何海濤，王智翔，張小弟，沈乃營，張 毅

(1.西安醫(yī)學(xué)院,陜西 西安710068；2.西安醫(yī)學(xué)院附屬陜西省核工業(yè)二一五醫(yī)院普外科,陜西 咸陽 712000)

原發(fā)性肝癌在我國原發(fā)性腫瘤致死病因中占第2位，其中肝細(xì)胞癌 (Hepatocellular carcinoma， HCC)是其主要病理類型，約占85%～90%[1],HCC的發(fā)生與病毒性肝炎感染密切相關(guān)[2]。由于HCC發(fā)病早期常無明顯癥狀，導(dǎo)致容易出現(xiàn)診斷和治療的延誤，加之肝癌切除術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率高，導(dǎo)致HCC患者遠(yuǎn)期生存率較差。目前有研究證實(shí)，HCC的發(fā)病機(jī)制與腫瘤的微環(huán)境以及某些信號通路的異常激活等多種因素相關(guān)，其中包括炎癥相互作用中的趨化因子和趨化因子受體[3]，而趨化因子配體及其受體之間相互作用可招募不同的免疫細(xì)胞亞群至腫瘤微環(huán)境中(Tumor microenvironment,TME)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、血管新生，調(diào)控宿主對腫瘤的免疫應(yīng)答、侵襲性及其新陳代謝產(chǎn)物，最終對腫瘤進(jìn)展和預(yù)后均產(chǎn)生顯著影響[4-5]。趨化因子配體13(Chemokine ligand 13,CXCL13)屬CXC趨化因子亞族，其與其特異性受體CXC趨化因子亞族趨受體5(C-X-C chemokine receptor type 5,CXCR5)結(jié)合，與多種惡性腫瘤(如胃癌、結(jié)直腸癌、腎癌、前列腺癌等)的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6-9]。本文利用免疫組織化學(xué)方法檢測肝細(xì)胞癌組織和相應(yīng)癌旁組織中CXCL13的表達(dá)情況，旨在明確其陽性表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者臨床病理特征、預(yù)后及術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)性，為HCC的診斷和治療提供新依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 組織標(biāo)本收集普外科2012年6月至2014年6月行肝癌切除術(shù)且經(jīng)病理證實(shí)的肝細(xì)胞癌組織標(biāo)本及相應(yīng)癌旁組織111例 ，所有患者術(shù)前均未接受任何形式的治療。111例HCC患者中，男 96例，女15例，年齡26～74歲，平均(50.31±10.92)歲。根據(jù)肝癌病理Edmondson-Steiner 四級分級法：Ⅰ、Ⅱ級64例，Ⅲ、Ⅳ級47例。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會惡性腫瘤分期(TNM)：Ⅰ、Ⅱ期41例 ，Ⅲ、Ⅳ期70例。術(shù)后隨訪采用電話、門診復(fù)查及住院治療方式，以手術(shù)日期為開始時(shí)間，截止時(shí)間為2019年6月30日，所有隨訪患者中位總生存時(shí)間為23月，死亡67例，失訪18例。

1.2 主要試劑 即用型免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購自福建邁新生物科技公司；兔抗人CXCL13多克隆抗體購自英國Abcam公司。

1.3 免疫組化學(xué)檢測肝癌組織和癌旁組織CXCL13表達(dá) 取病理科保存的術(shù)后石蠟包埋組織切片標(biāo)本，采用Elivison兩步免疫組化法檢測HCC組織及相應(yīng)的癌旁組織中的CXCL13表達(dá)。所有操作步驟均嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。結(jié)果判定：免疫組化染色結(jié)果由4名病理科醫(yī)師采用雙盲原則評定。每張切片選取5個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行觀察。其中染色強(qiáng)度評分：0分為無染色；1分為黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。陽性細(xì)胞占比：0 分，<5% ；1分，5%～25%；2分，25%～50%；3分， 50%～75%；4分，>75%。染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞占比計(jì)分之和為該病例評分值，≤2分為陰性；≥3分為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，采用卡方檢驗(yàn)比較CXCL13在HCC組織和相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況，評估HCC組織中CXCL13表達(dá)與各臨床病理數(shù)據(jù)之間的關(guān)系。生存分析采用 Kaplan-Meier生存曲線，單因素分析用 Log-Rank檢驗(yàn)，多因素分析用 Cox回歸模型，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CXCL13在HCC組織及癌旁組織中表達(dá)情況 免疫組化結(jié)果顯示CXCL13在HCC癌組織和癌旁組織的胞漿中均有表達(dá)(圖1)，其中癌組織中陽性表達(dá)為62.16%(69/111)，相應(yīng)癌旁組織中陽性表達(dá)為30.63%(34/111)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 CXCL13在癌組織及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況(例)

注：A、B分別為癌組織和癌旁組織陽性表達(dá)，C為正常肝組織(陰性)

