蔣湘，朱文燕，許樂樂，呂美霞，魏亦彤，王鋰韞，陳道海

（1.嶺南師范學院生命科學與技術學院，廣東 湛江 524048；2.廣東省粵西海鮮資源可持續(xù)利用工程技術研究中心，廣東 湛江 524048）

鹵蟲（Artemia salina）又稱鹽水豐年蟲、豐年蝦、鹽蝦或鰓足蟲，為廣溫耐高鹽甲殼動物。鹵蟲分布很廣，世界各地沿海高鹽水域、海岸鹽田及內陸鹽湖等均有分布，中國主要產地為長江以北沿海各地，天津長蘆鹽場是最著名的鹵蟲產地[2]。鹵蟲生長迅速，繁殖周期短，幼體和成體是海水、淡水養(yǎng)殖動物的優(yōu)良鮮活餌料、天然誘食劑[3]；鹵蟲能濾食鹽田中的藻類和固體懸浮顆粒，改良水質，提高產鹽質量[4]。鹵蟲的生活習性和生理結構常用于環(huán)境污染物評價和生態(tài)毒理學研究中，是標準的實驗生物[5,6]。

近年來，鹵蟲作為一種水產高蛋白食物原料在沿海各地已經被廣泛開展養(yǎng)殖。隨著沿岸地域資源開發(fā)，灘涂面積縮減，加之抗生素等漁藥濫用、水體富營養(yǎng)化、無序粗放的養(yǎng)殖模式等等嚴重影響到了鹵蟲養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。在污染較為嚴重的某些海域，一些重金屬污染指數如Hg、Cd、As 等達到中等生態(tài)危害及以上級別[7]，廣泛開展了重金屬離子對鹵蟲等水生動物毒性的相關研究。宮春光等[8]研究重金屬Hg2+、Cu2+、Cd2+對渤海灣鹵蟲無節(jié)幼體的急性毒性。張明興等[9]研究了重金屬Cu2+、Cd2+和聚苯乙烯微球對鹵蟲的復合毒性效應。吳宗凡等[10]評價及預測了重金屬Zn2+、Cd2+與有機磷農藥二元混合物對鹵蟲的聯(lián)合毒性。Nogueira 等[11]研究NiO、Fe2O3和TiO2三種金屬廢棄物對6 種水生動物毒性。Marilena 等[12]研究了重金屬污染物對意大利本地與外地鹵蟲品種的毒性。以上研究多集中在北方、內陸等地域并通過人工調配海水開展鹵蟲毒理研究，而有關南方廣東沿海海域利用天然鹵水開展金屬離子的鹵蟲毒理研究報道較少。地域及水化學成分差異等條件下鹵蟲對金屬離子的耐受性尚不清楚。

本實驗在前人研究基礎上通過開展Fe3+、Cu2+、Zn2+離子對鹵蟲早期幼體毒性研究，以期為廣東沿海鹵蟲養(yǎng)殖及海域污染監(jiān)測提供可行的觀測指標和參考數據。

1 材料與方法

1.1 實驗地點與材料

2019 年7 月20 日實驗在湛江嶺南師范學院水生動物實訓基地內開展。實驗用鹵蟲休眠卵為湛江海神生物科技有限公司提供，鹵蟲卵化28～30 h，孵化水溫27℃、光照2 000 lx、鹽度30，溶解氧＞7 mg/L，孵化密度0.5 g/L，全程持續(xù)增氧。孵化用鹵水來自湛江坡頭區(qū)南三島南三鹽場，鹵水鹽度58，釋稀至30，實驗用水經過濾、消毒、曝氣、沉淀、增氧。孵化前淡水浸泡30 min 左右，上午8 點開始孵化，次日12 點于恒溫光照培養(yǎng)箱中開始毒理實驗。實驗容器為直徑11 cm、高3 cm 圓柱形食品級塑料容器，有效水體200 mL。所用實驗試劑為分析純CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、Fe2（SO4）3。實驗溶液的配制：通過分析天平稱取一定質量的CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、Fe2（SO4）3，用去離子純凈水配制質量濃度為1 g/L 的Cu2+、Zn2+和Fe3+母液，定容500 mL，根據實驗濃度計算母液體積，用移液槍控制精度，減少實驗誤差。

