莊金龍 ，陳華，劉莉，郭以河，林惠萍，范偉偉，朱健

1.廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院，福建 漳州 363000；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040

心力衰竭是多種原因?qū)е滦呐K結(jié)構(gòu)和/或功能的異常改變，使心室收縮和/或舒張功能發(fā)生障礙而引起的一組復(fù)雜臨床綜合征[1]。研究表明，心力衰竭發(fā)生發(fā)展的基本機(jī)制是心室重構(gòu)，而心肌纖維化是其重要的病理基礎(chǔ)[2]。心肌間質(zhì)膠原纖維的大量增生及膠原蛋白的過(guò)度沉積是各種心臟病導(dǎo)致晚期心功能衰竭的共同病理改變。參芪利心湯治療心力衰竭臨床療效確切[3-4]，且課題組前期基礎(chǔ)研究表明，其可改善心力衰竭大鼠的心肌結(jié)構(gòu)、降低細(xì)胞炎癥因子，但其干預(yù)心力衰竭的機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用參芪利心湯干預(yù)阿霉素誘導(dǎo)心力衰竭大鼠，觀察模型大鼠心功能、心肌組織形態(tài)、心肌膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）、血漿N 端B 型利鈉肽原（NT-proBNP）和血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）水平、心肌組織Ⅰ型膠原（CollagenⅠ）和Ⅲ型膠原（Collagen Ⅲ）mRNA 及蛋白的表達(dá)，探討其干預(yù)心力衰竭的可能作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性Wistar 大鼠105 只，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（滬）2017-0005。分籠飼養(yǎng)于廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度（22±3）℃，相對(duì)濕度42%～58%，光照12 h 明暗交替，自由攝食飲水。

1.2 藥物

參芪利心湯（黃芪20 g，人參20 g，丹參15 g，桂枝10 g，茯苓20 g，白術(shù)15 g，淫羊藿20 g，仙鶴草30 g，益母草15 g，葶藶子15 g，甘草10 g），飲片購(gòu)自廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院，由門診中藥房制成水煎液，根據(jù)大鼠與人體體表面積比例折算等效劑量，將其分別濃縮成含原藥材0.998、1.995、3.990 g/mL，分裝滅菌，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。馬來(lái)酸依那普利片，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)江蘇制藥股份有限公司，批號(hào)18010301，用滅菌注射用水配成0.21 mg/mL 溶液備用。阿霉素粉針劑，浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)18033311，將10 mg 阿霉素粉針劑溶解于5 mL 滅菌注射用水中，再加入注射用水至12.5 mL，配成濃度為0.8 mg/mL 的溶液，備用。

1.3 主要試劑與儀器

Masson 染色試劑（廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院病理科），NT-proBNP ELISA 試劑盒（武漢菲恩生物科技有限公司，批號(hào)ER0309），AngⅡ ELISA 試劑盒（武漢菲恩生物科技有限公司，批號(hào)ER1637），Trizol 試劑盒（上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號(hào)PR01259），熒光定量PCR 試劑盒（上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號(hào)LK-0103B），裂解液（上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號(hào)PWB-78503），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號(hào)PWB-563），SDS-PAGE（上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號(hào)PWB-020），Super-GL ECL 超敏發(fā)光液（上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號(hào)PWB-03132），PVDF 轉(zhuǎn)移膜（美國(guó)Millipore 公司，批號(hào)IPVH00010），辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔IgG（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)A0208），HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（美國(guó)Jackson 公司，批號(hào)000000148774），重組Anti-CollagenⅠ抗體[EPR22894-89]（英國(guó)Abcam 公司，貨號(hào)ab260043）、Anti-Collagen Ⅲ抗體[FH-7A]（英國(guó)Abcam 公司，貨號(hào)ab6310），重組Anti-β-actin 抗體[EPR16769]（英國(guó)Abcam 公司，貨號(hào)ab179467）。彩色多普勒超聲儀（荷蘭Philips 公司，IE33 型，探頭頻率10 MHz），臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，TDZ4-WS），醫(yī)用超低溫冰箱（日本三洋公司，MDF-U53V），多功能染色封片一體機(jī)（德國(guó)徠卡儀器股份有限公司，ST5020），切片機(jī)（德國(guó)徠卡儀器股份有限公司，RM2245），生物顯微鏡（上海徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司，DW4-B），全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-rad 公司，680 型），實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)Agilent 公司，MX3000P），電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司，PowerPacTMHC），垂直電泳槽（上海天能科技公司，VE-180），Semi-Dry Transfer Cell（美國(guó)Bio-Rad公司，170-3940），脫色搖床（上海青浦滬西儀器，DY-B1），凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司，XR+），Gel-Proanalyzer 分析軟件（美國(guó) Media Cybernetics 公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模及分組

