王清亞，李福生，江曉宇，張麗嬌，張雄杰，王仁波

1.東華理工大學(xué)核技術(shù)應(yīng)用教育部工程研究中心，江西 南昌 330013；2.東華理工大學(xué)核資源與環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330013

白術(shù)為菊科植物白術(shù)Atractulodes macrocephalaKoidz.的干燥根莖，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗等功效[1]。浙江、安徽及江西等地為白術(shù)主產(chǎn)地。現(xiàn)代研究表明，白術(shù)含有多類化學(xué)成分，包括揮發(fā)油、內(nèi)酯、氨基酸等，其中，內(nèi)酯類成分是白術(shù)主要藥效成分，常作為評(píng)價(jià)白術(shù)藥材及飲片質(zhì)量的參考指標(biāo)[2]。目前研究多為測(cè)定白術(shù)中揮發(fā)油類[3]、內(nèi)酯類[4]化合物，如采用HPLC 同時(shí)測(cè)定白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯等多種成分含量[5-7]。該方法雖然測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，但存在前處理耗時(shí)、樣品無(wú)法回收、分析結(jié)果滯后的缺點(diǎn)，導(dǎo)致無(wú)法將其應(yīng)用于飲片現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

外積融合分析是將近紅外（NIR）光譜和X 射線熒光（XRF）光譜進(jìn)行克羅內(nèi)克積（Kronecker product）運(yùn)算，得到高維光譜[8]。與單一光譜相比，數(shù)據(jù)融合后的光譜載有更加豐富的信息，能夠反映不同光譜之間的空間變化，更有利于快速建立定性和定量分析模型[9]，已逐漸廣泛應(yīng)用于化學(xué)計(jì)量學(xué)的多個(gè)領(lǐng)域[10-13]。目前，NIR 光譜和XRF 光譜均已應(yīng)用于中藥飲片的質(zhì)量控制[14-16]，但尚缺乏采用外積融合光譜分析對(duì)中藥飲片的快速評(píng)價(jià)研究。因此，本研究選取白術(shù)中3種內(nèi)酯類成分作為外積融合分析的指標(biāo)，建立白術(shù)多成分定量模型，從整體性和專屬性入手，對(duì)外積融合分析在白術(shù)質(zhì)量評(píng)價(jià)方面的應(yīng)用進(jìn)行初步探究。

1 儀器與試藥

Agilent 1200 高效液相色譜儀（含二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)Agilent 公司），Phenomenex Kinetex@XBC18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），XS-205 型十萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），KQ-500V 數(shù)控超聲波清洗機(jī)（江蘇昆山市超聲儀器有限公司），Milli-QAdevantageA10 自動(dòng)型純水機(jī)（美國(guó)，Merck Millipore 公司），BJ-150 型高速多功能粉碎機(jī)（中國(guó)，拜杰公司），ASD FieldSpec3 光譜儀（美國(guó)ASD 公司），TEC SONDETS-XH4000 型熒光分析儀（配置Ag 靶、SDD 探測(cè)器，浙江泰克松德能源科技有限公司）。

本研究共收集不同產(chǎn)地、不同廠家的123 批白術(shù)飲片樣品，均經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)徐鐵龍副教授鑒定為菊科植物白術(shù)Atractulodes macrocephaKoidz.的干燥根莖加工而成的生品飲片，樣品來(lái)源信息見(jiàn)表1。白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對(duì)照品均為自制，經(jīng)HPLC 檢測(cè)，歸一法計(jì)算，純度均大于99.0%。甲醇、乙腈為色譜純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），液相用水為超純水。

表1 123 批白術(shù)飲片樣品來(lái)源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量測(cè)定

色譜條件：流動(dòng)相為水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～20 min，55%B；20～40 min，55%～80%B），流速1 mL/min，柱溫30 ℃，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅲ檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ檢測(cè)波長(zhǎng)276 nm，進(jìn)樣量10 μL。

分別精密稱取白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對(duì)照品于10 mL容量瓶中，加適量甲醇溶解，定容至10 mL，制成濃度分別為1.724、1.995、2.289 g/L 的單一對(duì)照品貯備液。精密吸取各單一對(duì)照品貯備液2 mL，定容至25 mL，得白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ濃度分別為0.137 9、0.159 6、0.183 1 g/L 的混合對(duì)照品貯備液。