1.2 實驗設計

按水生動物毒理學試驗方法開展預實驗[13]，按等比間距設置濃度區(qū)間找到3 種金屬離子對鹵蟲的24 h 全死亡和48 h 全存活濃度，再根據濃度區(qū)間上下限按等對數間距設置濃度梯度開展正式實驗（表1），Cu2+濃度區(qū)間為0.5～257.24 mg/L；Zn2+濃度區(qū)間為4.01～512.86 mg/L；Fe3+濃度區(qū)間為32.14～127.74 mg/L，1 個濃度梯度設置3 個平行組，1 種金屬離子設置3 個對照組，每組放鹵蟲幼體30只，試驗開始后不充氣、不換水、不投喂，6 h、12 h、24 h、48 h 觀察幼蟲的存活狀態(tài)，統(tǒng)計死亡幼體數量并用吸管出死亡幼體，計算所有試驗組的平均死亡數量，毒性實驗重復2～3 次，可根據實驗結果按對數間距再添加適宜濃度梯度。死亡判斷標準為：幼體沉于底部，碰觸附肢10 s 不動。

1.3 數據分析

用SPSS21.0 軟件處理數據，建立概率單位-質量濃度的直線回歸方程，繪制出根據模型擬合的毒性預測回歸曲線，估算Cu2+、Zn2+、Fe3+對鹵蟲幼體的24 h、48 h 半致死濃度（LC50）及95%置信區(qū)間，實驗中對照組出現死亡的數據校正方法，根據公式：P=校正[13]，其中P'為實驗組死亡百分數，c 為對照組死亡百分數，P 為校正后的死亡百分數。安全濃度（Sc）公式：Sc=[14]。

2 結果與分析

2.1 重金屬離子對鹵蟲毒性試驗結果

3 種重金屬離子對鹵蟲毒性試驗結果如表1 所示。由表1 可知，隨著離子濃度的增加鹵蟲死亡數量明顯上升，Cu2+、Zn2+、Fe3+濃度為257.24 mg/L、512.86 mg/L、127.74 mg/L 時，鹵蟲48 h 死亡率均達到100%，配對樣本雙側t 檢驗得到，同一濃度下的Cu2+、Zn2+的24 h 與48 h 平均死亡數量存顯著差異（P<0.05）；而同一濃度的Fe3+的24 h 與48 h 平均死亡數量沒有顯著差異（P>0.05）。由此推測，Fe3+對鹵蟲毒性效應時間比Cu2+、Zn2+要短。Cu2+、Zn2+對照組有死亡個體（≤10%），需對照死亡數量進行校正。

表1 重金屬離子對鹵蟲毒性試驗結果Tab.1 Test results of the toxicity of heavy metal ions to early larvae of brine shrimp Artemia saline

2.2 概率單位回歸分析結果

Cu2+、Zn2+和Fe3+對鹵蟲急劇毒性影響概率單位法分析結果如表2、表3 和表4 所示。在PROBIT回歸分析中，當協(xié)變量（濃度）與概率之間不存在線性關系時，需要選擇對協(xié)變量（濃度）的轉換方式（自然對數或常用對數變換），SPSS 默認無轉換。模型通常用累積標準正態(tài)分布函數的反函數來轉換響應比例。由表2 可知3 種離子24 h、48 h 的概率單位（PROBIT）轉換值與濃度或濃度對數的回歸直線及其參數估計值、估計標準誤、顯著性檢驗、95%置信區(qū)間等。所有參數估計均達到極顯著性水平。

表2 概率單位回歸參數及置信區(qū)間估計表Tab.2 The estimation table of probability unit regression parameters and confidence interval