實(shí)驗(yàn)大鼠105 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，采用隨機(jī)數(shù)字表法選取15 只為空白對(duì)照組，其余90 只隨機(jī)分為模型組、依那普利組和參芪利心湯低、中、高劑量組各18 只。除空白對(duì)照組外，余各組大鼠腹腔注射配制的0.8 mg/mL 阿霉素溶液，前3 周3 mg/kg、后3周2 mg/kg，同時(shí)空白對(duì)照組予等量生理鹽水腹腔注射。每周1 次，連續(xù)6 周。

2.2 給藥

參照《人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值表》換算大鼠給藥等效劑量，依那普利組每次灌胃依那普利混懸液1.05 mg/kg，參芪利心湯高劑量組每次灌胃參芪利心湯水煎液19.95 g/kg，參芪利心湯中劑量組每次灌胃參芪利心湯水煎液9.975 g/kg，參芪利心湯低劑量組每次灌胃參芪利心湯水煎液4.988 g/kg，分別相當(dāng)于臨床成人1 日用量折算大鼠等效劑量2、1、0.5 倍，空白對(duì)照組及模型組灌胃等體積蒸餾水，均每日2 次，連續(xù)4 周。

2.3 標(biāo)本采集

藥物干預(yù)4 周，禁食、不禁水12 h，脫毛、稱重，20%烏拉坦（1.5 mg/g）腹腔注射麻醉，超聲心動(dòng)圖儀檢測(cè)心功能指標(biāo)，腹主動(dòng)脈采血5 mL，注入EDTA抗凝管，靜置1 h，3000 r/min 離心10 min，留取血漿，置于-20 ℃冰箱保存待測(cè)。采血后處死大鼠，立即剪開胸腔，快速準(zhǔn)確取出心臟，用冰鹽水充分洗滌血污，冰塊上剪除包膜、血管及心房組織，留取左室心肌組織，濾紙拭干并迅速剪取左室心尖部心肌組織約1 mm3，4%多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，用于Masson 染色，剩余左室心肌組織快速置于液氮中固定10 min，取出并用干冰包裹轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存待用。

2.4 指標(biāo)觀察及檢測(cè)

2.4.1 心功能指標(biāo)檢測(cè)

大鼠麻醉后，仰臥固定，用超聲心動(dòng)圖儀10 MHz高頻探頭置于左胸骨旁，顯示左室長(zhǎng)軸切面，獲得M型超聲心動(dòng)圖，測(cè)定左室收縮末期內(nèi)徑（LVESd），左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd），用Teichholtz 公式計(jì)算射血分?jǐn)?shù)（EF）、短軸縮短率（FS）和心輸出量（CO）。連續(xù)記錄3 個(gè)心動(dòng)周期數(shù)據(jù)，取平均值。

2.4.2 血漿N 端B型利鈉肽原和血管緊張素Ⅱ檢測(cè)

ELISA 檢測(cè)大鼠血漿NT-proBNP 和AngⅡ水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

2.4.3 Masson 染色

取石蠟包埋的大鼠左室心尖部心肌組，切片，常規(guī)Masson 染色，鏡下觀察大鼠心肌組織形態(tài)和纖維化程度。每組取6 張切片，每張切片隨機(jī)選取4 個(gè)不含血管視野，通過(guò)Image J 6.0 圖像分析系統(tǒng)測(cè)量各區(qū)域CVF，取其平均值。CVF（%）＝膠原纖維面積÷視野面積×100%。

2.4.4 RT-qPCR 檢測(cè)大鼠心肌組織Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA 的表達(dá)

取凍存的大鼠左室心肌組織100 mg放入研缽中，加入1 mL Trizol，低溫充分研磨成勻漿，提取心肌總RNA。采用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA 的完整度，采用分光光度法測(cè)定RNA 的濃度和純度，使總RNA 濃度在3～5 μg/μL，A260/A280比值在1.8～2.0。取2 μg RNA，在20 μL 體系中按照Two Step Real-Time PCR Kit（SYBR Green）試劑盒說(shuō)明書操作步驟反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于-20 ℃冰箱保存待用。以β-actin 為內(nèi)參，取2 μL cDNA，在30 μL 體系中按照上述試劑盒說(shuō)明書操作步驟，用MX3000P 熒光定量PCR 儀分別對(duì)大鼠CollagenⅠ、Collagen Ⅲ進(jìn)行擴(kuò)增，引物由上海艾博思生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列見(jiàn)表1。PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃、3 min，1 個(gè)循環(huán)；變性94 ℃、15 s，退火55 ℃、40 s，延伸72 ℃、60 s，40 個(gè)循環(huán)。PCR 結(jié)束后用軟件測(cè)定Ct 值，用2-ΔΔCt表示CollagenⅠ、Collagen Ⅲ的mRNA 相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

