曹暉，吳東升，張彧，鄒博，陳睿旖，李梓菡

湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種常見的慢性非特異性的腸道炎癥，臨床以腹痛、腹瀉、膿血便等為主要表現(xiàn)，具有病程長、反復(fù)發(fā)作、難以治愈等特點，被世界衛(wèi)生組織列為難治病之一[1]。UC病因病機(jī)目前尚未完全闡明，腸道菌群失調(diào)引起的腸道黏膜免疫異常是UC 的重要原因之一[2]。生理條件下腸道菌群保持動態(tài)平衡，當(dāng)腸道菌群失衡時，有害細(xì)菌將過度生長，從而導(dǎo)致結(jié)腸疾病的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，益生菌與人類健康密切相關(guān)，尤其是腸黏膜屏障[3]。因此，腸道菌群的調(diào)控可能是UC 機(jī)制研究及治療的一大突破點。

UC 屬中醫(yī)學(xué)“泄瀉”“腸澼”“久痢”等范疇。其基本病機(jī)為濕熱蘊(yùn)結(jié)腸道，氣血相搏，血敗肉腐而成[4]。芍藥湯出自《素問病機(jī)氣宜保命集》，具有清臟腑熱、清熱燥濕、調(diào)氣和血等功效，是治療UC 的代表方劑之一[5]。本課題組前期研究表明，芍藥湯通過增加腸黏膜中CD4+T 細(xì)胞、分泌型免疫球蛋白A（SIgA）的表達(dá)減輕腸黏膜免疫屏障的損傷，通過調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等因子的表達(dá)干預(yù)UC 免疫功能[6-7]。鑒于腸道菌群在UC 發(fā)病過程和治療中具有重要作用，本研究建立大鼠UC 模型，采用高通量測序技術(shù)探究芍藥湯對模型大鼠腸道菌群的影響，從菌群紊亂的角度探討芍藥湯治療UC 的作用機(jī)制。

1 實驗材料

1.1 動物

雄性SD 大鼠50 只，體質(zhì)量150～170 g，購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2016-0002。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF 級動物房，溫度（22±2）℃，相對濕度40%～60%。實驗前大鼠適應(yīng)環(huán)境3 d，并隨意喂食標(biāo)準(zhǔn)食物和水。

1.2 藥物及制備

芍藥湯（白芍30 g，黃芩15 g，黃連15 g，大黃9 g，當(dāng)歸15 g，檳榔6 g，木香6 g，肉桂5 g，炙甘草6 g），飲片購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院鄧桂明副主任藥師鑒定均為正品。將飲片混勻后用雙蒸水浸泡2 h，煮沸后小火煎煮30 min，重復(fù)1 次，第1 煎加入飲片量8 倍水，第2 煎加入飲片量6 倍水，離心、過濾，取上清液，將2 次煎液合并，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至含原藥材1.1 g/mL，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。混合抗生素制備：參考Roddigues 等[8]研究方法制備干預(yù)腸道菌群的標(biāo)準(zhǔn)混合抗生素，每次灌胃前將氨芐西林膠囊（珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司，批號04003103）、硫酸新霉素可溶性粉（長沙巨龍生物科技有限公司，批號20190805）混合溶于蒸餾水中，配制成氨芐西林1 g/L、硫酸新霉素1 g/L 水溶液，甲硝唑氯化鈉注射液（湖南漢森制藥股份有限公司，批號C19102207B）用生理鹽水稀釋為1 g/L，注射用鹽酸萬古霉素（Vianex S.A 公司，批號C880387）配制前先用注射用水溶解，再用生理鹽水稀釋為0.5 g/L。將以上4 種藥物等體積混合后灌胃。美沙拉嗪腸溶片，黑龍江天宏藥業(yè)股份有限公司，批號20190109。

1.3 主要試劑與儀器

10%水合氯醛（天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司，批號20170328），HE 染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號C0105），5% TNBS（美國Sigma公司，批號SLBX3263），IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司，批號均為201803），糞便基因組DNA 提取試劑盒（廣州美基生物科技有限公司，批號D3141-02），Qubit?雙鏈DNA檢測試劑盒（美國Invitrogen 公司，批號Q32850），引物序列設(shè)計（美國Invitrogen 公司）。TG16W 型微量高速離心機(jī)（長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司），RM2235 型精密輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（德國Leica 公司），KD-BM.BL 型組織包埋機(jī)（浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司），YD-AB 型組織攤烤片機(jī)（浙江益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司），BA410E 型光學(xué)掃描顯微鏡（日本Olympus 公司），hiseq2500 型高通量測序儀（北京百邁客公司）。