2.2 HCC患者CXCL13表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 見表2。CXCL13在有血管浸潤組織中的陽性表達(dá)率明顯高于無血管浸潤組織，在TNM分期中Ⅲ+Ⅳ期的陽性表達(dá)率明顯高于Ⅰ+Ⅱ期的陽性表達(dá)率(均P<0.05)；癌組織中的CXCL13陽性表達(dá)在HCC患者的不同年齡、性別、甲胎蛋白(AFP)值、腫瘤最大直徑、分化程度中差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

表2 HCC患者CXCL13表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.3 HCC組織CXCL13表達(dá)與肝癌預(yù)后的關(guān)系 見表3。結(jié)合肝癌患者臨床病例資料，采用單因素分析結(jié)果顯示：甲胎蛋白、血管浸潤、TNM分期、癌組織CXCL13表達(dá)是肝細(xì)胞癌的預(yù)后相關(guān)因素(均P<0.05)；多因素回歸分析表明：甲胎蛋白、癌組織CXCL13表達(dá)是肝癌患者獨(dú)立預(yù)后相關(guān)因素。年齡、性別、有無HBV感染、有無肝硬化、腫瘤最大直徑、分化程度、腫瘤數(shù)目對患者預(yù)后無影響(均P>0.05)。

表3 HCC患者預(yù)后單因素與多因素COX回歸模型分析

2.4 HCC組織CXCL13表達(dá)情況與患者術(shù)后無復(fù)發(fā)生存率和預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示：HCC組織中CXCL13表達(dá)陰性患者1、3、5年累積生存率分別為86.1%、62.0%、49.1%，總生存時(shí)間為(36.95±2.59)月，而CXCL13表達(dá)陽性患者1、3、5年累積生存率分別為62.5%、12.8%、0，總生存時(shí)間為(23.00±3.23)月；CXCL13表達(dá)陰性患者1、3、5年無復(fù)發(fā)生存率分別為91.1%、67.1%、44.9%，總生存時(shí)間為(30.98±3.01)月，而CXCL13表達(dá)陽性患者1、3、5年無復(fù)發(fā)生存率分別為62.5%、11.4%、0，總生存時(shí)間為(15.52±3.33)月。CXCL13陰性表達(dá)組總生存時(shí)間和無復(fù)發(fā)生存時(shí)間優(yōu)于陽性表達(dá)組(P=0.0023、0.0085)(圖2)。

圖2 CXCL13表達(dá)與HCC患者術(shù)后無復(fù)發(fā)生存率和預(yù)后的關(guān)系

3 討 論

肝細(xì)胞癌是我國常見惡性腫瘤之一，目前主要借助檢測血清AFP等指標(biāo)結(jié)合影像學(xué)檢查對高危人群進(jìn)行篩查。確診患者以外科治療為主，同時(shí)腫瘤局部消融、經(jīng)導(dǎo)管動脈化療栓塞術(shù)、放射治療、全身化療等多種手段也取得了較好的療效。但HCC發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，具有術(shù)后易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移的特性，且臨床中部分患者肝硬化進(jìn)展到較為嚴(yán)重階段，限制了治療手段實(shí)施，HCC總體治療效果并不十分理想[10]。近年來趨化因子及其受體與肝癌關(guān)系的研究廣受關(guān)注。