供試品溶液制備參照2015 年版《中華人民共和國(guó)藥典》方法。樣品粉碎后過(guò)篩，取細(xì)粉2 份，各1.0 g，精密稱定，分別置于50 mL 錐形瓶中，精密量取2 份甲醇各50 mL，分別加入錐形瓶中，充分搖勻。一份超聲60 min，另一份水浴回流60 min，冷卻后加甲醇補(bǔ)足溶劑揮發(fā)的量，置于錐形瓶中備用。

HPLC 圖見(jiàn)圖1。3 種白術(shù)內(nèi)酯與對(duì)照品保留時(shí)間一致，各成分均達(dá)到基線分離，具有較好的對(duì)稱性。

圖1 白術(shù)中3 種白術(shù)內(nèi)酯HPLC 圖

2.2 光譜采集

2.2.1 近紅外光譜

將制備好的樣品分別裝入直徑12 cm、深3 cm 盛樣皿中，表面刮平，選擇50 W 鹵素?zé)魹楣庠?，光源距離樣品表面50 cm，天頂角15°，光纖探頭到樣品距離為10 cm，每10 次測(cè)量使用白板標(biāo)定[17]，每個(gè)樣品于8 個(gè)方向采集24 條光譜曲線，取信噪比最佳的10 次算術(shù)平均值作為該樣品的NIR 原始光譜。

2.2.2 X 射線熒光光譜

取研磨后的樣品，裝進(jìn)樣品杯，壓實(shí)，覆蓋麥拉膜。選用中藥模式，測(cè)試時(shí)間為90 s。每測(cè)30 個(gè)樣品進(jìn)行1 次校正。同一樣品測(cè)試3 次，取平均值作為該樣品的XRF 光譜。

2.3 光譜特征分析

將測(cè)試得到的反射光譜轉(zhuǎn)換成信息量更大的吸收光譜，樣品光譜見(jiàn)圖2。123 批樣品的NIR 光譜曲線形態(tài)大致相同，曲線近似平行，可見(jiàn)光波段吸收率小于近紅外波段，差別略小。特征吸收帶集中在短波紅外波段（1000～3000 nm）位置1190、1400、1720、2140、2300、2460 nm。在這個(gè)波段，樣品的吸收主要由-OH、CO-OH、NH4+、Al-OH、Fe-OH、CO32-等分子團(tuán)化學(xué)鍵的伸展、彎曲、變動(dòng)等振動(dòng)引起[18]。3 種白術(shù)內(nèi)酯中均含有C-H 和O-H 基團(tuán)[19-20]，會(huì)在光譜中引起不同的吸收特征。較弱的1190 nm 對(duì)應(yīng)C-H鍵二級(jí)倍頻伸展的吸收，1400 nm 處的吸收來(lái)自水分子和羥基（-OH）二級(jí)倍頻；1720 nm 處的吸收是C-H鍵的二級(jí)倍頻，2140 nm 處為C-H 和C-O 組合吸收峰；2300、2460 nm 附近峰值分別來(lái)自C-H 鍵和O-H 鍵的合頻。從圖2B 可見(jiàn)，各樣品中共有元素種類基本相同，包括鎂（Mg）、磷（P）、硫（S）、鈣（Ca）、鐵（Fe）、鎢（W）、鋅（Zn）、鍶（Sr）等元素。

圖2 白術(shù)樣品光譜圖

2.4 校正集與驗(yàn)證集劃分

選用K-S（Kennard-Stone）算法計(jì)算樣品中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量的歐式距離，設(shè)置95%置信區(qū)間，剔除超出置信區(qū)間的樣本，剩余108 份。選用60%樣品用于建模，40%樣品用于預(yù)測(cè)和驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 白術(shù)內(nèi)酯定量模型中校正集與驗(yàn)證集信息

