曹暉,吳東升,張彧,鄒博,陳睿旖,李梓菡
湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,湖南 長沙 410007
潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種常見的慢性非特異性的腸道炎癥,臨床以腹痛、腹瀉、膿血便等為主要表現(xiàn),具有病程長、反復(fù)發(fā)作、難以治愈等特點,被世界衛(wèi)生組織列為難治病之一[1]。UC病因病機目前尚未完全闡明,腸道菌群失調(diào)引起的腸道黏膜免疫異常是UC 的重要原因之一[2]。生理條件下腸道菌群保持動態(tài)平衡,當(dāng)腸道菌群失衡時,有害細(xì)菌將過度生長,從而導(dǎo)致結(jié)腸疾病的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn),益生菌與人類健康密切相關(guān),尤其是腸黏膜屏障[3]。因此,腸道菌群的調(diào)控可能是UC 機制研究及治療的一大突破點。
UC 屬中醫(yī)學(xué)“泄瀉”“腸澼”“久痢”等范疇。其基本病機為濕熱蘊結(jié)腸道,氣血相搏,血敗肉腐而成[4]。芍藥湯出自《素問病機氣宜保命集》,具有清臟腑熱、清熱燥濕、調(diào)氣和血等功效,是治療UC 的代表方劑之一[5]。本課題組前期研究表明,芍藥湯通過增加腸黏膜中CD4+T 細(xì)胞、分泌型免疫球蛋白A(SIgA)的表達減輕腸黏膜免疫屏障的損傷,通過調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等因子的表達干預(yù)UC 免疫功能[6-7]。鑒于腸道菌群在UC 發(fā)病過程和治療中具有重要作用,本研究建立大鼠UC 模型,采用高通量測序技術(shù)探究芍藥湯對模型大鼠腸道菌群的影響,從菌群紊亂的角度探討芍藥湯治療UC 的作用機制。
雄性SD 大鼠50 只,體質(zhì)量150~170 g,購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,動物許可證號SCXK(湘)2016-0002。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF 級動物房,溫度(22±2)℃,相對濕度40%~60%。實驗前大鼠適應(yīng)環(huán)境3 d,并隨意喂食標(biāo)準(zhǔn)食物和水。
芍藥湯(白芍30 g,黃芩15 g,黃連15 g,大黃9 g,當(dāng)歸15 g,檳榔6 g,木香6 g,肉桂5 g,炙甘草6 g),飲片購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房,由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院鄧桂明副主任藥師鑒定均為正品。將飲片混勻后用雙蒸水浸泡2 h,煮沸后小火煎煮30 min,重復(fù)1 次,第1 煎加入飲片量8 倍水,第2 煎加入飲片量6 倍水,離心、過濾,取上清液,將2 次煎液合并,使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至含原藥材1.1 g/mL,置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆??;旌峡股刂苽洌簠⒖糝oddigues 等[8]研究方法制備干預(yù)腸道菌群的標(biāo)準(zhǔn)混合抗生素,每次灌胃前將氨芐西林膠囊(珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司,批號04003103)、硫酸新霉素可溶性粉(長沙巨龍生物科技有限公司,批號20190805)混合溶于蒸餾水中,配制成氨芐西林1 g/L、硫酸新霉素1 g/L 水溶液,甲硝唑氯化鈉注射液(湖南漢森制藥股份有限公司,批號C19102207B)用生理鹽水稀釋為1 g/L,注射用鹽酸萬古霉素(Vianex S.A 公司,批號C880387)配制前先用注射用水溶解,再用生理鹽水稀釋為0.5 g/L。將以上4 種藥物等體積混合后灌胃。美沙拉嗪腸溶片,黑龍江天宏藥業(yè)股份有限公司,批號20190109。