表1 各基因PCR 引物序列

2.4.5 Western blot 檢測(cè)大鼠心肌組織Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)

剪取凍存的大鼠左室心肌組織300 mg，加300 μL預(yù)冷組織細(xì)胞裂解液，制成心肌細(xì)胞勻漿，置冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min 離心30 min，取上清液移至新離心管，BCA 法測(cè)定總蛋白。剩余蛋白樣品加入2×loading buffer，混勻，100 ℃加熱5 min，冰上冷卻，12 000 r/min 離心5 min，分別以每孔上樣量為50 μg 蛋白樣品使用10%SDS-PAGE 進(jìn)行電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉。加入稀釋好的重組Anti-CollagenⅠ或Ⅲ抗體（1 ∶2000）、重組Anti-β-actin抗體（1∶10 000），4 ℃孵育過(guò)夜，用1×TBST 洗滌4 次，每次10 min。加入稀釋好的HRP 標(biāo)記的二抗（1 ∶2000），37 ℃孵育2 h，用1×TBST 洗滌4 次，每次10 min。加入ECL 超敏發(fā)光液孵育后，暗室內(nèi)曝光、顯影、定影，凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，以β-actin為內(nèi)參照，用Gel-Pro Analyzer 軟件分析各組條帶，計(jì)算CollagenⅠ、Collagen Ⅲ蛋白條帶的灰度值與β-actin 蛋白條帶灰度值的比值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 存活情況

藥物干預(yù)4 周后，空白對(duì)照組大鼠生長(zhǎng)良好、無(wú)死亡，模型組存活13 只，參芪利心湯低劑量組存活14 只，依那普利組和參芪利心湯高劑量組各存活16只，參芪利心湯中劑量組存活15 只。

4.2 參芪利心湯對(duì)模型大鼠心功能的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠LVESd、LVEDd明顯增大，EF、FS、CO 明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；與模型組比較，各給藥組大鼠LVESd、LVEDd 均不同程度減小，EF、FS、CO 均不同程度升高，除參芪利心湯低劑量組外，余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；與依那普利組比較，參芪利心湯低劑量組大鼠LVESd、LVEDd 明顯增大，EF、FS、CO 明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠心功能指標(biāo)比較（）

表2 各組大鼠心功能指標(biāo)比較（）

注：與空白對(duì)照組比較，***P＜0.001；與模型組比較，###P＜0.001；與依那普利組比較，△△△P＜0.001

4.3 參芪利心湯對(duì)模型大鼠心肌組織纖維化程度的影響

空白對(duì)照組大鼠心肌組織排列整齊、緊密，心肌間質(zhì)僅見(jiàn)極少量條索狀藍(lán)色膠原纖維組織；模型組大鼠心肌組織排列紊亂、疏松，心肌纖維化明顯，心肌間質(zhì)可見(jiàn)大量片狀藍(lán)色膠原纖維組織增生；參芪利心湯低劑量組大鼠心肌纖維化程度較模型組稍減輕，但心肌間質(zhì)仍可見(jiàn)大量小片狀藍(lán)色膠原纖維組織增生，心肌組織亦排列紊亂、疏松；其余各給藥組大鼠心肌纖維化程度較模型組明顯減輕，心肌間質(zhì)可見(jiàn)散在小灶狀或條索狀藍(lán)色膠原纖維組織增生，其中參芪利心湯高劑量組和依那普利組大鼠心肌組織排列相對(duì)整齊、緊密。結(jié)果見(jiàn)圖1。

4.4 參芪利心湯對(duì)模型大鼠心肌膠原容積分?jǐn)?shù)的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌CVF 明顯升高（P＜0.001）；與模型組比較，各給藥組大鼠心肌CVF 均不同程度降低，除參芪利心湯低劑量組外，余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；與依那普利組比較，參芪利心湯低劑量組大鼠心肌CVF 升高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。結(jié)果見(jiàn)表3。

