何曦萌 徐黎青 朱春霖 潘小紅 何 梅 吳麗輝 孫軍剛

1 成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川省成都市 610000； 2 四川省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院

高尿酸血癥(Hyperuricemia,HUA)是嘌呤代謝異常引起的代謝性疾病。多項(xiàng)研究表明，高尿酸血癥不僅是痛風(fēng)的重要生化基礎(chǔ)，也與肥胖[1]、糖代謝異常[2-3]、高血壓[4]和慢性腎臟病[5]關(guān)系密切。合適的動(dòng)物模型是進(jìn)一步探究其發(fā)病機(jī)制與藥物研發(fā)的基礎(chǔ)，但目前高尿酸血癥模型造模方法眾多、劑量各異，對(duì)實(shí)際造模操作有一定影響。文獻(xiàn)調(diào)研表明，高尿酸血癥小鼠模型多采用腹腔注射氧嗪酸鉀[6-10]的給藥方式構(gòu)建，但注射造模存在首過(guò)效應(yīng)，血清尿酸水平升高持久性較差，且長(zhǎng)期腹腔注射很容易造成腹腔積水、腹膜硬化等不良反應(yīng)，不適于慢性高尿酸血癥模型的建立，同時(shí)因氧嗪酸鉀不溶于水，造模時(shí)常用羧甲基纖維素鈉水溶液配置成混懸劑，一般認(rèn)為混懸劑不適合注射給藥。而灌胃法相對(duì)刺激輕微，可以避免這些弊端，常用于制作長(zhǎng)期模型。因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)合嚙齒類(lèi)動(dòng)物存在尿酸酶代謝系統(tǒng)的特點(diǎn)，采用灌胃的給藥方式，給予雄性KM小鼠不同劑量的次黃嘌呤(Hypoxanthine,HX)與氧嗪酸鉀(Potassium Oxoxazine,PO)，通過(guò)小鼠造模前后空腹體重變化及血清尿酸(Serum uric acid，SUA)評(píng)價(jià)構(gòu)建動(dòng)物模型的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： SPF級(jí)KM雄性小鼠50只，1月齡，體重25～30g，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院動(dòng)物中心提供[SCXK (川) 2018-19]，飼養(yǎng)在四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK (川)2018-100]。動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)以12h晝夜循環(huán)照明，溫度維持在(22±2)℃，濕度(50±10)%，自由飲水和采食。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的各種處置均符合中華人民共和國(guó)科技部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》。

1.1.2 試劑與儀器： 氧嗪酸鉀(Potassium Oxonate，PO，美國(guó)Sigma公司,批號(hào)SLBT3093)；次黃嘌呤(Hypoxanthine，HX，美國(guó)Sigma公司,批號(hào)SLBZ9513)；羧甲基纖維素鈉(Sodium carboxymethyl cellulose,成都市科龍化工試劑廠(chǎng)，批號(hào)030612)；尿酸由四川省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行檢測(cè)(全自動(dòng)生化分析儀，西門(mén)子ADVIA2400;INS:羅氏電發(fā)光分析儀，COBAS602)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與造模： 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，小鼠禁食12～14h，飲水自由，次日測(cè)量空腹體重，乙醚麻醉后內(nèi)眥采血，檢測(cè)SUA基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。按空腹體質(zhì)量將小鼠隨機(jī)分為空白組和4個(gè)模型組(A、B、C、D)，每組10只。次黃嘌呤與氧嗪酸鉀用0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液配制成混懸液，每組予不同劑量灌胃。見(jiàn)表1。模型A、B、C組均先灌胃給予次黃嘌呤，2h后再灌胃給予氧嗪酸鉀，模型D組灌胃給予氧嗪酸鉀，空白組灌胃等體積蒸餾水，持續(xù)7d。造模期間，各組小鼠自由飲水，喂飼相同質(zhì)量的飼料。

表1 各組小鼠灌胃劑量

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)：每天觀(guān)察小鼠的一般情況，對(duì)比造模前后小鼠空腹體重和SUA變化。第6日灌胃后予禁食14h，第7日測(cè)定空腹體重，于末次造模后2h內(nèi)眥取血，室溫靜置1～2h后2 000r/min離心15min，取血清送檢。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況 隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng),模型C組出現(xiàn)體毛干枯無(wú)光澤、精神萎靡、飲食及活動(dòng)減少等，其余組小鼠毛色正常、精神狀態(tài)良好，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程，各組小鼠未出現(xiàn)死亡。

2.2 小鼠空腹體重變化 造模開(kāi)始時(shí)各小組體質(zhì)量均無(wú)顯著差異，實(shí)驗(yàn)期間，各組小鼠體重呈逐漸增長(zhǎng)的趨勢(shì)，造模7d后，模型C組與空白組小鼠比較，其體重增長(zhǎng)緩慢，差異有顯著性(P<0.05)。其余模型組與空白組比較，體重差異無(wú)顯著性，與模型C組比較，體重增長(zhǎng)較快，差異有顯著性(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠體重比較