10%水合氯醛(天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司,批號20170328),HE 染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,批號C0105),5% TNBS(美國Sigma公司,批號SLBX3263),IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒(武漢基因美生物科技有限公司,批號均為201803),糞便基因組DNA 提取試劑盒(廣州美基生物科技有限公司,批號D3141-02),Qubit?雙鏈DNA檢測試劑盒(美國Invitrogen 公司,批號Q32850),引物序列設(shè)計(美國Invitrogen 公司)。TG16W 型微量高速離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司),RM2235 型精密輪轉(zhuǎn)切片機(德國Leica 公司),KD-BM.BL 型組織包埋機(浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司),YD-AB 型組織攤烤片機(浙江益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司),BA410E 型光學(xué)掃描顯微鏡(日本Olympus 公司),hiseq2500 型高通量測序儀(北京百邁客公司)。
50 只大鼠隨機取10 只作為正常組,剩余40 只大鼠參照前期實驗造模[6]。造模前大鼠禁食24 h,腹腔注射10%水合氯醛(4.0 mL/kg)麻醉,將石蠟油潤滑過的直徑0.4 mm 聚乙烯軟管插入直腸,深度約8 cm,緩慢注入5%TNBS 50 mg/kg+50%乙醇0.25 mL,再將大鼠提尾倒置60 s,使藥液充分停留結(jié)直腸內(nèi)。正常組給予等體積生理鹽水灌腸,清醒后自由飲水。造模7 d 后隨機抽取2 只模型組大鼠解剖觀察,結(jié)腸組織大體觀表現(xiàn)為黏膜多發(fā)潰瘍,表面覆有黃濁苔,黏膜充血、水腫;HE 染色顯示結(jié)腸黏膜充血、水腫、潰瘍,并有大量淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤時,提示UC 大鼠模型制備成功[9]。采用隨機數(shù)字表法將成模大鼠隨機分為模型組、抗生素組、芍藥湯(11.1 g/kg)組和美沙拉嗪(0.42 g/kg)組。于造模7 d 后開始灌胃給藥,美沙拉嗪組和芍藥湯組2 mL/次,1 次/d;抗生素組2 mL/次,2 次/d;正常組和模型組給予等量生理鹽水灌胃,1 次/d,連續(xù)給藥7 d。
末次給藥24 h 后,大鼠腹腔注射10%水合氯醛(4.0 mL/kg)麻醉,腹主動脈采血,離心,取上清液,置于-20 ℃冰箱保存待測。采血后脫頸處死大鼠,冷凍取材解剖大鼠并切取結(jié)腸,沿腸系膜縱向解剖。收集距肛門約8 cm 處結(jié)腸附近的糞便顆粒,放入滅菌EP 管中,-80 ℃冰箱保存,糞便標(biāo)本送至深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進行高通量測序技術(shù)檢測;另收集距離肛門約8 cm 處結(jié)腸組織,進行HE 染色,-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
將結(jié)腸組織置于4%多聚甲醛中固定24 h 以上。梯度乙醇脫水、二甲苯透明,將組織浸入蠟中包埋,切片(厚度4 μm),脫蠟,蘇木素染色5 min,PBS洗滌,1%鹽酸乙醇中分化,伊紅溶液染色30 s,梯度乙醇脫水,進行透明處理,中性膠密封,鏡下觀察其病理變化。
取大鼠全血,4 ℃、3000 r/min 離心10 min,收集上清液,貯存于-80 ℃冰箱。按ELISA 試劑盒說明書進行操作,測定血清IL-6、IL-1β、TNF-α 的含量。
各組隨機選取5 只大鼠糞便標(biāo)本,使用DNA 試劑盒從大鼠糞便中提取基因組DNA。以帶有341F 5’-806R 的序列為引物,以細(xì)菌16S rDNA 的V3~V4區(qū)域進行PCR 擴增。2%瓊脂糖凝膠中提取擴增子,并用 AxyPrep DNA 凝膠提取試劑盒純化,以QuantiFluor?-ST 進行檢測定量。純化的PCR 產(chǎn)物通過Illumina 的基因組DNA 文庫制備程序,應(yīng)用合并的DNA 產(chǎn)物建立Illumina Pair-End 文庫。通過Illumina Mi Seq PE300 平臺進行高通量測序,獲取細(xì)菌16S rRNA 基因的V3~V4 可變區(qū)堿基序列信息。利用QIIME2.0 軟件包,對測序片段進行OTU Venn圖、主成分分析(PCA),獲取OTU 對應(yīng)的分類單元(包括門綱目科屬種)及其相應(yīng)的豐度信息,計算ACE、Chao1、Shannon 等度量指數(shù)并用R(v3.1.1)軟件制作相應(yīng)的稀釋曲線圖,評估樣品中細(xì)菌菌群的豐富度和均勻度。通過與數(shù)據(jù)庫進行比對,對OTU進行物種分類,并分別在門、綱、目、科、屬、種幾個分類等級對各樣品作物種豐度柱狀圖[10]。