圖1 各組大鼠心肌組織形態(tài)（Masson 染色，×200）

表3 各組大鼠心肌CVF 水平比較（，%）

表3 各組大鼠心肌CVF 水平比較（，%）

注：與空白對(duì)照組比較，***P＜0.001；與模型組比較，###P＜0.001；與依那普利組比較，△△△P＜0.001

4.5 參芪利心湯對(duì)模型大鼠血漿N 端B型利鈉肽原和血管緊張素Ⅱ水平的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血漿NT-proBNP、AngⅡ水平明顯升高（P＜0.001）；與模型組比較，各給藥組大鼠血漿NT-proBNP、AngⅡ水平均有不同程度降低，除參芪利心湯低劑量組外，余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；與依那普利組比較，參芪利心湯低劑量組大鼠血漿NT-proBNP、AngⅡ水平明顯升高（P＜0.001）。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠血漿NT-proBNP、AngⅡ水平比較（，ng/L）

表4 各組大鼠血漿NT-proBNP、AngⅡ水平比較（，ng/L）

注：與空白對(duì)照組比較，***P＜0.001；與模型組比較，###P＜0.001；與依那普利組比較，△△△P＜0.001

4.6 參芪利心湯對(duì)模型大鼠心肌組織Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA 表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織CollagenⅠ、Collagen Ⅲ mRNA 表達(dá)明顯升高（P＜0.001）；與模型組比較，各給藥組大鼠心肌組織CollagenⅠ、Collagen Ⅲ mRNA 表達(dá)均有不同程度降低，除參芪利心湯低劑量組外，余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；與依那普利組比較，參芪利心湯低劑量組大鼠心肌組織CollagenⅠ、Collagen Ⅲ mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.001）。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 各組大鼠心肌組織CollagenⅠ、Collagen Ⅲ mRNA 表達(dá)比較（）

表5 各組大鼠心肌組織CollagenⅠ、Collagen Ⅲ mRNA 表達(dá)比較（）

注：與空白對(duì)照組比較，***P＜0.001；與模型組比較，###P＜0.001；與依那普利組比較，△△△P＜0.001

4.7 參芪利心湯對(duì)模型大鼠心肌組織Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織CollagenⅠ、Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；與模型組比較，各給藥組大鼠心肌組織CollagenⅠ、Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)均不同程度降低，除參芪利心湯低劑量組外，余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.001）；與依那普利組比較，參芪利心湯低劑量組大鼠心肌組織CollagenⅠ、Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織CollagenⅠ、Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)比較（）

5 討論

心力衰竭動(dòng)物模型制備方法很多，本實(shí)驗(yàn)采用近年來(lái)國(guó)內(nèi)外比較公認(rèn)的阿霉素誘導(dǎo)心力衰竭大鼠模型。阿霉素是一種廣譜、高效的蒽醌類抗腫瘤藥物，具有嚴(yán)重的心臟毒性作用，其對(duì)心肌的損害是一個(gè)慢性、蓄積性過(guò)程，主要通過(guò)大量氧自由基和細(xì)胞內(nèi)鈣超載，直接損傷細(xì)胞核，影響線粒體能量代謝，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡、自噬，引起肌成纖維細(xì)胞逐漸增多，膠原纖維組織增生及膠原蛋白過(guò)度沉積，最終導(dǎo)致心肌纖維化、心室重構(gòu)[5]。阿霉素造模目前主要有腹腔注射和尾靜脈注射2 種方式，但具體給藥劑量、給藥時(shí)間無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道也各不相同。本課題組前期心力衰竭動(dòng)物造模結(jié)果也提示造模后期大鼠死亡率偏高，考慮可能與阿霉素引起骨髓抑制、消化道反應(yīng)、內(nèi)環(huán)境紊亂等有關(guān)[6]。結(jié)合阿霉素致心力衰竭具有劑量累積性、劑量依賴性及時(shí)間延后效應(yīng)等特點(diǎn)，參考相關(guān)文獻(xiàn)[7-8]，在課題組前期造模方案基礎(chǔ)上適當(dāng)予以改良。本實(shí)驗(yàn)采用小劑量、長(zhǎng)時(shí)間、后期減量、多次給藥的造模方案，又因尾靜脈注射操作困難且易致?tīng)€尾，故選用腹腔注射方式給藥，此種造模方法簡(jiǎn)便且經(jīng)濟(jì)、成功率較高、可重復(fù)性好。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，造模大鼠第16 日開始出現(xiàn)中毒癥狀，表現(xiàn)為精神萎靡，少活動(dòng)、倦臥，進(jìn)食減少，呼吸加快，皮毛槁枯等，4 周后開始出現(xiàn)死亡；與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織存在嚴(yán)重纖維化，心功能顯著下降（EF≤45%），血漿NT-proBNP 水平顯著升高，表明阿霉素誘導(dǎo)心力衰竭模型成功，這與相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果大致相同[9]。