2.5 光譜預(yù)處理及融合

2.5.1 光譜預(yù)處理方法選擇

將NIR 光譜和XRF 光譜數(shù)據(jù)引入定量分析模型，需采用特定的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)原始光譜進(jìn)行預(yù)處理，可有效降低原始光譜的噪聲、基線漂移和光的散射等[21]。本研究以偏最小二乘法（PLS）結(jié)合決定系數(shù)（R2）、校正均方根誤差（RMSEC）、預(yù)測(cè)均方根誤差（RMSEP）為指標(biāo)，比較不同預(yù)處理方法對(duì)模型的影響，包括標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換（SNV）、多元散射校正（MSC）、Savitzky-Golay 平滑（S-G）、一階導(dǎo)數(shù)法（1stD）、二階導(dǎo)數(shù)法（2ndD）等。R2反映模型建立的穩(wěn)定性，RMSEC和RMSEP用來(lái)驗(yàn)證模型預(yù)報(bào)能力[22]。不同處理方法對(duì)白術(shù)內(nèi)酯定量分析模型的影響見(jiàn)表3、表4。NIR 光譜定量模型普遍比XRF 光譜定量模型預(yù)測(cè)性能好，表明NIR 光譜對(duì)微量有機(jī)物更敏感，適用于有機(jī)物含量的檢測(cè)，與前人研究結(jié)果[23-25]相符。

白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ模型選取MSC＋1stD＋S-G 組合方案，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ模型選取SNV＋1stD＋S-G 組合方案。對(duì)比XRF 光譜不同預(yù)處理方法，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ模型選取MSC＋2ndD＋S-G 組合方案，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ模型選取MSC＋1stD＋S-G 組合方案，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ模型選取SNV＋2ndD＋S-G 組合方案。

表3 NIR 光譜不同預(yù)處理方法對(duì)3 種白術(shù)內(nèi)酯定量模型的影響

表4 XRF 光譜不同預(yù)處理方法對(duì)3 種白術(shù)內(nèi)酯定量模型的影響

在光譜預(yù)處理中，將光譜截取出數(shù)據(jù)較為豐富的一段。NIR 選取450～2450 nm 段（2000 個(gè)通道），轉(zhuǎn)換成吸收光譜。XRF 光譜選取0.405～42.105 keV 段（2000 個(gè)通道），可消除低能射線影響。分別按已選取的組合方案進(jìn)行處理。由于外積融合會(huì)形成大量數(shù)據(jù)，故需要對(duì)預(yù)處理后的光譜進(jìn)行重采樣200 個(gè)通道，分辨率分別為10 nm、0.2 keV。處理后的NIR 光譜數(shù)據(jù)范圍為-0.95～2.36，XRF 光譜數(shù)據(jù)范圍為-1.48～2.82，解決了不同物理量融合時(shí)量綱不一致的問(wèn)題。

2.5.2 外積融合光譜構(gòu)建

外積融合實(shí)質(zhì)上是求取NIR 光譜和XRF 光譜的克羅內(nèi)克積[26]?？肆_內(nèi)克積定義為：設(shè)A＝（aij）m×n，B＝（bij）p×q，則A 與B 的克羅內(nèi)克積A ?B=。具體流程為：先測(cè)試樣品，得到一組具有r個(gè)變量的XRF 光譜和c個(gè)變量的NIR 光譜：；再求取該樣品的XRF 光譜和NIR 光譜的克羅內(nèi)克積：，式中，An即第n個(gè)樣品XRF 光譜和NIR 光譜的外積融合光譜，是一個(gè)200×200 的矩陣。融合過(guò)程見(jiàn)圖3。

2.6 定量分析模型及評(píng)價(jià)

