鞠娜，張文風(fēng)，翁麗麗

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130117）

玉液湯出自張錫純的《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，由生黃芪15g、葛根4.5 g、生山藥30g、知母18 g、五味子9g、生雞內(nèi)金3.5 g和天花粉9 g組成，為治療氣陰兩虛消渴的名方。張錫純[1]提出消渴多由元?dú)獠簧拢J(rèn)為中焦氣化失司，氣不生津及大氣下陷均能導(dǎo)致消渴的發(fā)生，故創(chuàng)玉液湯以補(bǔ)氣升舉、生津止渴、滋陰潤(rùn)燥。張文風(fēng)[2]臨床治療消渴應(yīng)用玉液湯及玉液湯化裁，收效甚佳；玉液湯加減方臨床效果明顯，能有效改善氣陰兩虛型消渴病患者的臨床癥狀以及血糖指標(biāo)，對(duì)患者預(yù)后具有重要作用；玉液湯加減能夠提高Ⅱ型糖尿病患者胰島B細(xì)胞功能[3]；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)玉液湯能有效降低糖尿病大鼠的血糖、血脂和糖化血紅蛋白等指標(biāo)的水平[4]。為使玉液湯能夠標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，更廣泛地應(yīng)用于臨床，故對(duì)玉液湯水煎提取工藝進(jìn)行考察，篩選最佳提取工藝[5-10]。

1 儀器與設(shè)備

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司e2695型，配置Empower工作站）、光電二極管陣列檢測(cè)器PDA（美國(guó)Waters公司2998型）、減壓干燥箱（上海越眾儀器設(shè)備有限公司）、HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋、AUW120D分析天平（島津制造所）、FA1004B電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）、FST-Ⅲ-20S普力菲爾超純水機(jī)（上海富詩特儀器設(shè)備有限公司）、SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）。

1.2 材料與試劑

中藥材生黃芪、葛根、知母、五味子、生雞內(nèi)金、生山藥和天花粉均采購(gòu)于安徽道源堂中藥飲片有限公司；葛根素對(duì)照品（規(guī)格20 mg，批號(hào)S02M9B54875，純度98 %，上海源葉生物科技有限公司）；甲醇等分析試劑均為分析純；水為屈臣氏水。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將影響玉液湯提取效果的主要因素加水量設(shè)為A（8倍量、10倍量和12倍量），煎煮次數(shù)設(shè)為B（1次、2次和3次），煎煮時(shí)間設(shè)為C（60 min、90 min和120 min），采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選玉液湯的最佳提取工藝。在平行操作條件下，每次實(shí)驗(yàn)均按處方量稱取生黃芪、葛根、知母、五味子、生雞內(nèi)金、生山藥和天花粉等藥材，按單因素實(shí)驗(yàn)所篩選出的最佳浸泡時(shí)間、吸水量，加水浸泡，并按下列因素水平進(jìn)行水煎煮提取，收集提取液，濾過，合并濾液濃縮至稠膏，減壓干燥得干膏粉。因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 玉液湯提取工藝因素水平表Table 1 Factors and levels in Yuye Decoction extraction process

2.2 葛根素含量測(cè)定[11，12]

2.2.1 色譜條件色譜柱為Agilent TC-C18（250 mm 4.6 mm，5m）；流動(dòng)相為甲醇-水（25：75）；檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取葛根素對(duì)照品適量，以30%乙醇為溶劑，制備成20g/mL的葛根素溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備取干膏粉（過4號(hào)篩）0.3 g，置具塞錐形瓶中，精密加入30%乙醇50 mL，稱定重量，加熱回流15 min，于室溫下放冷，再稱定重量，用30%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備取不加葛根飲片制得的干膏粉0.3 g，并按2.2.3項(xiàng)下的制備方法制備，即得。

將對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，分別按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1、圖2和圖3。

圖1對(duì)照品溶液HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of reference solution

圖2供試品溶液HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of test solution

圖3陰性樣品溶液HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of negative sample solution

2.2.5 方法學(xué)考察

2.2.5.1 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn) 精密吸取葛根素對(duì)照品溶液1份，分別以2L、4L、6L、8L、10L、12L、16L和20L的進(jìn)樣量按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定并記錄峰面積。以進(jìn)樣量X（g）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=6546387.92x 17633.38，R為0.9999，結(jié)果表明，葛根素在0.04～0.4g范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.2.5.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一因素水平條件下制備得干膏粉，平行制備6份供試品溶液，精密吸取10L，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果得玉液湯干膏粉中葛根素平均含量為0.44%，RSD為1.94%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.5.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密量取已知含量樣品干膏粉0.15 g，共6份，分別精密加入0.011 4 mg/mL的葛根素對(duì)照品溶液50 mL，稱定重量，加熱回流15 min，于室溫下放冷，再稱定重量，補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，再按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 葛根素得加樣回收率Table 2 Sample recovery rate of puerarin （n=6）