正常組大鼠腸黏膜完整,腺體排列規(guī)則,結(jié)構(gòu)清晰,無水腫、充血或組織壞死;模型組大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損,腺體排列紊亂或丟失,腸黏膜明顯充血、水腫,大量炎性細(xì)胞浸潤,腸壁大量纖維化,病變侵及黏膜下層、肌層甚至漿膜層,伴見明顯潰瘍及炎性肉芽腫;芍藥湯組、美沙拉嗪組、抗生素組大鼠炎性細(xì)胞浸潤減少,腸黏膜上皮細(xì)胞完整性改善,結(jié)腸黏膜損傷減輕,表現(xiàn)為腸黏膜輕度充血、水腫,腺體排列基本完整,少量炎性細(xì)胞浸潤,未見明顯凹陷性潰瘍及炎性肉芽腫出現(xiàn)。結(jié)果見圖1。
與正常組比較,模型組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α 含量顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,芍藥湯組、美沙拉嗪組、抗生素組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α 含量不同程度下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,P<0.05),給藥組間比較差異不明顯。結(jié)果見圖2。
圖1 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織形態(tài)(HE 染色,×100)
圖2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較()
本研究采用OTU Venn 圖分析各組間菌群OTU數(shù)量及其種類交叉情況,采用PCA 檢測樣本間菌群豐度整體差異。各組總的/特異性O(shè)TU 數(shù)分別為正常組681/24、模型組578/34、抗生素組499/45、芍藥湯組683/16、美沙拉嗪組649/14,各組共檢測OUT 867個,其中共有OUT 為325個,占總OTU 數(shù)的37.49%;與正常組比較,模型組腸道菌群物種豐度降低;與模型組比較,抗生素組腸道菌群物種豐度降低,芍藥湯組、美沙拉嗪組菌群物種豐度升高。各組樣本OTU豐度的PCA 分析結(jié)果顯示,各組間區(qū)分明顯,表明TNBS 造模及藥物干預(yù)等可影響腸道菌群的豐度及結(jié)構(gòu);與模型組比較,抗生素組向右分散明顯,表明抗生素組菌群結(jié)構(gòu)較模型組變化較大,芍藥湯組、美沙拉嗪組向左聚集,并有向正常組回歸的趨勢,表明芍藥湯、美沙拉嗪可促進腸道菌群豐度和結(jié)構(gòu)的恢復(fù),且芍藥湯組與美沙拉嗪組的菌群結(jié)構(gòu)具有更高的相似性。結(jié)果見圖3、圖4。
Alpha 多樣性是對單個樣品中物種多樣性的分析[11],包括ACE、Chao1、Shannon 和Simpson 指數(shù)等。前3 個指數(shù)越大,后1 個指數(shù)越小,表明樣品中的物種越豐富。ACE、Chao1 指數(shù)反映單個樣本中物種的群落豐富度,而Shannon、Simpson 指數(shù)代表微生物多樣性,通過計算各組樣品的Shannon、Simpson指數(shù)制作對應(yīng)的稀釋曲線。與模型組比較,芍藥湯組、美沙拉嗪組ACE、Chao1、Shannon 指數(shù)明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);抗生素組ACE、Chao1、Shannon 指數(shù)較模型組明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01);芍藥湯組與美沙拉嗪比較無明顯變化,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較,芍藥湯組、美沙拉嗪組Simpson 指數(shù)明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);抗生素組Simpson 指數(shù)升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。以上結(jié)果表明,與模型組比較,抗生素組腸道菌群多樣性降低,美沙拉嗪組、芍藥湯組腸道菌群多樣性均增加,其中芍藥湯組、美沙拉嗪組菌群多樣性趨近正常組。結(jié)果見表1、圖5、圖6。
圖3 各組大鼠腸道菌群OTU 分析
圖4 各組大鼠腸道菌群PCA
表1 各組大鼠腸道菌群Alpha 多樣性比較()
表1 各組大鼠腸道菌群Alpha 多樣性比較()
注:與正常組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01
圖5 各組大鼠腸道菌群Shannon 指數(shù)稀釋曲線
圖6 各組大鼠腸道菌群Simpson 指數(shù)稀釋曲線