2 實驗方法

2.1 分組、造模及給藥

50 只大鼠隨機(jī)取10 只作為正常組，剩余40 只大鼠參照前期實驗造模[6]。造模前大鼠禁食24 h，腹腔注射10%水合氯醛（4.0 mL/kg）麻醉，將石蠟油潤滑過的直徑0.4 mm 聚乙烯軟管插入直腸，深度約8 cm，緩慢注入5%TNBS 50 mg/kg＋50%乙醇0.25 mL，再將大鼠提尾倒置60 s，使藥液充分停留結(jié)直腸內(nèi)。正常組給予等體積生理鹽水灌腸，清醒后自由飲水。造模7 d 后隨機(jī)抽取2 只模型組大鼠解剖觀察，結(jié)腸組織大體觀表現(xiàn)為黏膜多發(fā)潰瘍，表面覆有黃濁苔，黏膜充血、水腫；HE 染色顯示結(jié)腸黏膜充血、水腫、潰瘍，并有大量淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤時，提示UC 大鼠模型制備成功[9]。采用隨機(jī)數(shù)字表法將成模大鼠隨機(jī)分為模型組、抗生素組、芍藥湯（11.1 g/kg）組和美沙拉嗪（0.42 g/kg）組。于造模7 d 后開始灌胃給藥，美沙拉嗪組和芍藥湯組2 mL/次，1 次/d；抗生素組2 mL/次，2 次/d；正常組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，1 次/d，連續(xù)給藥7 d。

2.2 標(biāo)本采集

末次給藥24 h 后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（4.0 mL/kg）麻醉，腹主動脈采血，離心，取上清液，置于-20 ℃冰箱保存待測。采血后脫頸處死大鼠，冷凍取材解剖大鼠并切取結(jié)腸，沿腸系膜縱向解剖。收集距肛門約8 cm 處結(jié)腸附近的糞便顆粒，放入滅菌EP 管中，-80 ℃冰箱保存，糞便標(biāo)本送至深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行高通量測序技術(shù)檢測；另收集距離肛門約8 cm 處結(jié)腸組織，進(jìn)行HE 染色，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 HE 染色

將結(jié)腸組織置于4%多聚甲醛中固定24 h 以上。梯度乙醇脫水、二甲苯透明，將組織浸入蠟中包埋，切片（厚度4 μm），脫蠟，蘇木素染色5 min，PBS洗滌，1%鹽酸乙醇中分化，伊紅溶液染色30 s，梯度乙醇脫水，進(jìn)行透明處理，中性膠密封，鏡下觀察其病理變化。

2.4 ELISA 檢測血清炎癥因子

取大鼠全血，4 ℃、3000 r/min 離心10 min，收集上清液，貯存于-80 ℃冰箱。按ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作，測定血清IL-6、IL-1β、TNF-α 的含量。

2.5 高通量測序技術(shù)檢測腸道菌群變化

各組隨機(jī)選取5 只大鼠糞便標(biāo)本，使用DNA 試劑盒從大鼠糞便中提取基因組DNA。以帶有341F 5’-806R 的序列為引物，以細(xì)菌16S rDNA 的V3～V4區(qū)域進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。2%瓊脂糖凝膠中提取擴(kuò)增子，并用 AxyPrep DNA 凝膠提取試劑盒純化，以QuantiFluor?-ST 進(jìn)行檢測定量。純化的PCR 產(chǎn)物通過Illumina 的基因組DNA 文庫制備程序，應(yīng)用合并的DNA 產(chǎn)物建立Illumina Pair-End 文庫。通過Illumina Mi Seq PE300 平臺進(jìn)行高通量測序，獲取細(xì)菌16S rRNA 基因的V3～V4 可變區(qū)堿基序列信息。利用QIIME2.0 軟件包，對測序片段進(jìn)行OTU Venn圖、主成分分析（PCA），獲取OTU 對應(yīng)的分類單元（包括門綱目科屬種）及其相應(yīng)的豐度信息，計算ACE、Chao1、Shannon 等度量指數(shù)并用R（v3.1.1）軟件制作相應(yīng)的稀釋曲線圖，評估樣品中細(xì)菌菌群的豐富度和均勻度。通過與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，對OTU進(jìn)行物種分類，并分別在門、綱、目、科、屬、種幾個分類等級對各樣品作物種豐度柱狀圖[10]。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 芍藥湯對模型大鼠腸黏膜病理形態(tài)的影響

正常組大鼠腸黏膜完整，腺體排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)清晰，無水腫、充血或組織壞死；模型組大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，腺體排列紊亂或丟失，腸黏膜明顯充血、水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤，腸壁大量纖維化，病變侵及黏膜下層、肌層甚至漿膜層，伴見明顯潰瘍及炎性肉芽腫；芍藥湯組、美沙拉嗪組、抗生素組大鼠炎性細(xì)胞浸潤減少，腸黏膜上皮細(xì)胞完整性改善，結(jié)腸黏膜損傷減輕，表現(xiàn)為腸黏膜輕度充血、水腫，腺體排列基本完整，少量炎性細(xì)胞浸潤，未見明顯凹陷性潰瘍及炎性肉芽腫出現(xiàn)。結(jié)果見圖1。