表3 概率回歸擬合度卡方檢驗表Tab.3 Chi-square test table of probabilistic regression fit

回歸方程：

表3 中顯示概率回歸擬合度卡方檢驗結果。Pearson 擬合優(yōu)度檢驗值均大于0.05 顯著性水平，說明模型能較理想地擬合實驗數據。由表4 可知3種重金屬離子24 h 和48 h 的半致死濃度與安全濃度值，通過以上擬合的回歸方程估算半致死濃度及濃度95%的置信區(qū)間，并求得3 種離子的安全濃度值。由表4 可知，Cu2+對鹵蟲幼體的24 h、48 h 半致死質量濃度為89.875 mg/L、27.726 mg/L;Zn2+對鹵蟲幼體的24 h、48 h 半致死質量濃度為283.445 mg/L、92.268 mg/L；Fe3+對鹵蟲幼體的24 h、48 h 半致死質量濃度為81.452 mg/L、77.567 mg/L；Cu2+、Zn2+、Fe3+安全濃度分別為0.792 mg/L、2.933 mg/L、21.103 mg/L。鹵蟲幼體對3 種重金屬離子的敏感順序依次為Cu2+＞Zn2+＞Fe3+。

表4 半致死濃度與安全濃度Tab.4 LC50 and safe concentration of Cu2+,Zn2+,and Fe3+to early larvae of brine shrimp Artemia saline

2.3 擬合回歸曲線圖

圖1～圖6 表示3 種離子24 h、48 h 的概率單位（PROBIT）轉換值與濃度或濃度對數的散點圖，PROBIT 回歸過程中參數估計采用極大似然估計法，實驗鹵蟲樣本通過隨機方式抽取開展實驗，樣本與總體分布具有同一性。圖中添加擬合回歸曲線；對所有試驗組數據的死亡率（二項分布數據）經PROBIT 轉換得到對應累積標準正態(tài)分布函數的反函數值Φ-1（P），（死亡率0%、100%轉換后的反函數值無窮小或無窮大，故不參與模型擬合），概率單位函數y=Φ-1（P）+5，因此可求得：當概率單位y=5 時，Φ-1（P）=0，x0=μ=LC50，即縱軸上刻度0 值所對應的橫軸濃度即為所估算的半致死濃度值。如圖1～圖6 所示：Cu2+、Zn2+、Fe3+濃度或濃度對數對應的（PROBIT）轉換值與所擬合曲線基本上一致，大部分散點落在擬合曲線上或靠近曲線。由圖1～圖6 可知：24 h Cu2+、24 h Zn2+、48 h Zn2+在回歸分析過程中，協(xié)變量（濃度）不作對數變換；48 h Cu2+、24 h Fe3+、48 h Fe3+回歸分析中，協(xié)變量（濃度）作常用對數變換均能較好地擬合試驗數據，求得回歸方程。

圖1 24 h Cu2+濃度與概率單位線性回歸散點圖Fig.1 Scatter plot of linear regression between Cu2+ concentration and probability unit at 24 h

圖2 48 h Cu2+濃度對數與概率單位線性回歸散點圖Fig.2 Scatter plot of linear regression between Cu2+ concentration and probability unit at 48 h

圖3 24 h Zn2+濃度與概率單位線性回歸散點圖Fig.3 Scatter plot of linear regression between Zn2+ concentration and probability unit at 24 h

圖4 48 h Zn2+濃度與概率單位線性回歸散點圖Fig.4 Scatter plot of linear regression between Zn2+ concentration and probability unit at 48 h

圖5 24 h Fe3+濃度對數與概率單位線性回歸散點圖Fig.5 Scatter plot of linear regression between Fe3+ concentration and probability unit at 24 h

圖6 48 h Fe3+濃度對數與概率單位線性回歸散點圖Fig.6 Scatter plot of linear regression between Fe3+ concentration and probability unit at 48 h

3 討論

根據水生生物急劇毒性試驗質量控制要求[13,15]，對照組死亡率≤10%；試驗組中有≤37%和≥67%組存在；試驗需設置至少5 個及上的濃度梯度；用相同配制溶液、相同試劑、相同操作方法得到的二次重復試驗結果之比小于2，本實驗設計方案及實驗結果均符合以上要求標準。半致死濃度的計算方法較多，國內普遍采用的方法有3 種[16]：（1）改良寇氏法，限制條件多，要求大致正態(tài)分布，濃度按等比級數設置，各組動物數相等；（2）概率單位法（Bliss法）要求少，適合科研，根據對數（劑量）與經驗概率單位構成的散點繪制一條直線，由該直線可找到對數劑量相當的期望概率單位值。計算作業(yè)概率單位，對期望概率單位值進行校正，用作直線檢驗，如果各點不顯著偏離直線，得到該直線回歸方程，求得半致死濃度值。Bliss 法是目前可靠性、準確性最高的半致死濃度計算方法；（3）線性回歸法（又稱直線內插法），簡單易行，節(jié)省動物，但是求得LC50置信區(qū)間范圍大，不夠精確。本實驗通過概率單位法（Bliss 法）研究3 種重金屬離子對鹵蟲幼體的毒性效應，擬合回歸直線求得半致死濃度與安全濃度值，在數據分析方法上進一步提高實驗結論的準確性與可信度。

