宋禎彥，何攀，李富周，賀春香，余婧萍，成紹武

1.中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實驗室，湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.中南糧油食品科學(xué)研究院有限公司，湖南糧食集團(tuán)有限責(zé)任公司，湖南 長沙 410005

當(dāng)歸芍藥散出自《金匱要略》，全方由當(dāng)歸、芍藥、川芎、茯苓、白術(shù)和澤瀉6 味藥組成，具有滋補(bǔ)肝腎、活血化瘀、化痰通絡(luò)功效。目前已對當(dāng)歸芍藥散進(jìn)行了大量臨床和實驗研究[1-2]，該方可用于治療痛經(jīng)與慢性盆腔炎[3-4]、慢性腎小球腎炎[5]、黃褐斑[6]等。此外，近年研究表明，當(dāng)歸芍藥散可以改善認(rèn)知功能障礙和記憶損傷[7-8]，是治療神經(jīng)退行性疾病的潛在方劑，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

當(dāng)歸芍藥散重用芍藥補(bǔ)養(yǎng)肝血為君藥，配以當(dāng)歸養(yǎng)血柔肝，川芎辛竄舒達(dá)、活血通絡(luò)，三藥共以疏理肝脾，是方中主藥；茯苓、白術(shù)燥濕健脾除水氣，澤瀉利水除濕，助脾運(yùn)化，起輔助作用[9]。其中，芍藥的主要藥效成分是以芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷為代表的單萜苷類成分，具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫作用[10-11]；當(dāng)歸和川芎的主要有機(jī)酸類成分均為阿魏酸，具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)代謝、改善認(rèn)知等作用[12-14]；茯苓的代表性成分為茯苓酸，具有抗氧化、抗凋亡和抗腦缺血等作用[15-16]；澤瀉的代表性三萜類成分為24-乙酰澤瀉醇A 和24-乙酰澤瀉醇B，白術(shù)的代表性成分為白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，均具有降脂、抗炎和抗凋亡等作用[17-19]。已有研究采用HPLC 測定當(dāng)歸芍藥散的活性成分[20-21]，但存在精度差、分析時間長、樣品處理復(fù)雜等缺點(diǎn)，尤其對藥物成分含量較低的含藥血清極難檢測。高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）技術(shù)由于前處理方法相對簡單，基質(zhì)干擾小，方法靈敏度高，且兼分離、定量和定性（分子結(jié)構(gòu)信息）于一體，因而特別適用于藥物定量和確證分析，可用于中藥復(fù)方質(zhì)量控制及中藥藥理研究中含藥血清的質(zhì)量控制[22-23]。本研究建立測定當(dāng)歸芍藥散提取物和含藥血清中阿魏酸、芍藥苷和茯苓酸含量的HPLC-MS/MS 檢測方法，用于該方提取物及含藥血清的質(zhì)量控制。

1 儀器、試藥與動物

Agilent 1290-6460 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，電噴霧離子源（ESI），Agilent Poroshell 120 EC-C18 色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm），畢克氮?dú)獍l(fā)生器。N-1100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYELA 東京理化器械株式會社），LGJ-10 普通型真空冷凍干燥機(jī)（北京松源華興科技發(fā)展有限公司），MixOne 渦旋儀（合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司）。

當(dāng)歸、白芍、茯苓、白術(shù)、澤瀉、川芎飲片購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科。甲醇和乙腈均為色譜純（貨號分別為67-56-1、75-05-8，德國默克集團(tuán)），超純水（電阻率18.25 Ω·cm，Milli-Q，德國默克密理博），乙酸銨為優(yōu)級純（貨號631-61-8，國藥集團(tuán)），對照品阿魏酸、芍藥苷、茯苓酸（貨號分別為SF8030、SP8030、SP8010，HPLC 純度≥98%，北京索萊寶科技有限公司），0.25 μm 有機(jī)相濾膜（天津博納艾杰爾科技有限公司）。

雄性SD 大鼠10 只，SPF 級，體質(zhì)量200～250 g，購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2013-0004，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物中心。動物實驗方案通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（ZYFY20190905）。

