嚴(yán)重程度和疾病進(jìn)展方面也有重要意義。Ren等[12]對79例PLC患者、20例肝硬化但無PLC患者和20例正常對照者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，ctDNA水平與腫瘤大小及TNM分期相關(guān)，且與3年無病生存率和總生存率呈負(fù)相關(guān)。本研究得到了相似的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)腫瘤發(fā)生門靜脈侵犯時，GPC3-ctDNA水平明顯升高；且BCLC分期為進(jìn)展期和終末期的患者GPC3-ctDNA水平明顯高于早中期患者。因此ctDNA有望用于PLC病情及疾病進(jìn)展的評估。

綜上所述，PLC患者外周血液中可檢測到ctDNA，聯(lián)合AFP在診斷PLC中具有較高的敏感性及特異性，且ctDNA水平與腫瘤進(jìn)展具有相關(guān)性，能夠幫助優(yōu)化PLC的臨床管理。