在光譜分析中構(gòu)建多維矩陣通常是將其展開(kāi)成一行，再利用主成分分析或偏最小二乘回歸算法對(duì)光譜進(jìn)行聚類或回歸分析[27]，但會(huì)丟失許多二維矩陣的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)信息。而基于三線分解和經(jīng)典偏最小二乘的三維矩陣校正算法多維偏最小二乘（N-way partial least square，N-PLS）數(shù)學(xué)模型[28]，用于激發(fā)-發(fā)射熒光光譜、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等多維光譜的化學(xué)計(jì)量學(xué)研究效果較好。對(duì)于多維光譜矩陣X（I×J×K）和濃度矩陣Y（I×L），N-PLS 回歸模型可表示為：。式中，T、U表示得分矩陣，W和Q表示載荷矩陣，B為回歸系數(shù)矩陣，EX、EY和EU表示殘差矩陣。白術(shù)內(nèi)酯定量模型中，X 為108 個(gè)樣品的外積融合矩陣X（108×200×200），Y 為白術(shù)內(nèi)酯的含量矩陣Y（108×1）。采用交叉驗(yàn)證均方根誤差（RMSECV）分析N-PLS 模型的最佳主成分?jǐn)?shù)（見(jiàn)圖4），白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的最小RMSECV分別對(duì)應(yīng)主成分5、6、6。

圖3 XRF 光譜與NIR 光譜外積融合過(guò)程

圖4 白術(shù)內(nèi)酯N-PLS 模型主成分?jǐn)?shù)對(duì)RMSECV 的影響

N-PLS 模型對(duì)校正集和預(yù)測(cè)集樣品中白術(shù)內(nèi)酯預(yù)測(cè)含量與檢測(cè)含量的線性擬合見(jiàn)圖5。白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ：校正集中預(yù)測(cè)含量（Cpc）與參考含量（Crc）的線性關(guān)系為Cpc＝1.006 74Crc－0.003 94，R2＝0.946 4，RMSEC＝0.021 8；預(yù)測(cè)集中預(yù)測(cè)含量（Cpp）與實(shí)際含量（Crp）的線性關(guān)系為Cpp＝1.019Crp－0.005，R2＝0.918 0，RMSEP＝0.031 1。白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ：校正集中，Cpc與Crc的線性關(guān)系為Cpc＝0.994Crc，R2＝0.917 2，RMSEC＝0.018 1；預(yù)測(cè)集中，Cpp與Crp的線性關(guān)系為Cpp＝0.993Crp＋0.002，R2＝0.905 1，RMSEP＝0.025 8。白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ：校正集中，Cpc與Crc的線性關(guān)系為Cpc＝1.027Crc－0.013，R2＝0.955 8，RMSEC＝0.040 0；預(yù)測(cè)集中，Cpp與Crp的線性關(guān)系為Cpp＝1.09Crp－0.045，R2＝0.946 5，RMSEP＝0.049 8。

圖5 白術(shù)內(nèi)酯預(yù)測(cè)值與檢測(cè)值的相關(guān)性

2.7 模型驗(yàn)證

對(duì)白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ模型的預(yù)測(cè)值與檢測(cè)值進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，P值分別為0.799 1、0.830 2、0.940 6，表明外積融合光譜的預(yù)測(cè)值與檢測(cè)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），外積融合光譜與HPLC 之間的系統(tǒng)誤差較小。

3 討論

2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》將XRF 光譜和NIR 光譜技術(shù)列為通用檢測(cè)技術(shù)，必將促進(jìn)這2項(xiàng)快速、無(wú)損檢測(cè)技術(shù)的研究，以及中藥品質(zhì)規(guī)范化要求的提高。本研究通過(guò)外積融合光譜的形式，將NIR 光譜和XRF 光譜進(jìn)行融合，采用N-PLS 建立白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的定量模型，得到RMSEC分別為0.021 8、0.018 1、0.040 0，RMSEP分別為0.031 1、0.025 8、0.049 8。與單純使用XRF 光譜和NIR 光譜的模型結(jié)果比較，外積融合光譜定量模型預(yù)測(cè)精度更高（R2分別為0.946 4、0.917 2、0.955 8）。試驗(yàn)結(jié)果表明，外積融合光譜保留了2 種光譜與目標(biāo)成分之間的相關(guān)性，增強(qiáng)了光譜數(shù)據(jù)的線性，與相關(guān)研究結(jié)果[29]相符。同時(shí)，外積融合光譜與HPLC 所建立的模型之間系統(tǒng)誤差較小。此方法集合了XRF 光譜和NIR光譜的優(yōu)點(diǎn)，較HPLC 更加快捷、高效，能夠滿足中藥飲片工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中大規(guī)?；瘜W(xué)信息批量采集需求。