4.2 芍藥湯對模型大鼠血清白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α 的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α 含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，芍藥湯組、美沙拉嗪組、抗生素組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α 含量不同程度下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05），給藥組間比較差異不明顯。結(jié)果見圖2。

圖1 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織形態(tài)（HE 染色，×100）

圖2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（）

4.3 芍藥湯對模型大鼠腸道菌群整體變化的影響

本研究采用OTU Venn 圖分析各組間菌群OTU數(shù)量及其種類交叉情況，采用PCA 檢測樣本間菌群豐度整體差異。各組總的/特異性O(shè)TU 數(shù)分別為正常組681/24、模型組578/34、抗生素組499/45、芍藥湯組683/16、美沙拉嗪組649/14，各組共檢測OUT 867個，其中共有OUT 為325個，占總OTU 數(shù)的37.49%；與正常組比較，模型組腸道菌群物種豐度降低；與模型組比較，抗生素組腸道菌群物種豐度降低，芍藥湯組、美沙拉嗪組菌群物種豐度升高。各組樣本OTU豐度的PCA 分析結(jié)果顯示，各組間區(qū)分明顯，表明TNBS 造模及藥物干預(yù)等可影響腸道菌群的豐度及結(jié)構(gòu)；與模型組比較，抗生素組向右分散明顯，表明抗生素組菌群結(jié)構(gòu)較模型組變化較大，芍藥湯組、美沙拉嗪組向左聚集，并有向正常組回歸的趨勢，表明芍藥湯、美沙拉嗪可促進(jìn)腸道菌群豐度和結(jié)構(gòu)的恢復(fù)，且芍藥湯組與美沙拉嗪組的菌群結(jié)構(gòu)具有更高的相似性。結(jié)果見圖3、圖4。

4.4 芍藥湯對模型大鼠腸道菌群多樣性的影響

Alpha 多樣性是對單個樣品中物種多樣性的分析[11]，包括ACE、Chao1、Shannon 和Simpson 指數(shù)等。前3 個指數(shù)越大，后1 個指數(shù)越小，表明樣品中的物種越豐富。ACE、Chao1 指數(shù)反映單個樣本中物種的群落豐富度，而Shannon、Simpson 指數(shù)代表微生物多樣性，通過計算各組樣品的Shannon、Simpson指數(shù)制作對應(yīng)的稀釋曲線。與模型組比較，芍藥湯組、美沙拉嗪組ACE、Chao1、Shannon 指數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；抗生素組ACE、Chao1、Shannon 指數(shù)較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；芍藥湯組與美沙拉嗪比較無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，芍藥湯組、美沙拉嗪組Simpson 指數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；抗生素組Simpson 指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。以上結(jié)果表明，與模型組比較，抗生素組腸道菌群多樣性降低，美沙拉嗪組、芍藥湯組腸道菌群多樣性均增加，其中芍藥湯組、美沙拉嗪組菌群多樣性趨近正常組。結(jié)果見表1、圖5、圖6。

圖3 各組大鼠腸道菌群OTU 分析

圖4 各組大鼠腸道菌群PCA

表1 各組大鼠腸道菌群Alpha 多樣性比較（）

表1 各組大鼠腸道菌群Alpha 多樣性比較（）

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

圖5 各組大鼠腸道菌群Shannon 指數(shù)稀釋曲線

圖6 各組大鼠腸道菌群Simpson 指數(shù)稀釋曲線

4.5 芍藥湯對模型大鼠腸道菌群物種注釋和差異分析的影響

根據(jù)OTU 的絕對豐度和注釋信息，統(tǒng)計分析每個樣本中門和屬水平的序列數(shù)與序列總數(shù)的比率，以評估每個組在門和屬水平的物種組成差異。門分類水平主要檢測出13 個菌門，其中占比較多的菌門主要是擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）。與正常組比較，模型組厚壁菌門和變形菌門豐度減少，擬桿菌門豐度增加；與模型組比較，抗生素組擬桿菌門、厚壁菌門等菌門豐度明顯減少，變形菌門豐度增加，芍藥湯組和美沙拉嗪組較模型組厚壁菌門和變形菌門豐度增加，擬桿菌門豐度減少。屬分類水平物種分析結(jié)果表明，與正常組比較，模型組擬桿菌屬（Bacterides）豐度增加，梭菌屬（Clostridium）、顫螺旋菌屬（Oscillospira）、乳酸菌屬（Lactobacillus）、普雷沃菌屬（Prevotella ）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、帕拉普氏菌屬（Paraprevotella）、羅斯氏菌屬（Roseburia）豐度減少少；與模型組及及正常組比較較，抗生素組組菌群變化較大大，菌群種類明顯減少，主要含有乳酸菌屬、擬桿菌屬、薩特氏菌屬（Sutterella）、勞特氏菌屬（Blautia）、埃希氏菌屬（Escherichia）等；芍藥湯組和美沙拉嗪組較模型組擬桿菌屬豐度減少，梭菌屬、顫螺旋菌屬、乳酸菌屬、普雷沃菌屬、瘤胃球菌屬、帕拉普氏菌屬、羅斯氏菌屬豐度增加。見圖7、圖8。