2 方法與結(jié)果

2.1 當(dāng)歸芍藥散提取和凍干粉制備

根據(jù)課題組前期研究，采用水提法提取當(dāng)歸芍藥散藥液并制備凍干粉[7]。按《金匱要略》當(dāng)歸芍藥散組方比例（當(dāng)歸14 g，白芍74.4 g，茯苓18.6 g，白術(shù)18.6 g，澤瀉37.2 g，川芎37.2 g）稱取飲片200 g，加5 倍量蒸餾水浸泡2 h，武火煮沸0.5 h，文火煮1 h，收集濾液，按上述步驟再次提取，合并2 次提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成浸膏，再用凍干機(jī)真空冷凍干燥2～3 d，得到凍干粉。200 g 飲片共收集凍干粉25.2 g。

2.2 當(dāng)歸芍藥散濃縮液和含藥血清制備

稱取凍干粉20 g 溶于40 mL 超純水，渦旋混勻，定性濾紙過濾，制備0.5 g/mL 濃縮液。分別于每日8:00、20:00 予大鼠濃縮液6.05 mL/（kg·d）灌胃，相當(dāng)于24 g 原藥材/（kg·d），連續(xù)7 d。末次灌胃后2 h，3%水合氯醛10 mL/kg 麻醉，用負(fù)壓采血管經(jīng)腹主動脈采集全血5 mL，靜置過夜，3000 r/min 離心10 min，收集上清液，0.22 μm 濾膜過濾，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 溶液制備

2.3.1 對照品溶液

準(zhǔn)確稱取阿魏酸、芍藥苷和茯苓酸對照品1 mg，用甲醇溶解并定容至1.00 mL，制成1000 μg/mL 的對照品貯備液。茯苓酸貯備液用90%甲醇水溶液稀釋為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg/mL 系列對照品溶液，阿魏酸、芍藥苷貯備液用10%乙腈稀釋為50、500 μg/mL混合對照品溶液，再用10%乙腈稀釋成阿魏酸和芍藥苷濃度分別為0.1、1.0、2.0、5.0、10 μg/mL 和1、10、20、50、100 μg/mL 的系列混合對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液

準(zhǔn)確稱取0.5 g（精確至0.000 1）當(dāng)歸芍藥散凍干粉于10 mL 離心管，準(zhǔn)確加50%甲醇水溶液5.0 mL，渦旋溶解3 min 后10 000 r/min 離心5 min，取上清液，過0.25 μm有機(jī)濾膜，待測。血清樣品用乙腈-0.5 mmol/L乙酸銨水溶液適當(dāng)稀釋后過0.25 μm 有機(jī)濾膜，用于茯苓酸測定。

準(zhǔn)確稱取0.5 g（精確至0.000 1）當(dāng)歸芍藥散凍干粉于10 mL 離心管中，準(zhǔn)確加50%甲醇水溶液5.0 mL，渦旋溶解3 min 后10 000 r/min 離心5 min，取上清液0.10 mL，用10%乙腈水溶液定容至1.0 mL，過0.25 μm濾膜，再取該樣品溶液0.10 mL，用10%乙腈水溶液定容至1.0 mL，過0.25 μm 濾膜，待測。血清樣品用乙腈-5 mmol/L 乙酸銨水溶液適當(dāng)稀釋后過0.25 μm有機(jī)濾膜，用于阿魏酸和芍藥苷測定。

2.4 儀器條件

色譜柱：Poroshell 120 EC-C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；茯苓酸流動相：乙腈-0.5 mmol/L 乙酸銨水溶液（1∶1，V/V），等度洗脫；阿魏酸和芍藥苷流動相：乙腈（B）-5 mmol/L 乙酸銨水溶液（A），梯度洗脫（0～7 min，10%B；7.01～10 min，60%B；10.01～15 min，10%B）；流速：0.4 mL/min；柱溫：35 ℃，進(jìn)樣量：5 μL；離子源：電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子模式；干燥氣溫度：350 ℃，干燥氣流速：12 L/min；干燥氣壓力：35 psi；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。離子源控制條件見表1，定量離子對和定性離子對的相對豐度誤差＜10%。