根據(jù)OTU 的絕對豐度和注釋信息,統(tǒng)計分析每個樣本中門和屬水平的序列數(shù)與序列總數(shù)的比率,以評估每個組在門和屬水平的物種組成差異。門分類水平主要檢測出13 個菌門,其中占比較多的菌門主要是擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)。與正常組比較,模型組厚壁菌門和變形菌門豐度減少,擬桿菌門豐度增加;與模型組比較,抗生素組擬桿菌門、厚壁菌門等菌門豐度明顯減少,變形菌門豐度增加,芍藥湯組和美沙拉嗪組較模型組厚壁菌門和變形菌門豐度增加,擬桿菌門豐度減少。屬分類水平物種分析結(jié)果表明,與正常組比較,模型組擬桿菌屬(Bacterides)豐度增加,梭菌屬(Clostridium)、顫螺旋菌屬(Oscillospira)、乳酸菌屬(Lactobacillus)、普雷沃菌屬(Prevotella )、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、帕拉普氏菌屬(Paraprevotella)、羅斯氏菌屬(Roseburia)豐度減少少;與模型組及及正常組比較較,抗生素組組菌群變化較大大,菌群種類明顯減少,主要含有乳酸菌屬、擬桿菌屬、薩特氏菌屬(Sutterella)、勞特氏菌屬(Blautia)、埃希氏菌屬(Escherichia)等;芍藥湯組和美沙拉嗪組較模型組擬桿菌屬豐度減少,梭菌屬、顫螺旋菌屬、乳酸菌屬、普雷沃菌屬、瘤胃球菌屬、帕拉普氏菌屬、羅斯氏菌屬豐度增加。見圖7、圖8。
圖7 各組大鼠腸道菌群門分類水平物種柱狀圖
圖8 各組大鼠腸道菌群屬分類水平物種柱狀圖
中醫(yī)藥治療UC 具有多組分、多靶點的特點,因而療效較好,且具有復(fù)發(fā)率低、不良反應(yīng)少等優(yōu)點。芍藥湯具有調(diào)氣活血、清熱利濕功效,為治療濕熱痢疾之主方,《潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)診療專家共識》將芍藥湯認(rèn)定為治療大腸濕熱證UC 的主方[5]。
UC 是一種復(fù)發(fā)性炎性疾病,其特征在于免疫反應(yīng)失調(diào)和細(xì)胞因子釋放失衡。在UC 發(fā)病機制中,腸道黏膜免疫系統(tǒng)失衡,主要表現(xiàn)為促炎因子和抗炎因子水平不平衡[12]。因此,對炎性介質(zhì)的有利調(diào)節(jié)可為UC 提供可行的治療策略。本實驗中,TNBS 造模引起大鼠結(jié)腸病理性損傷,血清炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α 水平明顯升高,與模型組比較,芍藥湯可有效抑制IL-6、IL-1β、TNF-α 失控釋放,表明其改善UC作用可能與調(diào)節(jié)炎癥因子密切相關(guān)。
腸道菌群組成的變化可能影響腸道微生態(tài),進而影響免疫和代謝功能,并導(dǎo)致多種自身免疫和腸道疾病[13]。腸道菌群在UC 發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。腸道菌群失調(diào)的嚴(yán)重程度直接影響炎癥的進展速度[14]。本實驗中,Venn 圖、Alpha 多樣性分析等結(jié)果顯示,TNBS 造模引起的腸道炎癥使腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化,腸道菌群紊亂是引起腸黏膜炎癥的重要原因,而給藥后菌群結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù),表明芍藥湯可能通過恢復(fù)腸道菌群的豐度、多樣性從而減輕腸道炎癥。腸道菌群物種注釋和差異分析結(jié)果表明,模型組和芍藥湯組之間腸道菌群的門和屬分類有顯著差異,表明芍藥湯可改善UC 結(jié)腸中菌群的多樣性和菌群紊亂,且TNBS 誘導(dǎo)的UC 大鼠中致病菌顯著增加,而保護性細(xì)菌(如厚壁菌門、梭菌屬、顫螺旋菌屬等)明顯減少,芍藥湯可增加厚壁菌門、顫螺旋菌屬、乳酸菌屬、普雷沃菌屬、瘤胃球菌屬、帕拉普氏菌屬、羅斯氏菌屬等益生菌或正常菌的相對含量,表明芍藥湯可提高腸道菌群多樣性,促進益生菌和共生菌群的生長,抑制機會性致病菌或有害菌的定植,這有助于維持腸道菌群的穩(wěn)態(tài)。通過對腸道菌群、炎癥因子、腸道炎癥進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),隨著UC 腸道炎癥的發(fā)展,促炎因子分泌增加,損害性細(xì)菌增多,保護性細(xì)菌減少,腸道炎癥加劇,厚壁菌門、乳酸菌屬、瘤胃球菌屬、羅斯氏菌屬等保護性細(xì)菌與IL-6、TNF-α、IL-1β 等促炎因子之間存在顯著負(fù)相關(guān),擬桿菌等損害性菌與促炎因子間呈正相關(guān),而芍藥湯可有效逆轉(zhuǎn)促炎因子及腸道菌群的這種變化趨勢。
綜上所述,腸道菌群與體內(nèi)細(xì)胞因子的分泌和表達密切相關(guān),彼此相互影響,調(diào)節(jié)免疫功能。芍藥湯對UC 有確切的治療作用,并且可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群的豐度和多樣性影響腸道菌群,進而起到減輕腸道炎癥和治療UC 的作用。