3.1 Cu2+對早期鹵蟲幼體的急劇毒性效應

Cu2+是動物生命活動所需的一種微量元素，是多種酶的組成成分和酶活性中心，濃度過高會引起動物中毒。水中銅離子累積來自銅及其化合物排入[17]。水產養(yǎng)殖上Cu2+可用于防治原生動物引起的魚病，控制有害藻生長。陳婕等[18]研究Cu2+對鹵蟲I期無節(jié)幼體的毒性，得到Cu2+24 h 半致死濃度為66.87 mg/L；宮春光等[8]用線性回歸法研究重金屬Hg2+、Cu2+、Cd2+對渤海灣鹵蟲無節(jié)幼體的急性毒性，發(fā)現Cu2+24 h、48 h 半致死質量濃度為197.17 mg/L、7.50 mg/L，安全濃度為0.08 mg/L；張永剛等[19]利用寇氏法計算Cu2+、Mn2+、Zn2+3 種重金屬離子對鹵蟲的半致死濃度與安全濃度，得到48 h Cu2+半致死濃度為4 mg/L，安全濃度為0.4 mg/L。張青田等[20]通過死亡率－濃度對數線性回歸法研究五種重金屬離子對俄羅斯鹵蟲的聯(lián)合毒性，建立鹵蟲死亡率-Cu2+等聯(lián)合毒性的回歸方程。李娜等[21]采用連續(xù)充氣和動態(tài)活水法研究渤海主要重金屬污染物對鹵蟲無節(jié)幼體的毒性，利用最小二乘法建立重金屬濃度（常用對數）與死亡率的概率單位之間的回歸方程，求得48 h Cu2+半致死濃度為4.06 mg/L，安全濃度為0.4 mg/L。本研究通過概率單位法得到Cu2+對鹵蟲幼體的24 h、48 h 半致死質量濃度為89.875 mg/L、27.726 mg/L，安全濃度為0.792 mg/L，與以上多位學者結果有所差異，與陳婕等[18]、張永剛等[19]、李娜等[21]結果相近，高于宮春光[8]等研究結果。引起實驗結果差異的原因有多方面，如統(tǒng)計分析方法差異，不同統(tǒng)計分析方法會引起結果差異，尤其在安全濃度的計算上；鹵蟲的品種，蟲卵產地差異。周銀環(huán)等[22]認為，不同產地鹵蟲遺傳差異對重金屬耐受性不同；鹵蟲的孵化條件，如充氣、光照、鹽度、pH等差異、實驗鹵蟲活動狀態(tài)，有無挑選活力較好的鹵蟲等；鹵蟲的生長階段。已有研究[18,19]表明，不同生長階段鹵蟲對重金屬離子耐受性有明顯差異。但是，本文認為，鹵蟲品種及鹵蟲孵化、毒性實驗的環(huán)境因子包括水化學成分差異是引起結論差異的主要原因。由此可以推測，同一品種鹵蟲卵在不同地理條件或水化學條件下的半致濃度與安全濃度會有差異；不同品種鹵蟲在相同的地理條件或水化學條件下的半致死濃度與安全濃度也不同，相關學者研究結果可作參考。以上研究結果可為廣東南方沿海的鹵蟲養(yǎng)殖及海洋水質評價提供參考數據。