表1 離子源控制條件

2.5 色譜圖和質(zhì)譜圖

在同一儀器條件下對供試品和對照品分別進(jìn)樣，得到色譜圖（見圖1～圖5）。3 種化合物在供試品和對照品中的定量離子對都僅有一個峰，表明方法特異性強(qiáng)，樣品中雜質(zhì)均不產(chǎn)生干擾信號且峰形對稱性好。阿魏酸對照品定性離子對（193.0→133.8）與定量離子對（193.0→177.8）的相對豐度為41.3%，在當(dāng)歸芍藥散提取液中的相對豐度為41.5%（誤差為0.2%），在當(dāng)歸芍藥散含藥血清中的相對豐度為40.2%（誤差為1.1%），誤差均小于10%（見圖1B、C，圖2B、C，圖3B、C）；芍藥苷對照品定性離子對（479.2→120.9）與定量離子對（479.2→449.0）的相對豐度為50.9%，在當(dāng)歸芍藥散提取液中的相對豐度為44.9%（誤差為6.0%），在當(dāng)歸芍藥散含藥血清中的相對豐度為56.0%（誤差為5.1%），誤差均小于10%（見圖1E、F，圖2E、F，圖3E、F）；茯苓酸對照品定性離子對（527.4→59.1）與定量離子對（527.4→465.2）的相對豐度為69.7%，在當(dāng)歸芍藥散提取液中的相對豐度為73.9%（誤差為5.8%），誤差均小于10%（見圖4B、C，圖5B、C）。表明檢測方法能準(zhǔn)確定性當(dāng)歸芍藥散提取液和含藥血清中阿魏酸、芍藥苷和茯苓酸。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察

取阿魏酸、芍藥苷和茯苓酸系列對照品溶液進(jìn)樣測定，以所得峰面積為縱坐標(biāo)，對照品濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。阿魏酸、芍藥苷、茯苓酸分別在0.1～20.0 μg/mL、1～100 μg/mL、0.1～20.0 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性寬度可滿足樣品質(zhì)量控制的需求。

2.6.2 檢出限與定量限

將供試品溶液稀釋至3 倍信噪比為檢出限，10倍信噪比為定量限。阿魏酸、芍藥苷、茯苓酸的檢出限分別為5、50、5 ng/mL，定量限分別為50、200、50 ng/mL，檢出限遠(yuǎn)低于供試品濃度，可滿足對樣品的質(zhì)量控制要求。

圖1 阿魏酸和芍藥苷對照品色譜及質(zhì)譜圖

圖2 當(dāng)歸芍藥散提取液中阿魏酸和芍藥苷色譜及質(zhì)譜圖

圖3 當(dāng)歸芍藥散含藥血清中阿魏酸和芍藥苷色譜及質(zhì)譜圖

圖4 茯苓酸對照品色譜及質(zhì)譜圖

圖5 當(dāng)歸芍藥散提取液中茯苓酸色譜及質(zhì)譜圖

表2 3 種成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.6.3 加樣回收率試驗

稱取同一已知濃度供試品3 份，加入阿魏酸、芍藥苷和茯苓酸對照品溶液，按低、中、高3 個水平添加，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液并測定，加樣回收率試驗結(jié)果見表3。阿魏酸回收率為89.5%～95.7%，RSD＝3.1%；芍藥苷回收率為97.3%～99.7%，RSD＝1.2%；茯苓酸回收率為96.7%～99.8%，RSD＝1.6%。表明3 種化合物回收率好，方法準(zhǔn)確度高。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果

2.6.4 穩(wěn)定性試驗

取新制備的同一份供試品溶液，分別于室溫放置0、2、4、6 h 后進(jìn)樣，記錄色譜圖，測得阿魏酸、芍藥苷和茯苓酸峰面積RSD 分別為4.0%、2.9%和4.3%，結(jié)果表明供試品溶液在6 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 樣品含量測定

取當(dāng)歸芍藥散凍干粉，制備提取物供試品溶液并測定，6 次測定結(jié)果見表4。當(dāng)歸芍藥散提取物中阿魏酸、芍藥苷和茯苓酸含量分別為（127.6±14.9）μg/g、（6081.8±468.0）μg/g 和（14.7±0.75）μg/g。同時隨機(jī)取6 只大鼠的當(dāng)歸芍藥散含藥血清，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液并測定，重復(fù)測定3 次，結(jié)果見表5。大鼠來源的當(dāng)歸芍藥散含藥血清中阿魏酸和芍藥苷含量分別為（0.026±0.004）μg/g 和（0.61±0.07）μg/g，表明當(dāng)歸芍藥散提取液灌胃不同大鼠獲取的含藥血清中阿魏酸和芍藥苷含量比較穩(wěn)定。