圖7 各組大鼠腸道菌群門分類水平物種柱狀圖

圖8 各組大鼠腸道菌群屬分類水平物種柱狀圖

5 討論

中醫(yī)藥治療UC 具有多組分、多靶點的特點，因而療效較好，且具有復(fù)發(fā)率低、不良反應(yīng)少等優(yōu)點。芍藥湯具有調(diào)氣活血、清熱利濕功效，為治療濕熱痢疾之主方，《潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)診療專家共識》將芍藥湯認(rèn)定為治療大腸濕熱證UC 的主方[5]。

UC 是一種復(fù)發(fā)性炎性疾病，其特征在于免疫反應(yīng)失調(diào)和細(xì)胞因子釋放失衡。在UC 發(fā)病機(jī)制中，腸道黏膜免疫系統(tǒng)失衡，主要表現(xiàn)為促炎因子和抗炎因子水平不平衡[12]。因此，對炎性介質(zhì)的有利調(diào)節(jié)可為UC 提供可行的治療策略。本實驗中，TNBS 造模引起大鼠結(jié)腸病理性損傷，血清炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α 水平明顯升高，與模型組比較，芍藥湯可有效抑制IL-6、IL-1β、TNF-α 失控釋放，表明其改善UC作用可能與調(diào)節(jié)炎癥因子密切相關(guān)。

腸道菌群組成的變化可能影響腸道微生態(tài)，進(jìn)而影響免疫和代謝功能，并導(dǎo)致多種自身免疫和腸道疾病[13]。腸道菌群在UC 發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。腸道菌群失調(diào)的嚴(yán)重程度直接影響炎癥的進(jìn)展速度[14]。本實驗中，Venn 圖、Alpha 多樣性分析等結(jié)果顯示，TNBS 造模引起的腸道炎癥使腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，腸道菌群紊亂是引起腸黏膜炎癥的重要原因，而給藥后菌群結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，表明芍藥湯可能通過恢復(fù)腸道菌群的豐度、多樣性從而減輕腸道炎癥。腸道菌群物種注釋和差異分析結(jié)果表明，模型組和芍藥湯組之間腸道菌群的門和屬分類有顯著差異，表明芍藥湯可改善UC 結(jié)腸中菌群的多樣性和菌群紊亂，且TNBS 誘導(dǎo)的UC 大鼠中致病菌顯著增加，而保護(hù)性細(xì)菌（如厚壁菌門、梭菌屬、顫螺旋菌屬等）明顯減少，芍藥湯可增加厚壁菌門、顫螺旋菌屬、乳酸菌屬、普雷沃菌屬、瘤胃球菌屬、帕拉普氏菌屬、羅斯氏菌屬等益生菌或正常菌的相對含量，表明芍藥湯可提高腸道菌群多樣性，促進(jìn)益生菌和共生菌群的生長，抑制機(jī)會性致病菌或有害菌的定植，這有助于維持腸道菌群的穩(wěn)態(tài)。通過對腸道菌群、炎癥因子、腸道炎癥進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，隨著UC 腸道炎癥的發(fā)展，促炎因子分泌增加，損害性細(xì)菌增多，保護(hù)性細(xì)菌減少，腸道炎癥加劇，厚壁菌門、乳酸菌屬、瘤胃球菌屬、羅斯氏菌屬等保護(hù)性細(xì)菌與IL-6、TNF-α、IL-1β 等促炎因子之間存在顯著負(fù)相關(guān)，擬桿菌等損害性菌與促炎因子間呈正相關(guān)，而芍藥湯可有效逆轉(zhuǎn)促炎因子及腸道菌群的這種變化趨勢。

綜上所述，腸道菌群與體內(nèi)細(xì)胞因子的分泌和表達(dá)密切相關(guān)，彼此相互影響，調(diào)節(jié)免疫功能。芍藥湯對UC 有確切的治療作用，并且可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群的豐度和多樣性影響腸道菌群，進(jìn)而起到減輕腸道炎癥和治療UC 的作用。