2.3 小鼠血清尿酸變化 造模前各小組基礎(chǔ)尿酸值均無(wú)顯著差異，造模7d后，只有模型C組與空白組比較SUA水平升高，差異有顯著性(P<0.001)，提示造模成功。模型B、D組造模后SUA升高，但與空白組比較無(wú)顯著性差異。模型A組造模后SUA水平反而降低，與空白組比較差異無(wú)顯著性。模型C組SUA水平均高于其余模型組，差異具有顯著性(P<0.001)。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠血清尿酸比較

3 討論

高尿酸血癥在我國(guó)的發(fā)病率日趨升高，因此建立合適的HUA模型以便開(kāi)展研究成了熱點(diǎn)。嚙齒類(lèi)動(dòng)物是目前構(gòu)建高尿酸血癥采用最廣泛的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，但是其體內(nèi)存在尿酸酶，可將尿酸分解為尿囊素，然后被排出體外，造高尿酸血癥模型困難。劉曉燕等[10]研究表明，選擇高尿酸血癥在體模型時(shí)，昆明種小鼠靈敏度高于ICR小鼠以及近交系的C57BL/6J小鼠。金沈銳等[11]報(bào)道，雌雄小鼠及同性動(dòng)物間SUA值差異較大，雌性小鼠個(gè)體間SUA值波動(dòng)較大，建議選用雄性小鼠。

HUA模型的造模方法多樣，根據(jù)HUA的發(fā)病機(jī)制主要有直接補(bǔ)充尿酸合成前體物質(zhì)(腺嘌呤、次黃嘌呤等)或者外源性尿酸，給予尿酸酶抑制劑(氧嗪酸鉀)或抑制腎臟對(duì)尿酸的排泄(乙胺丁醇)等藥物，以及敲除尿酸酶Uox和轉(zhuǎn)運(yùn)體ABCG2基因[12]。其中采用腺嘌呤造模，小鼠腎功能損害明顯[13-14]，更適用于高尿酸血癥伴腎衰模型的建立。氧嗪酸鉀化學(xué)結(jié)構(gòu)與尿酸的嘌呤環(huán)類(lèi)似，競(jìng)爭(zhēng)性地與尿酸酶結(jié)合，可用于復(fù)制較穩(wěn)定的高尿酸血癥，短時(shí)間內(nèi)尿酸升高，且對(duì)腎臟損害不明顯[15-16]。在國(guó)際上，以氧嗪酸鉀為誘導(dǎo)劑建立高尿酸血癥的方法得以廣泛使用。

基于文獻(xiàn)研究，本實(shí)驗(yàn)選擇雄性KM小鼠，采取灌胃次黃嘌呤和氧嗪酸鉀的方式構(gòu)建高尿酸血癥模型，在四個(gè)模型組中，只有模型C組造模7d后，血清尿酸水平明顯升高，且與空白組和其余模型組之間存在顯著差異(P<0.05)，提示高尿酸血癥模型制備成功，但是小鼠出現(xiàn)體重增長(zhǎng)緩慢、精神萎靡、飲食減少，考慮是小鼠體內(nèi)尿酸水平增加過(guò)快造成了一定程度的腎臟損傷。需要說(shuō)明的是，在實(shí)踐中若要將模型動(dòng)物的血尿酸升高到臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)(420μmol/L)以上，往往會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物死亡，這也說(shuō)明藥物性“高尿酸血癥”動(dòng)物模型與臨床有較大差異。模型A組SUA均值下降，根據(jù)甘志勇等[17]研究報(bào)道尿酸濃度升高時(shí)，可能反饋性促進(jìn)尿酸酶的表達(dá)或者活性增加。說(shuō)明低劑量氧嗪酸鉀不足以抑制代償性增多的尿酸酶，因而出現(xiàn)后續(xù)的血尿酸降低。陳露瀅等[18]對(duì)SD大鼠每日以氧嗪酸鉀1.5g/kg灌胃15d造成SUA水平升高。本研究中模型D組使用相同劑量的氧嗪酸鉀灌胃造模，SUA有升高趨勢(shì)，但差異不顯著，可能與實(shí)驗(yàn)周期略短相關(guān)。同時(shí)通過(guò)比較模型C組與模型D組KM小鼠造模后SUA水平，發(fā)現(xiàn)在灌胃造模的條件下，次黃嘌呤和氧嗪酸鉀聯(lián)用造模效果更好，說(shuō)明了藥物聯(lián)用具有造模優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用灌胃給藥的方式作用于KM雄性小鼠，500mg/kg次黃嘌呤聯(lián)合1 000mg/kg氧嗪酸鉀可用于制備高尿酸血癥小鼠模型，但對(duì)小鼠體質(zhì)量有一定影響，同時(shí)也進(jìn)一步驗(yàn)證了藥物聯(lián)用具有造模優(yōu)勢(shì)，為制備HUA小鼠模型提供了參考依據(jù)。但仍有很多亟待解決的問(wèn)題，如小鼠與人體尿酸代謝機(jī)制存在差異，造模所致的腎損傷尚無(wú)定論等，需要后期進(jìn)一步的優(yōu)化與探討。