表4 當(dāng)歸芍藥散提取液樣品含量測定結(jié)果（μg/g）

表5 當(dāng)歸芍藥散含藥血清樣品含量測定結(jié)果（μg/g，n＝3）

3 討論

質(zhì)量是中藥臨床安全、有效、可控的基礎(chǔ)，也是基礎(chǔ)研究結(jié)果可靠、穩(wěn)定的保證[24]。中藥含藥血清是方劑藥理學(xué)細(xì)胞實驗常用的媒介，但其中有效藥物成分含量較低，一般在ng 級。目前常用HPLC 無法準(zhǔn)確測定中藥含藥血清中有效成分含量，而液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高，可用于快速、準(zhǔn)確地檢測中藥含藥血清中的有效成分。彭國梅等[25]使用UPLC-MS/MS同時測定了葛根芩連湯含藥血清10 個有效成分的含量。閆寒等[26]使用LC-MS/MS 檢測血府逐瘀膠囊大鼠含藥血清中芍藥苷的含量。本研究使用HPLC-MS/MS能夠準(zhǔn)確定量當(dāng)歸芍藥散含藥血清中2個主要活性成分——阿魏酸和芍藥苷的含量，可作為當(dāng)歸芍藥散含藥血清質(zhì)量控制的方法。

阿魏酸、芍藥苷和茯苓酸分別是當(dāng)歸芍藥散中當(dāng)歸、川芎、芍藥和茯苓的主要活性成分，其含量是否穩(wěn)定影響當(dāng)歸芍藥散的藥效。目前，阿魏酸、芍藥苷和茯苓酸測定主要使用液相色譜紫外檢測器法，該方法雜質(zhì)干擾大，要求對樣品進(jìn)行凈化處理。樣品在經(jīng)過醇溶液提取后，需要使用乙酸乙酯、三氯甲烷和乙醚等提取劑凈化萃取[27-30]，以排除復(fù)雜樣品基質(zhì)中強(qiáng)極性物質(zhì)的干擾，若雜質(zhì)去除不凈可能影響定量準(zhǔn)確性。本研究建立的方法樣品處理簡單，用醇溶液提取稀釋后即可直接測定，且質(zhì)譜三重四級桿質(zhì)量篩選器的MRM 特異性強(qiáng)，定性定量的準(zhǔn)確性大大優(yōu)于紫外檢測器。

茯苓酸、阿魏酸和芍藥苷均為酸性化合物，容易失去氫得到負(fù)離子，故選擇ESI 負(fù)離子模式進(jìn)行測定。在負(fù)離子模式下對10.0 μg/mL 對照品溶液進(jìn)行全掃描，茯苓酸、阿魏酸和芍藥苷的最強(qiáng)離子分別為527.4、193.0、525.0（m/z），均為分子脫氫后產(chǎn)生的負(fù)離子，因此選擇其作為母離子進(jìn)行子離子掃描，初步優(yōu)化碎解電壓的同時尋找特征子離子，選擇其中2個信號較強(qiáng)的子離子進(jìn)行MRM 掃描，進(jìn)一優(yōu)化碎解電壓，并得到最佳碰撞能。

本研究供試品溶液制備時，溶劑的選擇分別考察了水及不同濃度的甲醇、乙醇，結(jié)果表明甲醇作為溶劑的檢測效率最高，其中50%甲醇水溶液制備供試品的檢測效率高且雜質(zhì)少。采用甲醇為溶劑時，分別考察了渦旋振蕩法和超聲法溶解當(dāng)歸芍藥散凍干粉，結(jié)果3 種化合物的檢測效率相差不大，渦旋震蕩法檢測含量略高，故選擇渦旋振蕩法。

對流動相的選擇，本研究分析的化合物均為離子型化合物，離子型化合物容易與色譜柱中未封端的硅羥基發(fā)生強(qiáng)相互作用（次級保留）而使色譜峰拖尾。為改善峰形以提高積分準(zhǔn)確度，本研究使用乙酸銨作為改良劑以減少次級保留，但由于氣態(tài)離子的競爭，加入乙酸銨會使被分析物響應(yīng)降低。綜合考慮，茯苓酸采用乙腈-0.5 mmol/L 乙酸銨水溶液為流動相等度洗脫，阿魏酸和芍藥苷采用乙腈-5 mmol/L 乙酸銨水溶液為流動相梯度洗脫，峰形和信號強(qiáng)度最佳。

在本研究中，當(dāng)歸芍藥散含藥血清未檢測出茯苓酸，可能由于提取物中茯苓成分含量低，導(dǎo)致含藥血清中茯苓酸含量低于檢出限。今后將繼續(xù)改進(jìn)方法，提高檢出限。