趨化因子配體通過與其G蛋白耦聯(lián)受體(G-protein coupled receptor，GPCR) 相結(jié)合形成趨化因子配體/受體軸，從而影響下游的信號分子，在炎癥、感染、免疫反應(yīng)以及腫瘤微環(huán)境中起重要的調(diào)控作用[11]。CXCL13是CXC趨化因子家族成員之一，主要分布在肝臟、脾臟、淋巴結(jié)、闌尾、胃以及乳腺等處。一般認(rèn)為CXCR5是CXCL13的唯一受體，CXCL13與其受體CXCR5結(jié)合形成CXCL13/CXCR5軸，許多實(shí)體腫瘤可利用CXCL13/CXCR5信號作為中心軸，整合多種細(xì)胞內(nèi)信號事件和細(xì)胞間的相互作用，從而獲得侵襲生長和轉(zhuǎn)移能力。腫瘤基質(zhì)細(xì)胞分泌的CXCL13誘導(dǎo)上皮腫瘤細(xì)胞表達(dá)CXCR5可趨化CXCR5+的上皮腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)腫瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換，同時(shí)CXCR5上調(diào)的腫瘤細(xì)胞可向局部淋巴結(jié)趨化，實(shí)現(xiàn)腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[12-13]。Chunyan等[14]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌患者組織中和血清中CXCL13水平增高，可誘導(dǎo)分泌細(xì)胞因子IL-12和IL-17及Ig G4而影響腫瘤的微環(huán)境，并與Wnt/β-catenin信號通路正反饋相互調(diào)控表達(dá)而促進(jìn)HCC的進(jìn)展。Duan等[15]在HBV相關(guān)性肝細(xì)胞癌研究發(fā)現(xiàn)HCC患者血清CXCL13水平升高，且免疫組化染色顯示CXCL13/CXCR5在低分化腫瘤中百分率高于高分化腫瘤，CXCL13升高與無復(fù)發(fā)生存率有關(guān)，與總生存率無關(guān)。曾灝等[16]在HCC患者病例對照研究中發(fā)現(xiàn)，HCC患者血清CXCL13水平明顯高于健康對照組，而CXCL13表達(dá)水平與HBV無關(guān)；HCC患者血清IL-31水平和健康對照組中無差異；此外還有研究表明，聯(lián)合檢測血清CXCL13與AFP可提高HCC診斷的敏感度。同時(shí)也有研究表明CXCL13水平增高會增加腫瘤對化療藥物的耐藥性，從而為我們制定個(gè)性化治療方案提供了思路[17]。值得一提的是，關(guān)于CXCL13在乳腺腫瘤和大腸腫瘤表達(dá)水平增高研究模型中有不同的研究結(jié)果。 Alcaraz-Sanabria等[18]研究發(fā)現(xiàn)CXCL13的表達(dá)水平與Basal-like型乳腺癌浸潤免疫細(xì)胞(樹突狀細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞)的表達(dá)呈正相關(guān)，而這些細(xì)胞參與了抗腫瘤免疫效應(yīng)的激活。Evangelia等[19]在早期乳腺癌研究中發(fā)現(xiàn)CXCL13在Luminal-HER2陽性乳腺癌患者中高表達(dá)可明顯改善預(yù)后，考慮與CXCL13作為B淋巴細(xì)胞趨化因子在介導(dǎo)宿主對腫瘤的免疫反應(yīng)中起作用有關(guān)。Xing等[20]在結(jié)直腸癌研究中發(fā)現(xiàn)CXCR5+CD8+T細(xì)胞亞群可能具有潛在的抗腫瘤活性；有文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)直腸癌的腫瘤微環(huán)境中B細(xì)胞和濾泡輔助性T細(xì)胞數(shù)量隨腫瘤分期增加而增加，數(shù)量越多預(yù)后越好；而CXCL13缺失或低表達(dá)患者TME中B細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞、Th1細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞密度較低，預(yù)后較差[21]。這些不同的研究結(jié)果可能與腫瘤的分化和分期、治療情況、基因等因素相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，HCC組織中CXCL13的陽性表達(dá)與血管浸潤和TNM分期相關(guān)，主要是由于有研究發(fā)現(xiàn)，隨著肝癌進(jìn)展，CXCL13在肝癌組織中的mRNA水平及患者外周血中的表達(dá)水平明顯增加，即隨著肝癌臨床分期的進(jìn)展，會出現(xiàn)腫瘤體積增大及血管侵襲，甚至出現(xiàn)淋巴結(jié)的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致CXCL13水平增加，增加了其陽性表達(dá)[16]；甲胎蛋白、血管浸潤、TNM分期、癌組織CXCL13表達(dá)是肝細(xì)胞癌的預(yù)后相關(guān)因素，表明隨著肝癌病情進(jìn)展，甲胎蛋白、血管浸潤水平、TNM分期、CXCL13水平會不斷增加，其會顯著影響肝癌患者預(yù)后；多因素回歸分析表明癌組織CXCL13表是肝細(xì)胞癌患者獨(dú)立預(yù)后因素。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果表明， CXCL13陽性表達(dá)組總生存時(shí)間和無復(fù)發(fā)生存時(shí)間比陰性表達(dá)組短，CXCL13陽性表達(dá)提示預(yù)后不良，可能是由于CXCL13與患者的ALT、AST水平呈正相關(guān)，而以上指標(biāo)是衡量肝功能的重要指標(biāo)，其可提示患者肝臟的損傷程度，因此若患者的CXCL13水平的增加，患者的肝臟損傷程度越大，導(dǎo)致預(yù)后較差[22]；同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，CXCL13在體外模擬HCC細(xì)胞環(huán)境下，其可抑制IL-12分泌，促進(jìn)IL-17的分泌，而IL-12可誘導(dǎo)天然T細(xì)胞或NK細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素，促進(jìn)Th細(xì)胞的分化，從而增強(qiáng)細(xì)胞免疫，激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞，產(chǎn)生抑制血管形成作用，具有抗腫瘤作用；IL-17可促進(jìn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞免疫應(yīng)答來抑制腫瘤生長，同時(shí)其可通過促進(jìn)血管生成及腫瘤細(xì)胞遷移來促進(jìn)腫瘤生長，因此隨著CXCL13水平增加，會促進(jìn)腫瘤生長，不利于患者治療預(yù)后[19]。

綜上，趨化因子CXCL13在肝細(xì)胞癌組織中陽性表達(dá)與HCC的術(shù)后復(fù)發(fā)和預(yù)后密切相關(guān)。因此我們可以推斷CXCL13可能是監(jiān)測HCC發(fā)展和預(yù)后的潛在標(biāo)志物之一，可能為肝細(xì)胞癌患者的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。