2.3 數(shù)據(jù)分析及結(jié)果驗(yàn)證

2.3.1 數(shù)據(jù)分析

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析見表4。以干膏得率和葛根素轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分，由表3和表4可知，3個(gè)因素的影響大小依次為B＞A＞C，A2＞A3＞A1，B3＞B2＞B1，C3＞C2＞C1，其中因素B對(duì)提取工藝影響的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本著節(jié)約能源、綠色生產(chǎn)的原則，綜合分析3個(gè)因素對(duì)玉液湯干膏得率和葛根素轉(zhuǎn)移率的影響，最佳提取工藝為A2B3C2，即加水量為10倍量，提取次數(shù)為3次，提取時(shí)間為每次90 min。

表3 玉液湯正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental results of Yuye Decoction

表4 玉液湯提取工藝方差分析Table 4 Analysis of variance of Yuyetang extraction process

2.3.2 工藝驗(yàn)證

為了驗(yàn)證所選條件的合理性與正確性，按照優(yōu)選出的最佳提取工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果得葛根素平均轉(zhuǎn)移率為60.04%，平均干膏得率為18.93%，說明此提取工藝合理、可靠且穩(wěn)定，驗(yàn)證結(jié)果見表5。

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果Table 5 Verification test results

3 討論

玉液湯出自經(jīng)典書籍，臨床應(yīng)用及實(shí)驗(yàn)研究均顯示其治療消渴安全有效。該方以黃芪與葛根為主藥，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究以葛根素、黃芪甲苷或黃芪多糖為主，無論在復(fù)方配伍中還是單味藥的現(xiàn)代藥理研究中，黃芪甲苷與葛根素都是公認(rèn)的降糖指標(biāo)成分[13-15]。本實(shí)驗(yàn)以葛根素為指標(biāo)考察玉液湯提取工藝。葛根具有生津止渴的功效，《神農(nóng)本草經(jīng)》載葛根“主消渴”，目前臨床多以葛根為主配伍益氣養(yǎng)陰清熱之品治療消渴[16]。藥理學(xué)研究表明，葛根能通過改善胰島素抵抗、保護(hù)胰島B細(xì)胞和促進(jìn)糖代謝等多種途徑治療糖尿病[17]；葛根素能夠明顯降低Ⅱ型糖尿病大鼠的體重、血脂和血糖水平[18]。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪、葛根混煎時(shí)，黃芪比重大，葛根素的溶出率較高，而葛根比重大，葛根素的溶出率無顯著變化甚至變小[19]；黃芪、葛根配伍時(shí)，黃芪可有效提高葛根素在大鼠體內(nèi)的生物利用度[20]，表明配伍黃芪可以增強(qiáng)葛根的效用以及葛根素的溶出度，盡可能溶解和浸出有效成分，是在提取工藝層面上確保中藥湯劑療效高低的重要因素，故以葛根素含量為提取工藝的考察指標(biāo)，更能說明玉液湯有效成分提取得完全與否。

遵循古意，本實(shí)驗(yàn)以水為提取溶劑，采用煎煮法進(jìn)行提取。影響提取工藝的因素共有3個(gè)，分別為加水倍數(shù)、煎煮次數(shù)與煎煮時(shí)間，且因素間有交互作用，實(shí)驗(yàn)工作量大，實(shí)施困難，故選擇高效、經(jīng)濟(jì)的L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，加2倍水浸泡90 min可使藥材充分浸泡達(dá)到吸水飽和。在實(shí)驗(yàn)過程中，以葛根素為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)干燥溫度對(duì)葛根素?fù)p失影響較大，當(dāng)溫度高于70℃時(shí)，葛根素?fù)p失率較大，且溫度越高損失率越大；但溫度低于65℃時(shí)，干燥十分困難，故本試驗(yàn)選擇65～70℃進(jìn)行減壓干燥。減壓干燥具有溫度低、速度快、減少藥物與空氣接觸的時(shí)間及降低藥物污染率等一系列優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)考察了不同提取方式、不同提取時(shí)間以及不同提取溶劑等對(duì)葛根素含量的影響，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇30%乙醇作為提取溶劑，加熱回流15 min制備供試品溶液。

綜合考察因素和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以葛根素為考察指標(biāo)的玉液湯最佳工藝體系是加10倍量水，煎煮3次，每次90 min，且此提取工藝經(jīng)驗(yàn)證合理可行。經(jīng)該工藝提取得到的葛根素轉(zhuǎn)移率為60.04%，干膏得率為18.93%，說明此提取工藝合理、可靠且穩(wěn)定，從葛根素轉(zhuǎn)移率角度驗(yàn)證了該提取工藝使玉液湯得以發(fā)揮最大的臨床療效。經(jīng)優(yōu)選出的最佳提取工藝為玉液湯的劑型研究奠定基礎(chǔ)，可為其工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。