現(xiàn)代研究表明，以神經(jīng)內(nèi)分泌為主多種因素參與的心室重構(gòu)是心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的主要病理生理機(jī)制，而心肌纖維化是其重要的病理學(xué)基礎(chǔ)[10]。心肌纖維化是指心肌間質(zhì)中出現(xiàn)膠原纖維過(guò)度沉積、膠原蛋白（主要是CollagenⅠ、Collagen Ⅲ）濃度升高或成分異常等為特征的心肌間質(zhì)重構(gòu)，是心室重構(gòu)的重要表現(xiàn)形式之一，也是心功能由代償轉(zhuǎn)變?yōu)槭Т鷥數(shù)闹匾h(huán)節(jié)[11]。心肌纖維化后出現(xiàn)心肌僵硬度升高、順應(yīng)性下降，收縮或舒張功能障礙，引起心功能降低，最終導(dǎo)致心力衰竭[12-13]。心肌纖維化還包括凋亡的心肌細(xì)胞被大量心肌成纖維細(xì)胞和纖維性膠原成分所取代[14]，因此，抑制心肌纖維化，是改善心功能、延緩心力衰竭進(jìn)展的重要措施之一。NT-proBNP 是目前國(guó)內(nèi)外急慢性心力衰竭防治指南推薦的最重要的生物學(xué)標(biāo)志物，為心力衰竭的診斷、病情嚴(yán)重程度、臨床療效、預(yù)后評(píng)估及院外管理提供了重要的依據(jù)，是心力衰竭最強(qiáng)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子之一[15-17]。現(xiàn)代藥理研究表明，中藥對(duì)心力衰竭心肌纖維化有很好的防治作用[18]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠行心肌Masson 染色，觀察心肌組織纖維化程度，測(cè)定心肌CVF，并檢測(cè)心功能指標(biāo)和血漿NT-proBNP 水平，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織膠原纖維明顯增生，CVF及NT-proBNP 顯著升高，而心功能指標(biāo)（EF、FS、CO）明顯降低，表明心力衰竭病程中存在明顯的心肌纖維化，引起心肌順應(yīng)性下降、僵硬度增加，收縮及舒張功能減退，進(jìn)而導(dǎo)致心功能顯著下降。與模型組比較，參芪利心湯各劑量組大鼠心肌纖維化均不同程度減輕，其中參芪利心湯中、高劑量組更為明顯；參芪利心湯各劑量組大鼠CVF 和NT-proBNP 均不同程度下降，而EF、FS、CO 不同程度升高，同樣以中、高劑量組改變明顯，表明心力衰竭時(shí)心肌纖維化程度與心功能存在明顯的相關(guān)性，參芪利心湯中、高劑量可有效減少心力衰竭大鼠心肌組織膠原纖維增生，降低心肌CVF，抑制心肌纖維化，逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，從而改善心力衰竭大鼠的心功能。

心力衰竭時(shí)心排血量下降，腎灌注量不足，導(dǎo)致腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）激活，促進(jìn)血漿AngⅡ分泌增加，而AngⅡ與血管緊張素受體1（AT1）相結(jié)合，引起心肌成纖維細(xì)胞增殖、細(xì)胞間質(zhì)膠原蛋白過(guò)表達(dá)、基質(zhì)沉積等，導(dǎo)致心肌纖維化[19]。目前，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ACEI）已成為心力衰竭臨床治療的“金三角”之一，其可通過(guò)抑制RAAS 激活，降低血漿AngⅡ水平，從而減少心肌纖維化、逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，改善心力衰竭[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，依那普利作為目前臨床最常用的ACEI類藥物，可通過(guò)降低心力衰竭大鼠血漿AngⅡ水平，減少心肌膠原纖維增生，降低心肌 CVF 及血漿NT-proBNP 水平，起到抑制心肌纖維化、改善心功能的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，參芪利心湯中、高劑量組血漿AngⅡ、NT-proBNP 水平、心肌膠原纖維增生程度及心肌CVF 與依那普利組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明參芪利心湯中、高劑量改善心力衰竭大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)、抑制心肌纖維化和改善心功能與依那普利基本相當(dāng)。

