李長(zhǎng)超，柴艷梅，劉 丹，周 成，陳 蓉，黃文峰

(1.荊門(mén)市第二人民醫(yī)院，湖北 荊門(mén) 448000；2.西安市第五醫(yī)院，陜西 西安710082 )

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主的一種慢性自身免疫性疾病，在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率約為1%[1]。研究表明免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子參與RA的發(fā)病過(guò)程，其中輔助性T 細(xì)胞17(T helper cell 17，Th17)在RA發(fā)病中起重要作用[2-3]。研究[4]發(fā)現(xiàn)，Th2細(xì)胞具有抑制Th17的作用，激活后的CD4+Th2細(xì)胞可生成白細(xì)胞介素-13(Interleukin-13，IL-13),不僅具有免疫刺激功能,上調(diào)CD28配體和CD80的表達(dá)，還有重要的抗炎功能,下調(diào)腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、IL-6及IL-1β等促炎細(xì)胞因子的生成。目前關(guān)于IL-13在RA發(fā)病中的具體作用和相關(guān)分子機(jī)制仍不明確，本研究通過(guò)分析IL-13與RA患者病情的相關(guān)性，觀察IL-13對(duì)Th17細(xì)胞亞群分化的影響，探討其在RA免疫調(diào)控中的可能機(jī)制，為IL-13相關(guān)生物制劑的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018年1月至2019年6月就診的RA患者60例，根據(jù)RA 28個(gè)疾病活動(dòng)性評(píng)分(DAS28)分為活動(dòng)組(DAS28評(píng)分≥2.8，n=30)和穩(wěn)定組(DAS28評(píng)分<2.8，n=30)。另選體檢中心健康志愿者30例作為正常組。RA診斷符合2010 年 ACR 與歐洲風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(EULAR)聯(lián)合修訂的 RA 分類標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：有嚴(yán)重心肺功能異常；骨髓造血障礙疾病、胃十二指腸潰瘍活動(dòng)期；正處于妊娠期或哺乳期婦女；過(guò)敏體質(zhì)及患有精神疾病等患者?；顒?dòng)組男11例，女19例，平均年齡為(45.0±10.3)歲；穩(wěn)定組男10例，女20例，平均年齡為(43.7±10.6)歲；正常組男10例，女20例，平均年齡為(44.6±10.9)歲。三組在年齡、性別方面比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

1.2 儀器與試劑 人IL-13 ELISA試劑盒、人IL-17A ELISA試劑盒、淋巴細(xì)胞分離液(愛(ài)必信生物科技有限公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，重組人白細(xì)胞介素13(rhIL-13)(美國(guó)R&D公司)，抗人CD3和抗人CD28(美國(guó)BioLegend公司)，Easy Sep人CD4+T 細(xì)胞磁珠分選盒(加拿大STEMCELL Technologies公司)，磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffer saline，PBS) 、Trizol試劑[寶生物工程(大連)有限公司]。使用的儀器包括全自動(dòng)定量酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、全自動(dòng)熒光定量PCR擴(kuò)增儀。

1.3 研究方法

1.3.1 血清IL-13檢測(cè)：所有研究對(duì)象取晨起空腹全血3 ml,3000 r/min離心10 min分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)RA患者及正常組血清IL-13表達(dá)水平，并將RA患者與疾病活動(dòng)度評(píng)分、紅細(xì)胞沉降率(ESR)及C反應(yīng)蛋白(CRP)進(jìn)行相關(guān)性分析。ESR采用魏氏法檢測(cè)，CRP為免疫比濁法檢測(cè)。

1.3.2 人CD4+T細(xì)胞體外磁珠分選：RA活動(dòng)期患者4例和正常組4例，取肝素抗凝外周血約20 ml，按常規(guī)方法[3]分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。使用Easy Sep人CD4+T細(xì)胞分離試劑盒，從上述獲得的PBMC中純化CD4+T的細(xì)胞。分離過(guò)程嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.3 IL-13分組干預(yù)：分為IL-13干預(yù)組和對(duì)照組。IL-13干預(yù)組：在純化RA患者的CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)基中加入rhIL-13(100 ng/ml)，用抗CD3(5 μg/ml)和抗CD28(2 μg/ml)進(jìn)行目標(biāo)細(xì)胞刺激。對(duì)照組：純化健康體檢者CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)基中加入等量的PBS。48 h后收集上清液，通過(guò)ELISA檢測(cè)上清中IL-17A表達(dá)水平；Trizol法提取細(xì)胞RNA并反轉(zhuǎn)cDNA,RT-PCR法檢測(cè)IL-17A mRNA的表達(dá)水平。引物序列：人IL-17A上游引物，5’-AGATTACTACAACCGATCCACCT-3’；人IL-17A下游引物，5’-GGGGACAGAGTTCATGTGGTA-3’；人β-actin上游引物，5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTCC-3’；人β-actin下游引物，5’-GTAGTTTCGTGGATGCCACAGG-3’。

2 結(jié) 果

2.1 三組血清IL-13表達(dá)水平比較 活動(dòng)組血清IL-13表達(dá)水平為(166.4±21.4)pg/ml，穩(wěn)定組和正常組分別為(123.4±12.3)pg/ml和(86.2±11.0)pg/ml。RA患者血清IL-13水平高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0002)，且RA活動(dòng)組IL-13水平明顯高于穩(wěn)定組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0008)。

2.2 血清IL-13與RA疾病活動(dòng)指標(biāo)相關(guān)性分析 RA患者血清IL-13與DAS28評(píng)分具有正相關(guān)性(r=0.583，P<0.001)；IL-13與ESR具有正相關(guān)性(r=0.217，P<0.001)；IL-13與CRP具有正相關(guān)性(r=0.477，P<0.001)。見(jiàn)圖1。