3.2 Zn2+對早期鹵蟲幼體的急劇毒性效應

Zn2+是水生動物所必需的一種微量元素，是很多金屬酶的重要組成部分，并可作為一種輔酶參與動物新陳代謝，但是，高濃度的Zn2+會在動物組織細胞中蓄積，抑制多種重要酶的活性導致中毒死亡[23,24]。朱麗巖等[25]研究表明，海洋生物對Zn2+富集能力很強，海水中Zn2+過高會對生物產生毒害。關于Zn2+對鹵蟲的毒性效應研究不多。許永香等[26]研究了鎘、鋅離子對兩種水生物的聯(lián)合毒性，得到Zn2+對中期鹵蟲的24 h 半致死濃度為85.3 mg/L。張永剛等[19]利用寇氏法計算Zn2+的48 h 半致死濃度為115.95 mg/L，安全濃度為11.6 mg/L，毒性大小順序為Cu2+＞Zn2+。修瑞琴等[27]研究得到Zn2+的24 h、48 h 半致死濃度為164.3mg/L、19.1 mg/L；24 h、48 h Cu2+半致死濃度為4.7 mg/L、1.36 mg/L，離子毒性大小順序為Cu2+＞Zn2+。以上Zn2+研究結果與本實驗結果有所差異。本實驗得到Zn2+對鹵蟲幼體的24 h、48 h 半致死質量濃度為283.445 mg/L、92.268 mg/L，安全濃度2.933 mg/L，低于張永剛等[19]的安全濃度，高于許永香等[26]、修瑞琴等[27]結果，推測主要原因來自鹵蟲產地、水化學成分以及統(tǒng)計分析方法等；而對于離子毒性順序（Cu2+＞Zn2+）的結論，本研究結果與以上研究結果一致。因此在海水養(yǎng)殖業(yè)中應當及時檢測和控制海水中Cu2+、Zn2+的含量。

3.3 Fe3+對早期鹵蟲幼體的急劇毒性效應

Fe3+是水生動物所必需的一種微量礦物元素，是細胞色素氧化酶、過氧化物酶等多種代謝相關酶的關鍵部分；Fe3+參與血紅蛋白與肌紅蛋白的組成，運載體內氧和二氧化碳，構成動物生理防御機能。但水中Fe3+含量過高會引起水生動物中毒甚至死亡。Fe3+對早期鹵蟲幼體的急劇毒性研究尚未見報道。Lavens 等[28]研究表明，低溶解氧與鐵鹽能夠引起鹵蟲體內血紅蛋白含量的升高，提高鹵蟲產生休眠卵的比例。Versichele 等[29]指出：鐵鹽可誘導鹵蟲產卵，濃度高時誘導的時間縮短，卵蟲比也高。柳光宇等[30]研究Fe3+對鹵蟲生存與繁殖的影響，發(fā)現Fe3+對鹵蟲的生殖比、平均生殖量和生殖次數影響不顯著，但對二次產卵率影響顯著，討論中指出高濃度的Fe3+對鹵蟲有毒害作用，45 mg/L 的Fe3+實驗組鹵蟲的存活率明顯減少。陳立婧等[31]通過設置0 mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L 的5 個鐵鹽濃度研究鐵鹽對鹵蟲存活率的影響，結果表明不同濃度間鹵蟲存活率無顯著差異。本研究得到Fe3+對鹵蟲幼體的24 h、48 h 半致死質量濃度為81.452 mg/L、77.567 mg/L，安全濃度為21.103 mg/L。從本研究結果中可推斷，柳光宇等[30]認為Fe3+濃度45 mg/L時鹵蟲的存活率明顯減少，高于本研究的安全濃度21.103 mg/L，存活率會明顯減少。陳立婧等[31]表明，5 種濃度鐵鹽的鹵蟲存活率無顯著差異，其設置最高濃度為20 mg/L，低于本研究的安全濃度，因此不會對鹵蟲的存活率產生影響。SPSS 配對樣本T 檢驗表明：鹵蟲24 h、48 h 死亡數量差異不顯著，說明Fe3+對鹵蟲的毒性效應時間短，死亡時間集中在前24 h，而Cu2+和Zn2+對鹵蟲的24 h、48 h 平均死亡數量達到顯著或極顯著程度，推測這種現象與不同重金屬離子對鹵蟲的毒性機制或鹵蟲對不同重金屬離子的耐受性等密切相關，該機制有待于進一步深入研究。