現(xiàn)代研究表明，心肌間質(zhì)除膠原纖維外，還有大量膠原蛋白，后者主要由CollagenⅠ和Collagen Ⅲ組成，約占心臟干重的3%～6%，其生理功能在于為心肌細(xì)胞提供支持、傳導(dǎo)應(yīng)力并保證心肌順應(yīng)性[21]。心力衰竭時(shí)心肌間質(zhì)CollagenⅠ、Collagen Ⅲ合成過(guò)度是心肌纖維化的生物學(xué)基礎(chǔ)[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織CollagenⅠ、Collagen Ⅲ mRNA 和蛋白表達(dá)顯著升高，表明心力衰竭時(shí)同樣存在心肌間質(zhì)CollagenⅠ、Collagen Ⅲ的過(guò)表達(dá)，是心肌纖維化的重要病理改變，這與上述研究結(jié)果[22]基本相符。參芪利心湯各劑量組大鼠心肌組織CollagenⅠ、Collagen Ⅲ mRNA 和蛋白表達(dá)較模型組均不同程度降低，且存在一定的量效關(guān)系，中、高劑量組顯著降低，低劑量組降低不明顯。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，參芪利心湯可有效降低心肌組織CollagenⅠ、Collagen Ⅲ的表達(dá)，減少心肌僵硬度，從而抑制心肌纖維化、逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，這可能是其改善心力衰竭大鼠心功能的作用機(jī)制之一。

心力衰竭是一組復(fù)雜的臨床綜合征，根據(jù)其臨床表現(xiàn)及特征，可歸屬中醫(yī)學(xué)“喘證”“痰飲”“心悸”“水腫”等范疇。當(dāng)代諸多醫(yī)家認(rèn)為其病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜，本虛為心氣（陽(yáng)）虛，標(biāo)實(shí)為瘀血、水飲停留，以益氣溫陽(yáng)、活血利水為治療大法[23]。參芪利心湯是黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院劉莉教授臨床治療心力衰竭經(jīng)驗(yàn)方，該方基于“益氣、溫陽(yáng)、活血、利水”治療大法組方而成，防治心力衰竭臨床療效確切[3-4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，參芪利心湯可降低心力衰竭大鼠血漿NT-proBNP、AngⅡ水平，減少心肌組織膠原纖維增生，降低CVF，下調(diào)CollagenⅠ、Collagen Ⅲ mRNA 及蛋白的表達(dá)，從而抑制心肌纖維化、改善心力衰竭，這可能與參芪利心湯中君藥人參和黃芪密切相關(guān)。彭程飛等[24]研究表明，人參主要成分人參皂苷Rg1 能有效抑制大鼠急性心肌梗死后心肌纖維化。唐斌等[25]研究表明，黃芪主要成分黃芪甲苷能抑制慢性心力衰竭大鼠心肌纖維化、糾正心肌能量代謝。本研究結(jié)果為參芪利心湯臨床治療心力衰竭提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為中醫(yī)藥防治心力衰竭提供新思路和研究方向。

綜上所述，本研究通過(guò)建立阿霉素誘導(dǎo)的心力衰竭大鼠模型，觀察參芪利心湯對(duì)心力衰竭大鼠心肌組織膠原纖維和膠原蛋白重構(gòu)的影響以及心功能的變化，結(jié)果表明參芪利心湯能有效減少心力衰竭大鼠心肌間質(zhì)膠原纖維增生，并下調(diào)心肌組織CollagenⅠ、Collagen Ⅲ的表達(dá)，起到抗心肌纖維化、逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的作用，這可能是其改善心功能的作用機(jī)制之一。參芪利心湯上述作用可能與其阻斷RAAS，降低血漿中AngⅡ水平，減少與AT1 結(jié)合，抑制心肌纖維化這一途徑有關(guān)，但具體調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚。心肌纖維化發(fā)生發(fā)展受到多種信號(hào)通路的共同影響，多種單味中藥提取物或復(fù)方制劑均能通過(guò)多種機(jī)制干預(yù)心肌纖維化[26]，參芪利心湯是否通過(guò)TGF-β1/Smads、Wnt、MMPS 等其他轉(zhuǎn)導(dǎo)通路干預(yù)心肌纖維化進(jìn)展，是課題組今后研究的方向。