圖1 RA患者血清IL-13與DAS28、ESR和CRP的相關(guān)性

2.3 IL-13對(duì)Th17細(xì)胞分化的影響 收集上清液應(yīng)用ELISA法檢測(cè)IL-17A水平，RA組IL-17A水平顯著高于對(duì)照組；IL-13干預(yù)后，RA患者CD4+T細(xì)胞IL-17A水平顯著降低。這些結(jié)果提示RA患者外周血CD4+T細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例更高，且IL-13能夠顯著抑制CD4+T細(xì)胞向Th17方向分化。見(jiàn)圖2。

注：與RA組比較，**P<0.01，***P<0.001

2.4 RT-PCR法檢測(cè)各干預(yù)組CD4+T細(xì)胞IL-17A mRNA表達(dá)水平 結(jié)果顯示，與RA組相比，加入rhIL-13后RA患者的IL-17A mRNA表達(dá)量減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01)，對(duì)照組與對(duì)應(yīng)的加入rhIL-13干預(yù)組比較兩組細(xì)胞中IL-17A mRNA表達(dá)水平比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.39)。見(jiàn)圖3。

注：與RA組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討 論

RA是一種慢性、進(jìn)行性、侵蝕性疾病，其病理組織可見(jiàn)淋巴細(xì)胞活化增殖和炎癥細(xì)胞因子大量釋放，導(dǎo)致滑膜增殖、軟骨及骨組織侵襲破壞等病理?yè)p害[5]。研究顯示，Th1，Th2和Th17細(xì)胞的比例失衡與RA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可直接參與RA的發(fā)病，促進(jìn)炎癥進(jìn)展[3,6-7]。目前研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子水平和與RA發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，對(duì)明確開(kāi)發(fā)靶向治療RA藥物有指導(dǎo)意義[8-9]。IL-13主要由活化的Th2細(xì)胞生成，對(duì)單核巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞等均有較強(qiáng)的生物學(xué)活性。Yanpin等[10]發(fā)現(xiàn)IL-13可減低小鼠膠原關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率及嚴(yán)重程度，減輕關(guān)節(jié)的損傷。IL-13作為一種具有抗炎作用的細(xì)胞因子，可能在RA的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抑制病情進(jìn)展的作用。IL-13同時(shí)也具有重要的免疫調(diào)節(jié)活性，不僅在變應(yīng)性疾病、寄生蟲(chóng)感染性疾病中發(fā)揮作用，也在自身免疫系統(tǒng)疾病起到重要作用。另外，IL-13發(fā)揮較強(qiáng)的抗炎活性，能夠加強(qiáng)IL-1R拮抗劑的產(chǎn)生，對(duì)抗IL-1致炎作用，還能有效下調(diào)IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子生成，調(diào)節(jié)各種炎癥的中間產(chǎn)物[11]。T細(xì)胞免疫調(diào)控是RA主要的免疫應(yīng)答，CD4+T分為T(mén)h1，Th2，Th17和Treg細(xì)胞亞群，其中Th17細(xì)胞直接參與RA的發(fā)病，促進(jìn)炎癥進(jìn)展中起主導(dǎo)作用[12-14]。

本研究發(fā)現(xiàn)IL-13在RA患者中表達(dá)水平升高，并與DAS-28、ESR和CRP呈正相關(guān)，說(shuō)明IL-13參與了RA的發(fā)病機(jī)制，并且RA病情的嚴(yán)重程度與IL-13水平升高呈正相關(guān)，IL-13水平高低一定程度反應(yīng)RA患病狀態(tài)。前期也有報(bào)道，IL-25誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞活化和分化中的潛在作用，發(fā)現(xiàn)IL-25顯著抑制RA患者 CD4+T細(xì)胞活化以產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子IL-17A并促進(jìn)IL-4分泌，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，IL-25明顯抑制了RA患者 CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞的分化。在RA中，IL-25抑制CD4+T細(xì)胞活化和分化為T(mén)h17細(xì)胞，而不會(huì)影響Th1細(xì)胞，重要的是IL-13對(duì)于IL-25介導(dǎo)的膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)濕小鼠模型(CIA)發(fā)病進(jìn)程的抑制是必需的。其中，RA或CIA CD4+細(xì)胞阻斷IL-13的分泌，CD4+T細(xì)胞顯著減弱了IL-25在Th17免疫應(yīng)答中的抑制作用[15]。我們的研究旨在發(fā)現(xiàn)IL-13誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞活化和分化中的潛在作用，發(fā)現(xiàn)IL-13活化RA患者 CD4+T細(xì)胞以產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子IL-17A。

我們分離純化健康成人對(duì)照組和RA患者外周血CD4+T細(xì)胞，然后用IL-13進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，RA組IL-17A水平顯著高于對(duì)照組，提示RA患者外周血CD4+T細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例更高，且IL-13能夠顯著抑制CD4+T細(xì)胞向Th17方向分化。通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)IL-13干預(yù)后各組CD4+T細(xì)胞IL-17A mRNA表達(dá)水平，再次驗(yàn)證了IL-13能夠顯著抑制RA患者外周CD4+T細(xì)胞IL-17A的表達(dá)，即抑制向Th17方向分化。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)IL-13參與RA免疫反應(yīng)，并具有抑制Th17分化作用，對(duì)IL-13的檢測(cè)有助于了解RA患者的免疫狀態(tài)，為疾病進(jìn)展及免疫治療提供一定臨床依據(jù)。隨著對(duì)IL-13不斷深入研究，IL-13可能成為優(yōu)化RA治療方案的新靶點(diǎn)。